Câu 3: Trình bày các phương pháp tạo plasmid tái tổ hợp và các phương pháp biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ?

Phương pháp tạo ADN- plasmid tái tổ hợp: là phương pháp gắn các đoạn ADN hay các đoạn cADN vào vector chuyển gen để tạo nên plasmid có mang ADN lạ gọi là plasmid tái tổ hợp.

Phương pháp dùng đầu cố kết:(đầu được tạo ra bởi 1 loại RE).

1.       Mở vòng plasmid bằng RE tạo nên plasmid mở vòng với 2 đầu cố kết.

2.       cắt phân tử ADN lạ với cùng 1 loại RE mở vòng plasmid sẽ tạo ra đoạn ADN có đầu cố kết.

3.       trộn plasmid đã mở vòng với ADN lạ: các đầu cố kết bắt cặp với nhau dưới tác dụng của E. Ligase hàn dính lại → plasmid tái tổ hợp.

Dùng các đoạn nối linkers. (do ADN lạ và plasmid không có các điểm nhận biết).

đoạn nối là phân tử olygonucleotit ngắn (ADN hay ARN có 10→20nucleotit)ở giữa có trình tự nhận biết đặc hiệu với 1 RE.

1.       Dùng RE để mở rộng vòng plasmid→plasmid có 2 đầu cố kết.

2.       Dùng RE giống RE mở vòng plasmid để cắt đoạn nối linkers.

3.       Trộn đoạn nối đã cắt với ADN lạ để các đoạn nối được gắn vào 2 đầu → ADN lạ có 2đầu cố kết.

4.       Sau đó trộn ADN lạ có đầu cố kết với plasmid đã mở vòng. Các đầu cố kết sẽ bắt cặp bổ sung, dưới tác dụng của E. ligase→ plasmid tái tổ hợp. Pp này thường gắn đoạn cADN hay ADN.

Dùng E. Terminal transferase.: pp này dựa vào khả năng đặc biệt của E. Terminal tranferase có thể gắn cùng 1 loại nu thành chuỗi vào đầu 3’OH của mạch ADN. Nu cùng loại là 1 trong 4loại(ATGX).

Mô phỏng: trên ADN lạ:        5’                                                    3’  G-G-G-...

                                   ...G-G  3’                                                    5’  X-X-X-

Thì trên plasmid có đoạn nu tương ứng bổ sung với ADN lạ.

1.       Dưới tác dụng của E terminal tranferase. Phân tử ADN lạ được gắn vào đầu 3’ 1 loại dADN.

2.       Trên plasmid mở vòng cũng được E gắn 1 chuỗi gồm 1 loại nu bổ sung với chuỗi nu được gắn trên ADN. (do khi nắp 2 đoạn ADN lạ & plasmid thì đầu 3 sẽ nối với đầu 5).

3.       Trộn plasmid và ADN lạ với nhau các đầu mut có chuỗi nu bổ sung sẽ bắt cặp với nhau→ADN lạ có thể gắn vào plasmid.

Các phương pháp biến nạp ADN vào tế bào chủ.

Hoá biến nạp:

ADN tái tổ hợp được ủ với số lượng lớn tế bào vk chưa có plasmid có khả năng dung nạp.

xử lý CaCl2  lạnh kèm sốc nhiệt (42°C trong 2’)

Hiệu quả các thể biến nạp cao: 105→106 thể biến nạp/1mg ADN.

Điện biến nạp:

Sử dụng dòng điện cao thế cục bộ theo xung làm cho tế bào hấp thụ ADN.

Hiệu quả cao có thể đến 109- 1010/1mg ADN.

Tuy nhiên tỉ lệ chết đáng kể.

Vi tiêm:

Dùng pipet đã cố định để giữ trứng đã thụ tinh (hợp tử) sau đó dùng kim vi tiêm= thuỷ tinh để tiêm ADN ngoại lai vào hợp tử.

Bắn ADN vào tế bào:

Các hạt kim loại tungsten hay hạt vàng mang ADN or ARN, được bắn với tốc độ nhanh và xuyên thủng vách tế bào để đưa ADN or ARN vào trong bằng súng bắn ADN.

Pp này có nhiều ưu thế & được dùng nhiều trong tạo các TV nhiễm gen.