1
CÔNG NGHỆ ENZYME
(Enzyme technology
Technologie des enzymes
Enzymtechnologie)
Người trình bày:
Bùi Văn Ngọc
Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm
KH&CN Việt Nam
Email: [email protected] hoặc [email protected]
Hà Nội, tháng 8 năm 2016
2
Chương 2: Sản xuất chế phẩm enzyme từ vi sinh
vật
2.1. Phân lập, tuyển chọn và cải tạo giống vi sinh vật
2.2. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật
2.3. Lựa chọn môi trường nuôi cấy vi sinh vật
2.4. Các phương pháp nuôi cấy vi sinh vật
2.5. Thiết bị lên men
2.6. Thu hồi chế phẩm enzyme
3
2.1. Phân lập, tuyển chọn và cải tạo giống vi sinh vật
• Phân lập và tuyển chọn: Từ đất, nước, không khí, động vật,
thực vật, mẫu bệnh phẩm...hoặc từ bộ sưu tập giống vi sinh
vật (ngân hàng) của đơn vị nghiên cứu nhằm tuyển chọn
được chủng vi sinh vật có khả năng sinh trưởng và phát triển
nhanh, sinh tổng hợp enzyme cao, ổn định
Phân lập, tuyển chọn
vi sinh vật từ bộ sưu
tập giống
4
Phân lập, tuyển chọn vi
sinh vật từ môi trường
(phương pháp truyền
thống và công nghệ
metagenomics)
5
2.2. Cải tạo giống vi sinh vật
• Do cấu trúc, tính chất, chức năng của mỗi protein enzyme
đều được xác định bởi bộ máy di truyền trong tế bào vi sinh
vật (DNA, RNA, protein). Vì vậy, cải biến (qúa trình đột biến)
bộ máy di truyền của vi sinh vật sẽ tạo ra các biến chủng vi
sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cao một loại biến thể
protein enzyme có hoạt độ cao hơn thế hệ trước (kiểu dại,
wild type). Có hai phương pháp chính tạo đột biến:
- Đột biến bằng các tác nhân vật lý (tia cực tím UV, tia Rơnghen, bắn phá electron...), hoá học (nitrozol methylguanin, methyl dicloro
methylamin)
- Đột biến bằng phương pháp sinh học phân tử (công nghệ gen, DNA tái tổ hợp)
6
Đột biến bằng phương pháp sinh học phân tử
(công nghệ gen, DNA tái tổ hợp)
• Phương pháp biến nạp (transformation): Là quá trình chuyển
vật liệu di truyền (DNA lạ) từ môi trường hoặc từ sinh vật
khác (không cần tiếp xúc) qua màng tế bào vi sinh vật nhận
7
• Phương pháp tiếp hợp gen (conjugation): Vật liệu di truyền
(DNA) được truyền từ tế bàp cho đến tế bào nhận thông qua
sự tiếp xúc
8
• Phương pháp tải nạp (transduction): Vật liệu di truyền
được chuyển từ tế bào cho đến tế bào nhận thông qua
vật chủ trung gian (virus, thực khuẩn thể)
9
2.2. Các phương pháp bảo quản giống vi sinh vật
Mục đích: Kéo dài tuổi thọ và ổn định di truyền vi sinh vật
• Phương pháp cấy truyền vi sinh vật: Các chủng vi sinh vật được cấy truyền trên môi trường rắn (môi trường thạch) thích hợp (LB, YPD...), bảo quản ở 4ºC, qúa trình lặp lại từ 2 tuần -2 tháng tuỳ từng vi sinh vật (đảm bảo vi sinh vật được chuyển đến môi trường mới trước khi già hoặc chết)
10
Cấy truyền trên môi trường thạch
Môi trường thạch nghiêng trong ống nghiệm
Môi trường thạch trong đĩa petri
11
Ưu và nhược điểm của phương pháp cấy
truyền trên môi trường thạch
• Ưu điểm: đơn giản, dễ thao tác, ít tốn kém
• Nhược điểm: Tốn nhiều công sức cấy truyền, dễ bị tạp nhiễm,
dễ mất chủng gốc, đột biến chủng gốc (thay đổi đặc điểm sinh
học)
12
• Phương pháp làm mất nước trong môi trường bảo quản:
Bảo quản với các chất mang hút ẩm (silicagel), thường áp
dụng với các dạng nấm sợi
13
• Bảo quản lạnh đông: Canh trường được nuôi trong ống
nghiệm, trộn với 10-30% chất chống đông (glycerol, dimethyl
sulfoxide), giữ ở -80ºC hoặc bảo quản trong nitrogen lỏng
(≈180ºC)
Bảo quản lạnh sâu (-80ºC)
Bảo quản trong nitrogen lỏng
14
• Phương pháp đông khô (Freeze-drying): Canh trường được
làm lạnh đông và làm khô trong môi trường chân không
15
Ưu nhược điểm của các phương pháp bảo
quản lạnh sâu, trong nitrogen lỏng, đông khô
• Ưu điểm: Bảo quản được số lượng lớn mẫu, tiết kiệm diện
tích không gian làm việc, tiết kiệm thời gian và công sức do
bảo quản và duy trì hoạt động sống của vi sinh vật ít nhất
2-20 năm.
• Nhược điểm: Chi phí bảo quản cao, tế bào vi sinh vật có thể
bị vỡ khi giã đông (đặc biệt khi bảo quản ở nhiệt độ
≈-200ºC)
16
2.3. Lựa chọn môi trường nuôi cấy vi sinh vật
Phân loại theo thành phần và nguồn gốc: Có 3 loại
• Môi trường tự nhiên: Có thành phần là các sản phẩm tự nhiên
như cao thịt bò, cao nấm men, khoai tây, rỉ đường, cám...
Khối lượng và thành phần hoá học của môi trường này không
xác định được một cách cụ thể và chính xác (?).
• Môi trường tổng hợp: Chứa các chất hoá học mà thành phần
của chúng đều được xác định và định lượng cụ thể và chính
xác
• Môi trường bán tổng hợp: Chứa cả các chất hoá học và sản
phẩm tự nhiên
17
2.3. Lựa chọn môi trường nuôi cấy vi sinh vật
Phân loại theo tính chất lý học: Có 3 loại
• Môi trường lỏng: Thành phần môi trường không có agar (thạch), thường được sử dụng để nghiên cứu qúa trình sinh tổng hợp của vi sinh vật
• Môi trường đặc (rắn): Chứa 1.5 – 2% agar hoặc 10-20% gelatin, thường sử dụng để nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý của vi sinh vật.
• Môi trường bán lỏng: Chứa 0.3-0.7% agar, cả các chất hoá học và sản phẩm tự nhiên
Phân loại công dụng và mục đích:
• Môi trường cơ bản: Thích hợp cho nhiều loại vi sinh vật khác nhau
• Môi trường chọn lọc: Đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển của một loài hay một nhóm vi sinh vật xác định nào đó
• Môi trường kiểm định: Cho phép phân biệt được một số đặc điểm của một hoặc một số loài xác định (thông qua chất chỉ thị màu)
18. Yêu cầu của môi trường nuôi cấy vi sinh vật
• Có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết (nguồn carbon,
nitrogen, sulfur, vi lượng, vitamin,...), nước hoặc thạch.
• Có độ pH thích hợp
• Có độ nhớt nhất định
• Không chứa các yếu tố độc hại
• Tuyệt đối vô trùng (vô trùng hoặc tiệt trùng môi trường nuôi
cấy)
19. Một số môi trường dùng trong nghiên cứu vi sinh vật
Môi trường nuôi cấy thích hợp sẽ phụ thuộc vào mỗi loài vi sinh vật khác nhau (vi khuẩn, nấm mốc, nấm men) và tuỳ từng mục đích cụ thể (phân lập, tuyển chọn, tăng sinh, làm giàu, sinh tổng hợp một enzyme nhất định)
20. Một số ví dụ:
LB (Lysogeny Broth, Luria-
YPD (yeast extract peptone
Bertani, Vi khuẩn)/ 1L
dextrose, Nấm men)/ 1L
• 1% yeast extract
• 2% peptone
• 2% glucose/dextrose
Môi trường đặc thêm 1.5-2% agar (? g); Môi trường chọn lọc: thêm kháng sinh hoặc bớt amino acid; Môi trường cảm ứng: bổ sung cơ chất cảm ứng
21
Tra cứu trên các website trực tuyến (Sigma-Aldrich,
Thermo Fisher Scientific...)
22
2.4. Các phương pháp nuôi cấy vi sinh vật
• Phương pháp nuôi cấy bề mặt (phương pháp rắn, phương
pháp nổi, solid state fermentation)
• Phương pháp nuôi chìm (phương pháp lỏng, phương pháp
bề sâu, liquid state fermentation)
23
Phương pháp nuôi cấy bề mặt
• Vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường dinh dưỡng như
cám gạo, khô cám, cám mỳ, ngô... (90–95%)có bổ sung vỏ
trấu hoặc mùn cưa (5-10%??) ở thể rắn đã được làm ẩm và
vô trùng. Các nguyên liệu này cung cấp đủ nguồn nitrogen,
carbon, vitamin, muối khoàng cho sự phát triển của vi sinh vật
• Bổ sung (có thể có) thêm nitrogen vô cơ (ammonium sulfate -
(NH4)2SO4, sodium nitrate - NaNO3, urea (?) - CH4N2O hoặc
nitrogen hữu cơ (cao nấm men, cao ngô, dịch chiết malt)
• Môi trường được làm ẩm 50-60%, khử trùng tại 120ºC/15-20
min và 1 at, làm nguội 30-40ºC.
• Tiến hành cấy vi sinh vật, nuôi tại 28-37ºC/ 24-48 h tuỳ từng loại vi sinh vật (?)
24
Phương pháp nuôi cấy bề mặt
Nguồn nguyên liệu
Tủ nuôi (ủ)
• Ưu điểm: nồng độ enzyme cao, canh trường (cultrure) dễ vận
chuyển, tránh được nhiễm trùng toàn bộ khối canh trường, tiết
kiệm điện năng
• Nhược điểm: nuôi cấy gián đoạn, thủ công, tốn diện tích nuôi
cấy, năng suất thấp, tốn công lao động
25
Phương pháp nuôi chìm
• Vi sinh vật phát triển trong môi trường dinh dưỡng lỏng có sục khí liên tục
• Môi trường dinh dưỡng cần đảm bảo các nguồn sau:
- Nguồn carbon: Glucose, maltose, rỉ đường, tinh bột đã thuỷ phân, glycerol...
- Nguồn nitrogen: Nitrogen vô cơ như (NH4)2SO4, NaNO3 (quyết định pH
môi trường??), CH4N2O hoặc nitrogen hữu cơ như cao nấm men, cao
ngô, dịch chiết malt, pepton...
- Muối khoáng và vitamin: MgSO4, K2HPO4, KH2PO4, vitamin B1, B12
• Môi trường dinh dưỡng được bơm vào thùng lên men. Khử
trùng môi trường bằng hơi nước nóng ở 120-125ºC/ 45-60
min, hạ nhiệt độ, bổ sung vi sinh vật, nuôi trong 24-48 h. Qúa
trình nuôi được sục khí liên tục và vô trùng tuyệt đối. Bổ sung
chất hoạt động về mặt (surfactant) làm chất phá bọt (anti-foam)
như tween 20, dầu ăn
26
Cơ chế phá bọt
Micelle (mixen) keo
Chất hoạt động bề mặt (Surfactant)
Cơ chế phá bọt của các
chất phá bọt (anti-foam
agent, defoamer)
27
Phương pháp nuôi chìm
• Enzyme thường được tiết ra trong suốt qúa trình nuôi vi sinh
vật:
- Enzyme ngoại bào: Kết thúc qúa trình nuôi có thể lọc, loại bỏ sinh khối, thu lấy dịch enzyme, cô đặc thu chế phẩm thô hoặc tinh sạch để thu chế
phẩm có độ tinh khiết cao hơn
- Enzyme ngoại bào: Cần phá vỡ tế bào (phương pháp xem phần trước), tinh chế enzyme
• Nhược điểm: Nồng độ enzyme trong canh trường thấp, tốn
điện năng, giá thành cao, dễ bị nhiễm toàn bộ canh trường
nếu không đảm bảo vô trùng tuyệt đối
• Ưu điểm: Có tính liên tục, dễ cơ giới hoá và tự động hoá,
năng suất cao, dễ điều khiển các thông số (nhiệt độ, pH, hàm
lượng oxy, thành phần dinh dưỡng...), enzyme ít lẫn tạp chất
(??)
28
Ưu và nhược điểm của hai phương pháp nuôi cấy
TT
Nuôi cấy bề mặt
Nuôi cấy chìm
1
Khó tự động hóa, năng xuất Dễ tự động hóa, năng suất
thấp, tốn diện tích nuôi cấy
cao, dễ tổ chức sản xuất
2
Khó khăn trong tinh chế
Dễ nuôi cấy chủng VSV đột
enzyme do cần trích ly
biến, enzyme tinh khiết
enzyme, enzyme tinh khiết
hơn
không cao
3
Ít bị nhiễm, ít gây nhiễm
Dễ gây nhiễm hàng loạt
hàng loạt
4
Phù hợp cho nuôi cấy nấm
Phù hợp với các VSV hô
mốc có khả năng phát triển
hấp yếm khí
nhanh
5
Giá thành thấp hơn, nồng độ Giá thành enzyme cao hơn
enzyme cao hơn
do nồng độ enzyme thấp
Bạn đang đọc truyện trên: Truyen2U.Pro