Về mặt lý thuyết, kỹ thuật DNA tái tổ hợp cho phép đưa bất kỳ một gen nào đó từ một sinh vật này vào một sinh vật khác. Vấn đề quan trọng là làm sao để gen ngoại lai có thể biểu hiện trong cơ thể vật chủ.

Để biểu hiện tất cả các gen ngoại lai trong E. coli phải bắt đầu bằng việc gắn đoạn gen ngoại lai vào trong vector biểu hiện (thường là plasmid). Các vector biểu hiện là vector có thể mang các gen ngoại lai mong muốn cho phép thực hiện sự phiên mã của các bản sao được tạo dòng và sự dịch mã các mRNA của chúng trong E. coli. Vector này phải có đủ các cấu trúc cần thiết sau:

- Các trình tự mã hóa gen chỉ thị (marker) để đảm bảo duy trì vector trong tế bào.

- Một promoter kiểm soát phiên mã (ví dụ: lac, trp hoặc tac) cho phép sản xuất một lượng lớn mRNA từ các gen được tạo dòng.

- Các trình tự kiểm soát dịch mã như vùng liên kết ribosome được bố trí thích hợp và codon khởi đầu AUG.

- Một polylinker để đưa gen ngoại lai vào trong một hướng chính xác với promoter.

Chỉ khi được cấu trúc đầy đủ như thế, các vector biểu hiện mang gen ngoại lai mới được biến nạp vào chủng E. coli thích hợp. Nếu đoạn gen ngoại lai không nằm giữa promoter và vị trí kết thúc phiên mã, thì nó sẽ không được phiên mã.

1. Các protein nguyên thể tái tổ hợp

Các protein nguyên thể (native protein) có thể được sản xuất trong E. coli bằng cách sử dụng promoter mạnh và một vùng liên kết ribosome (ribosome binding sites-RBS) hiệu quả. Để biểu hiện gen prokaryote có RBS mạnh chỉ cần cung cấp một promoter là đủ. Trong khi đó, để biểu hiện một gen eukaryote (hoặc một gen prokaryote với một RBS yếu) cần phải cung cấp cả promoter lẫn RBS.

1.1. Biểu hiện của gen prokaryote-Promoter

Bước đầu tiên khi biểu hiện các protein của eukaryote trong vi khuẩn là chọn một vector biểu hiện mang promoter mạnh của prokaryote. Các promoter thích hợp nhất cho biểu hiện của gen ngoại lai ở E. coli là những promoter có khả năng điều chỉnh mạnh. Điển hình là promoter (lai) trp-lac.

Promoter trp-lac còn gọi là promoter tac (một dạng promoter lai giữa promoter trp và promoter lac) đã được sử dụng thành công để sản xuất một lượng lớn protein trong E. coli (Hình 9.8). Promoter trp được điều chỉnh bởi gen ức chế trp và có thể được cảm ứng bởi sự bổ sung của 3-indolylacetic acid (3-IAA) vào môi trường hoặc bằng cách thiếu tryptophan. Trong khi đó, promoter lac được điều chỉnh bởi gen ức chế lac và vì thế có thể được cảm ứng nhờ bổ sung nhân tố cảm ứng isopropyl--D-thiogalactoside (IPTG) vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn. Cuối cùng, promoter (lai) trp-lac mang đoạn trp-35 được gắn với đoạn lac-10 và operator lac được điều chỉnh bởi gen ức chế lac (lac repressor).

1.2. Biểu hiện của gen eukaryote-Promoter và vùng liên kết ribosome

Để có mức độ biểu hiện cao của gen ngoại lai trong E. coli, không những phải sử dụng các promoter mạnh để sản xuất một lượng lớn mRNA mà còn sử dụng các RBS để đảm bảo chắc chắn mRNA được dịch mã một cách có hiệu quả. Trong E. coli, RBS bao gồm một mã khởi đầu AUG và một trình tự nucleotide ngược hướng từ codon khởi đầu. Trình tự này được gọi là chuỗi Shine-Dalgarno (SD) giàu A-G, bổ sung cho đầu 3’ của 16S rRNA của E. coli. Liên kết của ribosome với mRNA được khởi đầu bằng cách bắt cặp giữa chuỗi SD trong mRNA và trình tự ở đầu 3’ của 16S rRNA.

Hiệu suất dịch mã của mRNA chịu sự chi phối của một số yếu tố như sau :

- Mức độ bổ sung giữa chuỗi SD và đầu 3’ của 16S rRNA.

- Không gian và khả năng để chuỗi DNA nằm giữa chuỗi SD và codon AUG.

- Nucleotide theo sau AUG ảnh hưởng sự liên kết ribosome.

Đưa codon ATG vào trong gen được tạo dòng và duy trì RBS của vi khuẩn bằng cách dùng vector pAS1 (Hình 9.9). Vector pAS1 mang promoter PL và RBS của gen cII của bacteriophage , codon khởi đầu ATG được dung hợp trực tiếp với phần mã hóa đầu amino của gen eukaryote muốn biểu hiện. Cách làm này có thể hạn chế việc tối ưu khoảng cách giữa chuỗi SD của vi khuẩn và codon khởi đầu ATG của gen eukaryote để có được sự biểu hiện hiệu quả của gen. Đoạn DNA có gắn promoter và chuỗi SD sau đó được biến nạp vào các chủng E. coli thích hợp. Sàng lọc thể biến nạp để thu các khuẩn lạc có mức độ phiên mã cao.

2. Các protein dung hợp tái tổ hợp

2.1. Protein dung hợp

Protein dung hợp còn gọi là protein lai được mã hóa bởi một gen lai (fusion gene) do sự dung hợp in vitro các đoạn gen khác nhau. Vì vậy, protein dung hợp sẽ mang trình tự amino acid của hai protein khác biệt. Các protein dung hợp được xây dựng cho các mục đích khác nhau. Sự dung hợp gen được thực hiện bằng cách gắn phần mã hóa của gen được tạo dòng ở gần đầu tận cùng 3’ của gen lacZ. Protein dung hợp có những ưu điểm chính sau:

- Protein dung hợp thường được sản xuất với hàm lượng lớn do sự khởi đầu phiên mã và dịch mã được điều khiển bởi các trình tự tiêu chuẩn của E. coli.

- Dung hợp các trình tự ngoại lai với các gen của E. coli thường cho kết quả các sản phẩm ổn định hơn các protein ngoại lai nguyên thể.

2.2. Vector biểu hiện các gen dung hợp với gen lacZ

Một số hệ thống vector được phát triển để biểu hiện các gen dung hợp với gen lacZ, điển hình là các vector họ pUR (Hình 9.10). Chọn vector và vị trí cắt hạn chế thích hợp người ta có thể tiến hành dung hợp cho hầu hết gen được tạo dòng.

2.3. Phát hiện các protein dung hợp

Gắn vector plasmid (ví dụ: pUR) thích hợp với đoạn DNA ngoại lai để tạo ra một sự dung hợp trong khung đọc. Biến nạp các vector này vào E. coli. Kiểm tra các khuẩn lạc riêng biệt mang đoạn DNA ngoại lai mong muốn bằng cách tách chiết DNA của vector plasmid, sau đó cắt bằng enzyme hạn chế thích hợp và điện di kiểm tra trên agarose gel. Sàng lọc các khuẩn lạc sản xuất protein dung hợp.

2.4. Tách chiết các protein dung hợp để sản xuất kháng thể

Protein dung hợp có thể được tách chiết theo một số cách: dùng dịch chiết urea, sắc ký ái lực aminophenylthiogalactoside, điện di sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) hoặc phối hợp giữa các cách này. Kỹ thuật đơn giản nhất là SDS-PAGE, nhuộm gel và phát hiện băng protein mới, sau đó cắt băng này ra khỏi gel, đông khô rồi nghiền thành bột mịn. Bột này sẽ được dùng để tiêm vào thỏ để sản xuất kháng thể.

3. Xác định mức độ biểu hiện của gen được tạo dòng

Nói chung, có ba cách thường được dùng để xác định mức độ biểu hiện protein ngoại lai của gen được tạo dòng:

- Điện di polyacrylamide gel có SDS để xác định protein có kích thước thích hợp được sản xuất ở mức độ cao trong các tế bào mang vector biểu hiện. Thông thường, protein quan tâm có thể quan sát bằng cách nhuộm gel với Coomassie Brilliant Blue hoặc bằng AgNO3. Nếu không thấy có băng protein mới khi dùng các thuốc nhuộm này, thì đánh dấu sự trao đổi chất với 100 µCi của [35S]Met hoặc [35S]Cys trên 1 mL dịch nuôi cấy trong 5 phút. Sau đó, sử dụng kỹ thuật SDS-PAGE hoặc phóng xạ tự ghi có thể phát hiện được protein quan tâm.

- Phân tích Western blot bằng cách dùng các kháng thể liên kết đặc hiệu với protein quan tâm đã được thẩm tích lên màng nitrocellulose sau khi thực hiện điện di SDS-polyacrylamide gel.

- Nếu mức độ biểu hiện thấp thì nên đặt gen lacZ cùng hướng với gen được biểu hiện. Như vậy, nếu sự phiên mã hoặc dịch mã hạn chế biểu hiện thì những thay đổi trong hệ thống biểu hiện có thể được kiểm soát bằng những thay đổi trong hoạt tính của β-galactosidase.

▪ Phân tích Western blot

- Kỹ thuật SDS-PAGE

Là kỹ thuật điện di trên polyacrylamide gel với sự có mặt của SDS cho phép phân tách các phân tử protein có khối lượng khác nhau. SDS có điện tích âm rất lớn và có khả năng liên kết với mạch peptide. Như vậy, số lượng SDS tương tác với protein tỷ lệ với kích thước phân tử protein và điện tích của SDS bám vào có thể làm bất cứ phân tử protein nào cũng chuyển động trong điện trường từ cực âm sang cực dương. Do đó, bằng phương pháp điện di, có thể phân tách riêng biệt các phân tử protein có khối lượng phân tử khác nhau.

- Phản ứng lai kháng nguyên-kháng thể

Phản ứng kháng nguyên-kháng thể có tính đặc hiệu rất cao. Vì vậy, có thể áp dụng phản ứng này để phát hiện sự có mặt và tinh sạch protein. Kháng thể (antibody) được sản xuất khi đưa kháng nguyên vào động vật thí nghiệm (thỏ, chuột…) và được tinh sạch từ máu động vật sau khi gây nhiễm. Những kháng thể tạo ra bằng cách này là những kháng thể đa dòng (polyclonal antibodies-do các tế bào lympho khác nhau tiết ra), do đó chúng có khả năng nhận biết một số kháng nguyên. Ngược lại, kháng thể đơn dòng (monoclonal antibodies) chỉ tương tác với một kháng nguyên nhất định.

Kháng thể được đánh dấu bằng enzyme (hoặc bằng chất phát huỳnh quang) để phát hiện protein đặc hiệu (thường được thẩm tích/chuyển thấm lên màng nitrocellulose sau khi chạy điện di SDS, và cố định ở đó) thông qua kỹ thuật Western blot (hoặc immunoblot) (Hình 9.11). Sau khi protein trên màng lai gắn với kháng thể thứ nhất đặc hiệu và tiếp đến là kháng thể thứ hai có đánh dấu enzyme (alkaline phosphatase, horse-radish peroxidase…) thì phức hợp này sẽ được liên kết với cơ chất để tạo màu. Sự hiện diện của protein ngoại lai (sản phẩm dịch mã của gen ngoại lai được chuyển vào tế bào vật chủ) sẽ được phát hiện nhờ sự xuất hiện màu của phản ứng lai.

Sự phân bố của protein đặc hiệu trong tế bào và tổ chức mô cũng có thể phát hiện bằng kỹ thuật lai in situ (in situ hybridization) với nguyên tắc tương tự Western blot. Ngoài ra, kháng thể được sử dụng để tinh sạch protein đặc hiệu bằng kết tủa miễn dịch hoặc sắc ký ái lực (affinity chromatography). Kháng thể đánh dấu được dùng để định lượng kháng nguyên trong kỹ thuật xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme (enzyme-linked immunosorbent assay) gọi tắt là ELISA (Hình 9.11).