Đánh giá khả năng tồn tại của vi khuẩn hepatopancreatitis hoại tử (NHPB) được lưu trữ tại

-20 ° C để sử dụng trong nhiễm trùng buộc phải ăn Penaeus (Litopenaeus) tôm thẻ chân trắng

Martina Hilda Gracia-Valenzuela

, Luz Angelica Ávila-Villa

, Gloria Yepiz-Plascencia một

,

Jorge Hernandez-Lopez b

, Fernando Mendoza-Cano b

, Guillermina García-Sanchez a

, Teresa Gollas-Galvan a,

⁎

một

Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, AC PO Box 1735, Hermosillo, Sonora, 83000, Mexico

Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste, Avenida Centenario # 53, Hermosillo, Sonora, 83000, Mexico

Thông tin tóm tắt bài viết

Điều lịch sử:

Nhận được 26 tháng ba 2010

Nhận được trong hình thức sửa đổi 17 tháng 11 năm 2010

Chấp nhận 4 Tháng Mười Hai 2010

Có sẵn trực tuyến 10 tháng 12 năm 2010

Từ khóa:

NHPB

Trong tế bào vi khuẩn

Tôm

PCR

Penaeus (Litopenaeus) tôm thẻ chân trắng

Hepatopancreatitis là một bệnh nghiêm trọng của tôm penaeid trồng gây ra bởi một loại vi khuẩn được gọi là hoại tử

hepatopancreatitis vi khuẩn (NHPB). Hiện tại không có kỹ thuật sẵn có để phục hồi và cô lập

NHPB fromcell đường hoặc culturemedium nhân tạo. Aimof nghiên cứu này là phát triển amethod bộ sưu tập

và lưu trữ lâu dài của NHP nhiễm vật chất mà không có quá trình đóng băng siêu. Phương pháp của chúng liên quan

thu thập và đóng băng của mô gan tụy NHPB nhiễm (HP) tại -20 ° C, bằng cách sử dụng glycerol như là một

cryoprotectant. Điều này infectivematerialwas sau đó được sử dụng để lây nhiễm sang tôm đường uống. Tính khả thi của các chất chiết xuất NHPB

được lưu trữ cho 14 tháng cryoprotectant ở -20 ° C đã được thử nghiệm bằng cách lây nhiễm tôm khỏe mạnh. Nhiễm trùng tiến bộ

được theo dõi bằng phương pháp PCR phân tích của phân và bằng cách quét kính hiển vi điện tử. Ngoài ra, chúng tôi phát triển một

buộc phải ăn thủ tục nhiễm trùng truyền bệnh. Đây là loại phương pháp lây nhiễm cho phép

tính đồng nhất và khả năng tái trong thủ tục thử nghiệm liên quan đến truyền NHPB

Penaeus (Litopenaeus) tôm tôm thẻ chân trắng. Thủ tục cưỡng bức ăn cung cấp truyền dẫn hiệu quả hơn

báo cáo trước đây các phương pháp. Phát hiện của chúng tôi chỉ ra rằng trong cơ thể tuyên truyền liên tục là không cần thiết

có một nguồn gốc của NHPB khả thi. Cách tiếp cận này cung cấp một dễ dàng hơn, kinh tế thuận lợi và nhiều hơn nữa

phương pháp khả thi đối với nhiễm trùng thử nghiệm cho các nghiên cứu NHPB.

© 2010 Elsevier B. V. Tất cả các quyền.

1. Giới thiệu

Hepatopancreatitis hoại tử (NHP) bệnh của tôm penaeid,

Penaeus (Litopenaeus vannamei), được gây ra bởi một pleomorphic

trong tế bào vi khuẩn Gram âm (Frelier et al, 1992;. Lightner

et al, 1992). Vi khuẩn này phát triển trong biểu mô ống

tế bào hepatopancreatic tôm penaeid (Frelier et al, 1992). NHPB

nhiễm trùng là chịu trách nhiệm về thiệt hại kinh tế quan trọng, do cao

tỷ lệ tử vong của tôm P. vannamei trong nền văn hóa (Loy et al, 1996; Aranguren

et al, 2006;. del Río-Rodríguez et al, 2006). Căn bệnh đã được

phát hiện trong rất nhiều địa điểm, bao gồm Texas, Peru, Ecuador,

Colombia, Venezuela, Brazil, Nicaragua, Panama, Costa Rica và Mexico

(Loy et al, 1996; Aranguren et al, 2006; del Río-Rodríguez et al, 2006.

Ibarra-Gamez et al, 2007.).

Cho đến nay, không có phương pháp thành công trong ống nghiệm văn hóa của NHPB

được xuất bản và các nỗ lực để văn hóa NHPB sử dụng truyền thống

phương pháp vi khuẩn đã không thành công (Lightner, 1996;

Braasch et al, 1999). Vì vậy, sử dụng thử nghiệm NHPB yêu cầu

tuyên truyền của vi khuẩn trong tôm sống. Như vậy, thử nghiệm

tiếp xúc với các hệ thống dựa vào duy trì NHPB tôm sống. Điều này

quá trình tốn kém và tốn thời gian vì dễ bị tôm

phải liên tục được thêm vào các xe tăng bị nhiễm NHPB-tuyên truyền

bệnh.

Việc thiếu trong phương pháp cô lập trong ống nghiệm cho NHPB đã nhắc nhở các

phát triển của hai kỹ thuật để tái tạo các nhiễm trùng dưới

kiểm soát điều kiện. NHPB đầu tiên thử nghiệm nhiễm

báo cáo của Frelier et al. (1993). Nghiên cứu này được tiêm một NHPB

đình chỉ, thu được bằng cách ultracentrifugation mật độ dốc, gần

gan tụy của tôm khỏe mạnh. Tuy nhiên, đây là một phức tạp

quá trình và không phải tự nhiên có nghĩa là nhiễm trùng. Vincent et al. (2004)

phát triển một giao thức tiếp xúc tự nhiên hơn bằng cách cố gắng mỗi os

truyền tải NHPB P. tôm thẻ chân trắng. Họ đã mô tả một tiếp xúc với hệ điều hành mỗi

hệ thống và thành công tiếp xúc với tài liệu bằng miệng và đặc tính

nhiễm trùng trong phòng thí nghiệm. Gần đây, Crabtree et al. (2006)

phát triển amethod để lưu trữ NHPB. Họ thu thập hepatopancreatic

NHPB có chứa mô gan tụy đèn flash đông lạnh tươi nguyên,

mô ở -80 ° C. Mô này đã được lưu trữ lên đến 80 ngày và

sử dụng thành công đối với nhiễm trùng os mỗi P. tôm thẻ chân trắng sạch bệnh miễn phí

thí nghiệm kiểm soát, chứng minh rằng sự lây nhiễm của NHPB

không bị thay đổi sau khi đông lạnh ở -80 ° C.

Để thực hiện các nghiên cứu liên quan với khả NHPB vĩnh viễn, một

nguồn vi khuẩn hữu hiệu là cần thiết. Mục đích của nghiên cứu này

là thiết lập mô gan tụy NHP nhiễm có thể được

lưu trữ-20 ° C trong thời gian dài mà không ảnh hưởng đến khả năng tồn tại của

Nuôi trồng thủy sản 311 (2011) 105-109

⁎ tác giả tương ứng. Điện thoại: +52 662 289 2400, fax: 52 662 280 04 21.

Địa chỉ E-mail: [email protected] (T. Gollas-Galvan).

0044-8486 / $ - vấn đề trước © 2010 Elsevier BV. Tất cả các quyền.

doi: 10.1016/j.aquaculture.2010.12.008

Nội dung danh sách có sẵn tại ScienceDirect

Nuôi trồng thủy sản

tạp chí trang web: www.elsevier.com / xác định vị trí / thủy onlinebacteria bằng cách thêm glycerol như cryoprotectant. Điều này đã được sử dụng trong một

buộc phải ăn mô hình cho nhiễm NHP tôm, một quá trình được

hiệu quả hơn cho ăn miễn phí cho thử nghiệm đồng nhất

nhiễm trùng.

2. Vật liệu và phương pháp

P. vị thành niên khỏe mạnh tôm thẻ chân trắng tôm đã được duy trì theo

điều kiện tối ưu. Nước biển nhân tạo ở mức 35 ppm với liên tục

thông khí và dailywater trao đổi (80%) đã được sử dụng cho tất cả các thí nghiệm.

Tôm cá nhân được phân tích cho WSSV, TSV, YHV, IHHNV và

NHP sử dụng bộ dụng cụ thương mại (IQ200 ™ và DiagXotics, Co) để đảm bảo

động vật khỏe mạnh chỉ được sử dụng cho tất cả các xét nghiệm.

2.1. NHPB lấy mẫu tôm bị nhiễm bệnh và chuẩn bị cấy

Trang trại nằm ở phía Bắc của Hermosillo, Sonora, Mexico

lấy mẫu để tìm thấy tôm có dấu hiệu của bệnh NHPB. HP mô

chiết xuất các mẫu tôm fromthe. Sampleswere đặt trong amicrotube

chứa 300 ml của một giải pháp clorua 0,9% natri chuẩn bị

pyrogen nước miễn phí, vận chuyển đến phòng thí nghiệm và sự hiện diện của

NHPB được phát hiện bằng phương pháp PCR (xem phần sau). NHPB-dương

mẫu được sử dụng để lây nhiễm sang tôm khỏe mạnh và các mô của HP

những con vật này được thu thập và phân tích bằng phương pháp PCR và điện tử

kính hiển vi (tinh khiết chiết xuất trong một gradient percoll) để xác nhận

sự hiện diện của NHPB. Những mô HP đã đồng nhất trong glycerol ở

01:01 tỷ lệ khối lượng (Sambrook và Russell, 2001), được lưu trữ tại-20 ° C

và được sử dụng như là inocula NHPB cho các xét nghiệm lây nhiễm thử nghiệm.

2.2. Cưỡng bức ăn nhiễm

Tổng cộng là 240 tôm đã được sử dụng và chia ngẫu nhiên thành hai

nhóm: 160 sinh vật được sử dụng như là nhóm điều trị và 80

tôm đã được sử dụng như một nhóm kiểm soát. Mỗi sinh vật trong

nhóm điều trị đã được tiêm phòng với 40 ml (có chứa 0,04 g

mô bị nhiễm bệnh) NHPB nhiễm HP. Tiêm chủng được thực hiện bởi

buộc phải ăn, trực tiếp gửi mẫu vào trong khoang ruột. Các

ăn chèn thủ tục tham gia của một mũi pipette dài và linh hoạt

(22 G × 32 mm đường kính) dưới labrum và trước

hàm dưới. Nhóm điều khiển được cho ăn với NHPB-HP mô sử dụng

cùng một phương pháp. Sáu mươi tôm từ nhóm điều trị và ba mươi

fromthe kiểm soát groupwere thử nghiệm cá nhân ở các ngày 4, 7, 15 và 18

sau tiêm chủng cho sự hiện diện của NHPB sử dụng PCR. Survival

tỷ lệ phần trăm được ghi lại và tỷ lệ lây nhiễm đã được tính toán như

số lượng các sinh vật bị nhiễm bệnh chia cho tổng số

còn sống sót sinh vật cho mỗi nhóm.

2.3. Buộc ăn với mỗi hệ điều hành tiếp xúc

Nhiễm trùng buộc phải ăn procedurewas so với hệ điều hành mỗi

tiếp xúc với kỹ thuật bằng cách sử dụng ba mươi tôm khỏe mạnh cho mỗi nhóm. Các

tôm cá nhân được đặt trong các thùng chứa có ga với l-2

nước biển đã được lọc thẩm thấu ngược. Tôm

thiếu trong ba ngày trước khi thí nghiệm. -Buộc phải cho ăn

thủ tục được thực hiện như đã mô tả trước đó. Mỗi hệ điều hành tiếp xúc

liên quan đến việc bổ sung 0,04 g NHPB nhiễm HP mỗi hồ cá

có chứa tôm cá nhân và các loài động vật được phép để nuôi

tự nhiên. Nhóm kiểm soát được bao gồm cho cả hai phương pháp sử dụng

HP NHPB miễn phí. Tỷ lệ sống sót của tôm và sự hiện diện

NHPB trong phân được đánh giá trong một khoảng thời gian 18 ngày. HP mô

đã được thu hoạch vào cuối thí nghiệm để xác nhận sự hiện diện

NHPB.

2.4. Kiểm tra khả năng tồn tại của NHPB lưu trữ

Chúng tôi đã thử nghiệm khả năng của NHPB đã được lưu trữ trong 1, 3, 6 và

14months để lây nhiễm động vật khỏe mạnh. Hai mươi tôm từ mỗi nhóm

cá nhân đã được tiêm phòng ăn bắt buộc, và feceswere thu thập

hàng ngày cho PCR phát hiện ofNHPB, như được mô tả bởi Briñez et al. (2003). Asa

kiểm soát, tôm hai mươi đã được tiêm phòng miễn phí NHPB HP. Tỷ lệ tử vong

đã được ghi lại hàng ngày.

2.5. Khai thác DNA di truyền và phát hiện NHPB bằng phương pháp PCR

GenomicDNAwas chiết xuất fromshrimpHP hoặc phân detectNHPB

bằng cách sử dụng một bộ commercialGeneClean (BioQ ® Inc, 1101-601), sau đây được

thông số kỹ thuật của nhà sản xuất. Phát hiện NHPB DNA được thực hiện

bằng phương pháp PCR sử dụng mồi Fw: 5'-CGT TGG AGG TTC GTC CTT CAG T-3 "

Rv: 5'-GCC ATG AGG ACC TGA CAT CAT C-3, được thiết kế chống lại

GenBank nhập số tương ứng với ribosome 16S rRNA của

NHPB, trong đó khuếch đại 379 bp mảnh (Nunan et al, 2008). PCR

reactionswere thực hiện trong 25 khối lượng cuối cùng ml chứa 2,5 μlof10 ×

PCR đệm, 0,5 ml 10mMdNTPmixture, 0,75 ml là 50 mMMgCl2, 0,2 μlof

platinumtaqDNA polymerase (Invitrogen), 1 μlofeachprimer (20 mM),

1 ml gDNA (tương đương với 50 ng), và 18,05 ml nước. PCR phản ứng

được thực hiện trên một gradient P × 2 chu trình nhiệt (nhiệt điện tử

Tổng công ty) theo các điều kiện sau: 95 ° C / 2 phút, 25 chu kỳ

95 ° C/30 s, 60 ° C/30 s và 70 ° C/30 s; 60 ° C / 1 phút và 72 ° C trong 2 phút.

Các sản phẩm PCR được phân tích trên 1,2% agarose gel dính với SYBR

màu xanh lá cây và các sản phẩm khuếch đại được hình dung dưới ánh sáng UV

bằng cách sử dụng KODAK Imaging 4.0 chương trình hệ thống.

2.6. Hiển vi điện tử quét (SEM)

Các vi khuẩn NHP đã được thu hồi từ tôm mô thông qua sửa đổi

Percoll ly tâm mật độ gradient, như được mô tả trước đây

(Tamura et al, 1982; Frelier et al, 1992). Tóm lại, mười NHPB nhiễm

HP đã đồng nhất ở nhiệt độ 4 ° C và ly tâm ở 200 × g trong 8 phút trong

Tris-sucrose bộ đệm (pH7.4) có chứa 0,033 MTris hydrochloride và

0,25 Msucrose để loại bỏ các mảnh vỡ mô. Các supernatantwas loại bỏ,

lớp trên một gradient Percoll với một nồng độ cuối cùng là 40% và

ly tâm ở 25.000 × g trong 60 phút ultracentrifuge một. Ban nhạc

vi khuẩn hình thành tại giao diện của Percollwas thu hoạch và đông lạnh

tại-20 ° C bằng cách sử dụng glycerol như cryoprotectant. Isolated NHPB được cố định

trong gluteraldehyde 2,5% trong 0,2 Msodiumcacodylate (pH7.2-7.4), được lưu giữ tại

4 ° C trong 24 giờ, rửa sạch với cùng một bộ đệm trong 20 phút và mất nước

trong ethanol 30, 50, 70, 96 và 100% sau đó chuyển giao cho hexamethyl-

disilazane, thêm tươi giải pháp mỗi 20 phút. Sau khi mất nước,

mẫu được sấy khô dưới dioxide carbon điểm tới hạn (Samdri

PVT-3B), sau đó phủ với palladium và phân tích trong một

kính hiển vi quét (Hitachi S-3000 N).

3. Kết quả

Nhiễm trùng NHPB tự nhiên của tôm xảy ra thông qua tiêu hóa

mô bị nhiễm bệnh do ăn thịt người. Để mô phỏng tình trạng này, chúng tôi

phát triển một phương pháp để lây nhiễm sang tôm khỏe mạnh với NHPB. Sử dụng

phương pháp, các mô bị nhiễm bệnh đã được gửi trực tiếp vào dạ dày

khoang của mỗi tôm, cung cấp liều của vi khuẩn với nhau

động vật và homogenizing nhiễm thực nghiệm. Chúng tôi quan sát thấy

một tỷ lệ nhiễm trùng thử nghiệm của 90-100% trong 18 ngày sử dụng

phương pháp (Hình 1).

Các dấu hiệu lâm sàng đầu tiên của nhiễm trùng NHPB trong thử nghiệm

Thách thức là không có sinh lực của tôm, nhìn thấy ở 6 đến 18 ngày sau

tiếp xúc. Gutswere rỗng quan sát from7 đến 20 ngày sau tiếp xúc,

theo sau cái chết của tôm nhiễm NHPB 4 ngày sau đó. Khác

dấu hiệu nhiễm trùng bao gồm HP hết sức nhợt nhạt có thể nhìn thấy thông qua

mai. Dấu hiệu lâm sàng của infectionwere quan sát bắt đầu từ ngày thứ 4

phân sau tiêm chủng và PCR dương tính được xác định trong cùng một ngày.

106 M.H. Gracia-Valenzuela et al. / Nuôi trồng thủy sản 311 (2011) 105-109We kiểm tra sự lây nhiễm của inocula NHPB được lưu trữ trong 1, 3, 6 và

14 tháng tại -20 ° C bằng cách sử dụng tôm khỏe mạnh. Inocula được thử nghiệm cho

NHPB bằng phương pháp PCR trước khi xét nghiệm lây nhiễm. Trong mọi trường hợp, chúng tôi quan sát

PCR kết quả tích cực cho sự hiện diện của NHPB trong HP (Hình 2A)

phân (Hình 2B) của tôm tiêm nhiễm NHPB mô. Để

xác định khi tôm khỏe mạnh có thể bị nhiễm bệnh bằng cách sử dụng được lưu trữ

NHPB-inocula, vị thành niên P. tôm thẻ chân trắng nhiễm

NHPB trực tiếp buộc phải ăn hoặc tươi hoặc đông lạnh trước đây

HP (có chứa glycerol, đông lạnh ở -20 ° C 1, 3, 6 hoặc 14 tháng).

Sự hiện diện của NHPB trong phân shrimpwas fromindividual thử nghiệm hàng ngày

bằng phương pháp PCR và sự sống còn phân tích được thực hiện trong suốt

thử nghiệm (Hình 3). HPS của các sinh vật chết đã phân tích

sự hiện diện của NHPB. Vào cuối của sinh thử nghiệm, tất cả các sinh vật

hy sinh và sự hiện diện của NHPBwas tìm thấy trong HP của tất cả các nhiễm

tôm nhưng không có trong các mẫu kiểm soát. Trong tất cả các phương pháp điều trị thử nghiệm,

phát hiện của NHPB có thể sớm nhất là 4 ngày sau tiêm chủng

và không có sự khác biệt thống kê quan trọng trong việc lây nhiễm của inocula

phát hiện. Sự hiện diện của vi khuẩn đã được khẳng định bằng phương pháp PCR và

quét hiển vi điện tử. Quan sát các chất chiết xuất từ ​​bị cô lập bởi

quét hiển vi điện tử cho thấy sự hiện diện của rất nhiều

pleomorphic vi khuẩn với đường kính từ 0,2 đến 0,5 mm.

Để so sánh buộc ăn với một nhiễm trùng được báo cáo

phương pháp, lành mạnh và vị thành niên P. tôm thẻ chân trắng tôm đã được tiếp xúc với mỗi hệ điều hành

NHPB nhiễm HP và một nhóm khác đã bị nhiễm bằng cách buộc

cho ăn với HP NHPB nhiễm. Nhiễm trùng ở cả hai nhóm kết quả

trong truyền tải thành công của NHPB. Tuy nhiên, cưỡng bức ăn

phương pháp kết quả trong một tỷ lệ phần trăm cao hơn của NHPB nhiễm (100%)

hơn so với các tiếp xúc với mỗi hệ điều hành (56,5%) vào lúc 18 ngày sau tiêm chủng (Bảng 1).

Thời gian tồn tại trung bình của tôm dương tính NHPB (ví dụ, thời gian để chết

50% của nhóm) là 11 ngày đối với tôm ép ăn và 18 ngày

cho mỗi hệ điều hành tiếp xúc với tôm. Sự tồn tại của các nhóm kiểm soát tôm

là 100% vào cuối giai đoạn thử nghiệm. Ngoài ra, tôm

tiêm phòng bắt buộc ăn nhiễm NHPB hiển thị trong một rất ngắn

thời gian, cho phép PCR phát hiện vi khuẩn trong phân hoặc mô tôm

sớm nhất là bốn ngày sau tiêm chủng (Hình 4).

4. Thảo luận

4.1. Khả năng tồn tại và phát hiện NHPB

Hiện tại không có dòng tế bào tôm hoặc cách ly kỹ thuật

có sẵn cho các vi khuẩn tương tự như NHPB (Bradley-Dunlop et al, 2004).

Mục đích của nghiên cứu này là phát triển một phương pháp để thu thập và

lưu trữ của NHP nhiễm nguyên liệu cho một thời gian dài. Phương pháp

liên quan đến việc thu thập và đóng băng của HP nhiễm NHPB -20 ° C,

sử dụng glycerol như cryoprotectant. Điều này hepatopancreaticmaterialwas

sau đó được sử dụng để lây nhiễm sang tôm bằng một quá trình buộc phải ăn. Một lợi thế

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

4 7 15 18

Sau nhiễm ngày

NHP nhiễm (%)

Hình 1. Tỷ lệ tôm bị nhiễm bệnh sau khi bị buộc phải ăn tiêu thụ NHPB

bị nhiễm HP. Sự hiện diện của NHPBwas và phân phát hiện bằng PCR trong HP vào cuối của

thử nghiệm.

Hình 2. Phát hiện NHPB bằng phương pháp PCR trong tôm thực nghiệm bị nhiễm lưu trữ inocula

thời điểm khác nhau tại -20 ° C trong glycerol 50%. Phát hiện) HP: MW: Low khối lượng DNA

Trọng lượng phân tử đánh dấu nấc thang; 1 dòng, 2, 3 và 4: tôm bị nhiễm bệnh với inocula

được lưu trữ cho 1, 3, 6 và 14 tháng tương ứng, 5 inocula ban đầu, 6 NHPB tích cực kiểm soát

và 7 NHPB tiêu cực kiểm soát. B) phát hiện trong phân dòng 1, 2, và 3: tôm bị nhiễm bệnh

inocula lưu trữ 3, 6 and14 tháng tương ứng, 4: NHPB tích cực kiểm soát, 5:

NHPB tiêu cực kiểm soát, MW: lượng thấp trọng lượng phân tử DNA thang đánh dấu.

Thời gian (ngày)

0

Sống (%)

0

20

40

60

80

100

NHPB tươi

NHPB 1M

NHPB 3M

NHPB 6M

NHPB 14M

Kiểm soát

2 468 10 12 14 16 18 20

Hình 3. Đường cong sống còn đối với tôm thử nghiệm bị nhiễm thông qua ăn buộc với inocula

có chứa NHPB và được lưu trữ cho các thời điểm khác nhau ở -20 ° C trong glycerol 50%, 1 M) cấy

được lưu trữ cho 1 tháng, 3 M) inocula được lưu trữ trong vòng 3 tháng, 6 M) inocula được lưu trữ trong 6 tháng, 14 M)

inocula được lưu trữ trong 14 tháng, kiểm soát) tôm tiêm miễn phí NHPB HP. Khám phá đầu tiên

bằng phương pháp PCR tại ngày 4 postinfection (mũi tên).

Bảng 1

Phát hiện NHPB bằng phương pháp PCR và phân tích tỷ lệ tử vong của tôm bị nhiễm bệnh do ăn buộc

hoặc cho mỗi hệ điều hành tiếp xúc tại 18 ngày sau tiêm chủng.

Thách thức n NHPB trong phân

(Tích cực / tổng số)

NHPB trong HP

(Tích cực / tổng số)

(%)

nhiễm trùng

Tỷ lệ tử vong

(%)

I) Buộc ăn 23 23/23 23/23 100 39

II) cho mỗi hệ điều hành 23 13/23 13/23 57 15

Kiểm soát tôi 23 0 / 23 0 0 0

Kiểm soát II 23 0 / 23 0 0 0

107 M.H. Gracia-Valenzuela et al. / Nuôi trồng thủy sản 311 (2011) 105-109of này preservationmethod NHPB mô có thể được lưu trữ cho đến khi

đủ nguyên liệu có sẵn cho các thí nghiệm nhiều. Việc sử dụng các

buộc phải ăn phương pháp nhiễm thực nghiệm cho phép tiêu chuẩn

ization số tiền cấy cho cơ thể mỗi và

cung cấp một thủ tục hiệu quả hơn và đồng nhất cho kinh nghiệm

truyền tải tinh thần của NHPB P. tôm thẻ chân trắng.

Trong tìm kiếm cho amethod để lưu trữ lây nhiễm vi khuẩn inoculawithout

quá trình cực kỳ lạnh, chúng tôi đã chọn để sử dụng cryoprotectant một vi khuẩn

bảo quản lạnh, trên cơ sở đề nghị của Sambrook

Russell (2001). Nghiên cứu này cho thấy rằng glycerol là một cryoprotectant rằng

có thể duy trì vi khuẩn có thể sống trong thời gian dài của thời gian. Dữ liệu của chúng tôi cho thấy

rằng sự lây nhiễm của inocula được lưu trữ miễn là một 14months

duy trì, trái ngược với báo cáo trước đây (Frelier et al, 1993; Vincent.

et al, 2004) cho thấy nhiễm trùng sau khi 2 tháng hoặc 80 ngày kể từ ngày lưu trữ.

Phương pháp phát triển trong phòng thí nghiệm của chúng tôi chứng minh khả năng tồn tại cao hơn

inocula được lưu trữ tại -20 ° C trong cryoprotectant và không đòi hỏi cực

đóng băng thủ tục.

4.2. Buộc ăn với mỗi hệ điều hành tiếp xúc

Do thiếu trong các phương pháp nuôi cấy in vitro cho NHPB tuyên truyền

(Lightner và Redman, 1998), một NHPB nhiễm trùng tôm hiệu quả

phương pháp là cần thiết. Tính đồng nhất và hiệu quả của nhiễm trùng trong

hai chiến lược trước đây sử dụng để tái sản xuất bị nhiễm trùng dưới

điều kiện kiểm soát thấp và permanentmaintenance

tôm sống cần thiết để duy trì một cấy khả thi.

Ngoài ra, phương pháp lây nhiễm bởi Frelier et al. (1993)

liên quan đến việc sử dụng mật độ dốc Percoll-vi khuẩn bị cô lập và

tiêm mẫu bằng cách tiêm tiếp giáp với HP. Tuy nhiên, điều này

Phương pháp này không tái tạo các tuyến đường tự nhiên của nhiễm trùng, thông qua

ruột, và nó không biết liệu đi qua ruột

có ảnh hưởng đến việc cài đặt của vi khuẩn vào cơ quan đích.

Các kết quả thu được trong nghiên cứu này cho thấy hiệu quả của buộc

ăn kỹ thuật trong nhiễm trùng NHPB thử nghiệm. Kỹ thuật này được

một sự thay thế để tái tạo sự lây nhiễm một số cổ phần

thuận lợi cho các phương pháp mô tả trước đây (Frelier et al, 1993.;

Vincent et al, 2004; Vincent và Lotz, 2005). Ví dụ, nhiễm trùng

được tạo ra trong thời gian ngắn hơn và sinh sản của các nhiễm trùng NHPB

đồng nhất bởi vì liều gửi trực tiếp trong

dạ dày là chính xác bằng trong tất cả các sinh vật. Lợi thế này tránh được

sự không chắc chắn về việc tiêu thụ một liều lượng không đầy đủ trong hệ điều hành mỗi

tiếp xúc với phương pháp, trong đó liều phụ thuộc vào tự động consump

tion trong mỗi sinh vật.

Bởi vì NHPB là một bệnh nhiễm trùng phát hiện, trong tế bào của mầm bệnh

bởi PCR liên quan đến việc khai thác của HP và cái chết của tôm. Tuy nhiên,

một alternativemethod phát hiện NHPB mà không giết chết tôm

hoặc sử dụng động vật chết đã được báo cáo. Briñez et al. (2003)

báo cáo phát hiện NHPB DNA trong các mẫu phân từ P. tôm thẻ chân trắng

người lớn, cung cấp một phương pháp không phá hủy để chẩn đoán NHPB

bị nhiễm bệnh giống bố mẹ. Chúng tôi sử dụng phương pháp được đề xuất bởi Briñez et al.

(2003) trong tất cả các xét nghiệm cho NHPB nhiễm trùng và phân tích PCR của phân

thực hiện hàng ngày trong tất cả các thí nghiệm.

Vincent và Lotz (2005) đã đề xuất một đường cong sống sót giả thuyết

với ba giai đoạn riêng biệt tương ứng prepatent, cấp tính và

trạng thái của nhiễm trùng mãn tính. Việc chuyển đổi từ một tiểu bang

đánh dấu bằng một sự thay đổi trong tỷ lệ tử vong. Nhà nước prepatent, hoặc

Thời kỳ ủ bệnh, được đặc trưng bởi một giai đoạn không có triệu chứng

bệnh tật và sự sống còn một tỷ lệ hàng ngày tương tự như các máy chủ không bị nhiễm bệnh.

Giai đoạn này bắt đầu tiếp xúc ngay lập tức sau đây để các tác nhân gây bệnh như

mầm bệnh nhân và tiếp tục cho đến khi sự gia tăng hàng ngày

tỷ lệ tử vong được quan sát thấy. Các giai đoạn prepatent và cấp tính

quan sát rõ ràng (với tỷ lệ tử vong khá cao trong

giai đoạn cấp tính) trong nghiên cứu này. Chúng tôi xác định không có dấu hiệu của một giai đoạn mãn tính

trong quá trình thử thách NHPB.

Trong kết luận, kết quả PCR và quét điện tử

kính hiển vi của HP cho thấy sự hiện diện của NHPB trữ lạnh

mẫu được bảo vệ với glycerol ở -20 ° C và được lưu trữ lên đến

14 tháng. Khả năng của các mẫu này để lây nhiễm sang tôm khỏe mạnh

không bị ảnh hưởng bởi thời gian lưu trữ. Phương pháp lưu trữ này giúp loại bỏ sự cần

tuyên truyền trong cơ thể, cải thiện xử lý cho các nghiên cứu sau đó và

loại bỏ sự bảo trì tốn kém của các sinh vật. Các

kỹ thuật được sử dụng để lây nhiễm sang tôm thông qua nuôi buộc phải có hiệu quả

và đồng nhất, và tất cả các sinh vật ăn cùng một lượng

cấy bị nhiễm bệnh và nhiễm trùng xảy ra sớm nhất là bốn ngày

sau tiêm chủng.

Lời cảm ơn

Nghiên cứu này được hỗ trợ bởi Nacional Consejo de Ciencia y

Tecnología (CONACYT) thông qua dự án 45978-Z và Fundación Sản xuất

Sonora 26-2009-1952.

Tài liệu tham khảo

Aranguren, LF, Brinez, B., Aragon, L., Platz, C., Caraballo, X., Suarez, A., Salazar, M. năm 2006.

Hepatopancreatitis hoại tử (NHP) bị nhiễm Penaeus tôm thẻ chân trắng bố mẹ-nữ

chứng khoán: ảnh hưởng đến các các thông số sinh sản, nauplii và chất lượng ấu trùng.Nuôi trồng thủy sản

258, 337-343.

Braasch, DA, Ellender, RD, Middlebrooks, BL năm 1999. Thành phần chu kỳ tế bào và

tiềm năng ảnh hưởng trên sự phát triển của liên tục trong tế bào in vitro penaeid

nhân rộng. Meth. Tế bào Sci. 21, 255-261.

Bradley-Dunlop, DJ, Pantoja, C., Lightner, DV, năm 2004. Phát triển của đơn dòng

kháng thể để phát hiện hoại tử hepatopancreatitis tôm penaeid. Dis.

Aquat. Ghép nội tạng. 60, 233-240.

Briñez, B., Aranguren, F., Salazar, M., 2003. Phân mẫu như là một nguồn DNA cho

chẩn đoán hepatopancreatitis hoại tử (NHP) ở tôm thẻ chân trắng Penaeus bố mẹ.

Dis. Aquat. Ghép nội tạng. 5, 69-72.

Crabtree, BG, Erdman, MM, Harris, DL, Harris, CNTT năm 2006. Bảo quản của hoại tử

hepatopancreatitis vi khuẩn (NHPB) bằng cách mô đông lạnh từ kinh nghiệm thu thập

tinh thần bị nhiễm bệnh tôm thẻ chân trắng Litopenaeus. Dis. Aquat. Ghép nội tạng. 70, 175-179.

del Río-Rodríguez, RE, Soto-Rodríguez, S., Lara-Flores, M., Cu-Escamilla, AD,

Gomez-Solano, M.I. năm 2006. Hepatopancreatitis hoại tử (NHP) bùng nổ trong một

trang trại nuôi tôm ở Campeche, Mexico: một báo cáo trường hợp đầu tiên. Nuôi trồng thủy sản 255, 606-609.

Frelier, PF, Sis, RF, Bell, TA, Lewis, DH năm 1992. Nghiên cứu bằng kính hiển vi và siêu

hoại tử hepatopancreatitis trong tôm Thái Bình Dương trắng (Penaeus vannamei)

nuôi trong Texas. Vet. Pathol. 4, 269-277.

Frelier, P.F., Loy, J.K., Kruppenbach, B., 1993. Truyền của hoại tử hepatopan

creatitis trong tôm thẻ chân trắng Penaeus. J. Invertebr. Pathol. 61, 44-48.

Ibarra-Gamez, JC, Galaviz-Silva, L., Molina-Garza, zJ, 2007. Phân phối của hoại tử

hepatopancreatitis vi khuẩn (NHPB) ở tôm thẻ chân trắng nuôi, Litopenaeus

tôm thẻ chân trắng, từ Mexico. Cienc. 33 Tháng Ba, 1-9.

Lightner, D.V. năm 1996. Một cuốn sổ tay của bệnh lý và chẩn đoán. Thủ tục cho bệnh của

Tôm nuôi Penaeid. Mục 3: Virus. Thế giới Nuôi trồng thủy sản xã hội, Baton

Rouge, Louisiana, USA.

Lightner, D.V., Redman, R.M., năm 1998. Tôm bệnh và các phương pháp chẩn đoán hiện hành.

Nuôi trồng thủy sản 164, 201-220.

Lightner, D.V., Redman, R.M., Bonami, J.R. năm 1992. Bằng chứng hình thái cho một đơn

nguyên nhân vi khuẩn trong hepatopancreatitis hoại tử Texas Penaeus vannamei

(Giáp xác: Decapoda). Dis. Aquat. Ghép nội tạng. 13, 235-239.

Thời gian (ngày)

02468101214161820

Sống (%)

0

20

40

60

80

100

Buộc thức ăn

Per os

Kiểm soát

Hình 4. So sánh giữa hai phương pháp NHPB nhiễm trùng: mỗi hệ điều hành và buộc phải ăn-.

Cưỡng bức ăn nhiễm trùng hiệu quả hơn.

108 M.H. Gracia-Valenzuela et al. / Nuôi trồng thủy sản 311 (2011) 105-109Loy, JK, Dewhirst, FE, Weber, W., Frelier, PF, Garbar, TL, Tasca, SI, Templeton, JW,

Năm 1996. Phát sinh học phân tử và trong việc phát hiện tại chỗ của các tác nhân bệnh nguyên của

hepatopancreatitis hoại tử ở tôm. Appl. Môi trường. Microbiol. 62 tuổi, 3439-3445.

Nunan, L.M., Pantoja, C., Lightner, D.V., 2008. Cải thiện một phương pháp PCR cho

phát hiện hoại tử hepatopancreatitis trong tôm. Dis Aquat. Ghép nội tạng. 19, 69-73.

Sambrook, J., Russell, D.W. năm 2001. Nhân bản phân tử một hướng dẫn sử dụng Phòng thí nghiệm, vol. 1. Lạnh

Phòng thí nghiệm Spring Harbor Press, trang 143-162.

Tamura, A., Urakami, H., Tsuruhara, T., 1982. Thanh lọc Rickettsia tsutsugamushi

Percoll mật độ dốc ly tâm. Microbiol. Immunol. 26, 321-328.

Vincent, A.G., Lotz, J.M., năm 2005. Thời gian khoá học của hepatopancreatitis hoại tử (NHP)

thử nghiệm bị nhiễm Litopenaeus tôm thẻ chân trắng và định lượng vi khuẩn NHP

bằng cách sử dụng real-time PCR. Dis. Aquat. Ghép nội tạng. 67, 163-169.

Vincent, A.G., Breland, V.M., Lotz, J.M. năm 2004. Thí nghiệm nhiễm trùng trắng Thái Bình Dương

tôm Litopenaeus hepatopancreatitis vannameiwith hoại tử (NHP) vi khuẩn

tiếp xúc với hệ điều hành mỗi. Dis. Aquat. Ghép nội tạng. 61, 227-233.

109 M.H. Gracia-Valenzuela et al. / Nuôi trồng thủy sản 311 (2011) 105-109