Định lượng các tác nhân vi khuẩn của hepatopancreatitis hoại tử (NHP-B)

PCR thời gian thực và so sánh về sự tồn tại và tải NHP của hai quần thể tôm

Luis Fernando Aranguren a, b,

⁎, Kathy F. J. Tang

, Donald V. Lightner

một

một

Cục Thú y và Vi sinh vật học, Đại học Arizona, Tucson, 85721, USA

Corporacion Centro de Investigacion de la Acuacultura de Colombia, CENIACUA, Carrera 9C 114-60, Bogota, Colombia

Thông tin tóm tắt bài viết

Điều lịch sử:

Nhận được 27 Tháng Hai 2010

Nhận được trong hình thức sửa đổi ngày 17 tháng bảy 2010

Tháng Bảy 21, 2010

Từ khóa:

Hoại tử hepatopancreatitis

Penaeus vannamei

Real-time PCR

Chọn lọc di truyền

Một xét nghiệm PCR định lượng thời gian thực (qPCR) đã được phát triển bằng cách sử dụng một thăm dò TaqMan để phát hiện và định lượng

hoại tử vi khuẩn hepatopancreatitis (NHP-B) Penaeus vannamei. Một cặp mồi mà khuếch đại

67 bp DNA mảnh và một đầu dò TaqMan đã được lựa chọn từ gen rRNA 16 S của bộ gen NHP-B. Một

tích cực kiểm soát plasmid DNA được sử dụng để chứng minh rằng các NHP qPCR khảo nghiệm có một giới hạn phát hiện của 100

bản sao và một loạt các log-tuyến tính lên đến 108

bản. Một thách thức NHP-B thử nghiệm bằng cách sử dụng hai quần thể khác nhau,

Colombia (COL) và Mầm bệnh miễn phí cụ thể Kona dòng (Kona), được tiến hành. Cuối cùng sống sót và một

đường cong sống sót tốt hơn đã được tìm thấy trong dân số COL. Không có sự khác biệt tải NHP-B vi khuẩn được tìm thấy trong

gan tụy (HP) đã phân tích từ những người sống sót từ dân số mỗi. Độ nhạy của các kiểm tra qPCR

cao hơn nhiều so PCR thông thường (100 bản vs 1 × 105

bản sao).

© 2010 Elsevier B. V. Tất cả các quyền.

1. Giới thiệu

Hepatopancreatitis hoại tử (NHP) là một bệnh gây ra bởi một

không được phân loại Gram âm, pleomorphic nội bào alpha proteo

vi khuẩn sẽ được gọi là NHP-B cho các mục đích của bài viết này

(Frelier et al, 1992;. Lightner và Redman, 1994). NHP ảnh hưởng đến văn hóa

penaeid tôm ở một số nước ở Tây bán cầu

trong đó có Mỹ, Trung ương nhất của Mỹ và Nam Mỹ

nước trang trại nuôi tôm (Lightner, 1996), và gần đây đã được

báo cáo trong Eritrea (Lightner và Redman, nộp). NHP là một

bệnh mạn tính causesmortalities lên đến 95% dân số tôm

phát triển ra khỏi ao (Lightner, 1996; Johnson, năm 1990) và bố mẹ

ao (Aranguren et al, 2006; Morales-Covarrubias et al, 2006.). Các

sự xuất hiện của NHP là liên quan đến điều kiện cụ thể về môi trường

chẳng hạn như nhiệt độ cao và độ mặn cao (Lightner, 1996; Vincent

Lotz, 2007). NHP-B-tôm bị nhiễm hiển thị một vỏ mềm điển hình,

trạng thái bình thường cơ quan, thờ ơ, giảm lượng thức ăn ăn và midgut trống rỗng

(Lightner, 1996). Gan tụy (HP) tổn thương trong giai đoạn cấp tính bao gồm

phản ứng dữ dội bên trong tế bào hemocytic, HP fewtomanymelanized

ống và hoại tử và bong tróc các tế bào biểu mô ống lượn HP. HP

tổn thương trong giai đoạn mãn tính bao gồm teo đánh dấu của ống và

giảm chiều cao tế bào biểu mô, lưu trữ chất béo thấp và intratubular

phù nề (Lightner, 1996).

Một số phương pháp phát hiện đã được phát triển để chẩn đoán và

xác nhận sự hiện diện của NHP-B bao gồm mô học, lai tạo tại chỗ,

PCR (Lightner, năm 1996; Loy et al, 1996; Nunan et al, 2008) và

mô miễn dịch (Bradley-Dunlop et al, 2004). Nghiên cứu duy nhất

trong đó NHP-B đã được định lượng, được phát triển bởi Vincent và

Lotz (2005), tuy nhiên, kết quả không phù hợp tải vi khuẩn

được tìm thấy trong phòng thí nghiệm của chúng tôi, do đó cần phải phát triển một giao thức mới.

Trong nuôi tôm Colombia, bệnh NHP hiếm khi được báo cáo từ

ao, thương mại ngay cả khi nhiệt độ và độ mặn trong

phạm vi thường được coi là thuận lợi cho phát triển bệnh.

Hơn nữa, trong những năm gần đây ở Colombia, các dấu hiệu nhiễm của NHP-B

đã được hạn chế cho các ao, xe tăng, trong đó cá bố mẹ được nuôi

và trưởng thành (Briñez et al, 2003;. Aranguren et al, 2006). Đó là

Đáng chú ý là Colombia lựa chọn ở mức độ nhân rộng

cá bố mẹ được thực hiện theo điều kiện có dịch bệnh đó như

Vibrio spp, IHHNV và những người khác được phổ biến trong thương mại phát triển

ra, không bị loại trừ.

Mục đích của nghiên cứu này là phát triển một giao thức qPCR cho

phát hiện và định lượng của NHP-B và đánh giá các NHP-B

sức đề kháng của hai quần thể tôm và để xác định NHP-B

tải trong những người sống sót. Ngoài ra, độ nhạy và độ đặc hiệu của qPCR

và xét nghiệm PCR thông thường được so sánh.

2. Vật liệu và phương pháp

Sự căng thẳng NHP-B được sử dụng trong nghiên cứu này, ban đầu fromTexas,

vui lòng cung cấp bởi Tiến sĩ H. Harris (Đại học bang Iowa) và đến

từ một hệ thống bảo trì dài hạn (Vincent et al, 2004;. Crabtree

et al, 2006). NHP-B bị nhiễm bệnh gan tụy (HP) đã được lưu trữ tại

-70 ° C trong nuôi trồng thủy sản Phòng thí nghiệm Bệnh học tại Đại học

Arizona cho đến khi được sử dụng để bắt đầu nhiễm trùng. Các loài tôm được sử dụng trong

Nuôi trồng thủy sản 307 (2010) 187-192

⁎ tác giả tương ứng. Cục Thú y và Vi sinh vật học, Đại học

Arizona, Tucson, 85721, USA. Điện thoại: +1 520 6214438, fax: + 1 520 6214899.

E-mail địa chỉ: [email protected], [email protected]

(L. F. Aranguren).

0044-8486 / $ - vấn đề trước © 2010 Elsevier BV. Tất cả các quyền.

doi: 10.1016/j.aquaculture.2010.07.022

Nội dung danh sách có sẵn tại ScienceDirect

Nuôi trồng thủy sản

tạp chí trang web: nghiên cứu www.elsevier.com / xác định vị trí / thủy onlinethis là Penaeus vannamei (Boone). Tôm Phân loại tư duy được sử dụng trong

nghiên cứu này đã theo Holthuis (1980).

2.1. Định lượng PCR (qPCR)

Primer Express phiên bản phần mềm 2.0 (Applied Biosystems) là

được sử dụng để thiết kế mồi và thăm dò thủy phân TaqMan (Áp dụng

Biosystems) từ số 16 S rRNA gene của NHP-B (GenBank U65509)

(Loy et al, 1996). Mồi NHP1300F: 5'-CGT TCA CGG GCC TTG TAC

AC-3 và NHP1366R: 5'-GCT CAT CGC CTT AAA GAA AAG ATA A-3 '

đã được sử dụng để sản xuất một đoạn là 67 bp. TaqMan thăm dò NHP: 5'-

CCG CCC GTC AAG CCA TGG AA-3 ', tương ứng với khu vực

từ nucleotide 1321-1340, được tổng hợp và được gắn nhãn

huỳnh quang thuốc nhuộm 6-carboxyfluorescein (FAM) trên 5 'và N, N, N, N-

tetramethyl-6-carboxyrhodamine (Tamra the) vào cuối '3.

Căn cứ tối ưu hóa các mồi và thăm dò thủy phân TaqMan

tập trung, phản ứng khuếch đại được thực hiện trong một trận chung kết

khối lượng 20 ml với 10 ml PerfeCTa qPCR SuperMix (Quanta,

Khoa học Sinh học), 0,3 mM mỗi mồi và 0,1 mM TaqMan thăm dò. Các

phản ứng hỗn hợp chứa 0,4 mg DNA. QPCR hồ sơ cá nhân bao gồm

3 phút ở 95 ° C tiếp theo là 40 chu kỳ 15 giây ở 95 ° C và 1 ở phút

60 ° C. Khuếch đại phát hiện và phân tích dữ liệu cho các xét nghiệm qPCR

thực hiện với chu chủ Realplex 2.0 (Eppendorf).

Để tạo ra một tiêu chuẩn DNA plasmid qPCR NHP khảo nghiệm,

primersNHP F1237: 5'-TGC AAC TCG AGA GCA TGA AG-3 và các NHP

1413R: 5'-CCC CAG TCA TCA CCT TTT CT-3 được sử dụng để tạo ra một

amplicon của 177 bp từ 16 NHP S rRNA. Các sản phẩm PCR được

làm sạch bằng cách sử dụng một bộ lọc QIAquick PCR (Qiagen). Các mảnh vỡ

ligated để một vector dễ dàng pGEM-T (Promega) và chuyển đổi thành

Escherichia coli JM109 tế bào (Promega). Các plasmid tái tổ hợp

pNHP1 được xác nhận của trình tự DNA với một DNA tự động

sequencer ABI Prism 3730xl (Applied Biosystems). Nồng độ

pNHP1was xác định bymeasuring mật độ quang ở 260 nm.

Mỗi mẫu được chạy trong ba lần và kết quả trung bình OD được sử dụng để

ước tính số lượng DNA hiện diện trong mỗi sample.When phân tích

các mẫu nước tinh khiết (Sigma, thuốc thử sinh học phân tử) trống

đã được sử dụng giữa các mẫu như một điều khiển. Ngoài ra, tỷ lệ 260:280

được sử dụng để xác định ô nhiễm protein. Số lượng bản sao DNA được

thu được bằng cách sử dụng công thức: (Số tiền của DNA trong ng) (Avogadro

số) / (650 Đà) (chiều dài của mẫu như bp) (Staroscik 2004). Các

nhạy cảm của qPCR được xác định bằng cách sử dụng pha loãng 10 lần của

tinh khiết pNHP1 plasmid. Khi vận chuyển, một tRNA nấm men được sử dụng trong một

nồng độ 10 ng / ml (GeneReach Công nghệ sinh học). Các nồng độ

tion của DNA plasmid sử dụng dao động từ 108

1 bản sao cho mỗi phản ứng. Các

khảo nghiệm được lặp đi lặp lại sáu lần để chứng minh khả năng tái.

2.2. Thử nghiệm thách thức

Các xét nghiệm thách thức đã được thực hiện tại các UAZ Nuôi trồng thủy sản

Bệnh học Phòng thí nghiệm (APL) trong thời gian 2008-2009. Được sử dụng trong các thử nghiệm này

là Taura Syndrome Virus (TSV), cụ thể chống mầm bệnh (TSV

SPR) P. tôm thẻ chân trắng từ Colombia và được xem như là dòng COL. Ngoài ra

usedwas cụ thể gây bệnh miễn phí (SPF) dòng P. tôm thẻ chân trắng, được chỉ định

như dòng Kona (Pruder et al, 1995), và thu được từ các đại dương

Viện. Averageweight của dòng fromboth tôm bắt đầu

của bài thi là 2,8 g ± 0,2 g. Tôm đã được gắn thẻ với đèn huỳnh quang

đàn hồi thẻ (Tây Bắc biển công nghệ ™) trong 6 bụng

phân khúc. Năm mươi fromeach dân số tôm được thả vào mỗi

ba 1000 l xe tăng. Twowere điều trị tankswhile tankwas sử dụng.

như một điều khiển. Nhiệt độ được điều chỉnh tới 30 ° C và độ mặn 30 ppt,

được coi là điều kiện tối ưu cho sự phát triển của

Bệnh NHP-B (Lightner, 1996; Vincent và Lotz, 2007). Tôm

infectedwith NHP-B inoculumgenerated như được mô tả trước (Vincent

et al, 2004; Crabtree et al, 2006).

Tôm được tiêm gavage đảo ngược. Trong ngắn gọn, 10 bị nhiễm

tôm được lấy từ hệ thống dài termmaintenance và

HP đã được cắt bỏ và trọng. Sau đó, HPS được kết hợp với 2,5%

dung dịch muối trong một tỷ lệ 1:2, (w / v.) hỗn hợp mặt đất cho đến khi

đồng nhất và sau đó ly tâm ở 6000 × g trong 1 phút. Các

bề được trộn với một loại thuốc nhuộm thực phẩm màu đỏ thương mại trong một tỷ lệ

1000:3 (v / v). Tôm đã bị bỏ đói trong 24 giờ trước khi nhiễm trùng

quá trình để tránh bất kỳ cản trở bởi phân trong đường tiêu hóa. By

bằng cách sử dụng một pipette tự động, một ml 100 inoculumwas giới thiệu trong

tôm hậu môn khoang pha chế inoculumslowly để tránh chấn thương

hiệu ứng. Hiện nay thuốc nhuộm màu đỏ trong các quan sát inoculumfacilitated

sự ra đời của các inoculumfirst vào hindgut, sau đó vào

midgut và gan tụy. Hiện nay tôm trong bể điều khiển

được tiêm gavage đảo ngược bằng cách sử dụng một giải pháp 0,85% dung dịch muối.

Bắt đầu từ 12 h sau khi quá trình tiêm chủng, được cho ăn shrimpwere một lần

ngày với thức ăn viên thương mại (Rangen 35%, Buhl, Idaho).

Tỷ lệ tử vong được ghi nhận hàng ngày từ khi bắt đầu thí nghiệm.

Tôm hấp hối đã được cố định trong Davidson AFA định hình (Chuông

Lightner, 1988) và phân tích bằng mô học để xác minh tình trạng bệnh của họ.

Động vật chết được đông lạnh và được lưu trữ ở -70 ° C cho phân tích PCR.

Bảy lần trong quá trình thử nghiệm, tôm đã được gỡ bỏ từ

xe tăng thử nghiệm, tính và trả lại cho xe tăng để

xác định sự tồn tại tại mỗi điểm thời gian cho mỗi dân số. Phân

mẫu đã được thực hiện hàng tuần trong mỗi bể chứa. Vào cuối của thách thức

(116 ngày sau tiêm chủng, dpi), HPS từ tất cả các người sống sót

bảo quản trong 95% (v / v) ethanol/dH2O phân tử lớp chuẩn bị từ

phân tử lớp 100% ethanol (Decon, Labs, Inc) để xác định

NHP-B tải trong mỗi quần thể bằng cách phân tích qPCR.

2.3. DNA chiết xuất

Khai thác DNA được thực hiện cho cả hai quần fromsamples

bảo quản trong ethanol 95%. Khoảng 25-50 mg cá nhân HP

được sử dụng để chiết xuất DNA bằng cách sử dụng mẫu PCR tinh khiết cao

chuẩn bị kit (Roche chẩn đoán) theo quy định của nhà sản xuất

giao thức và được lưu trữ tại -20 ° C cho đến khi phân tích sâu hơn.

2.4. PCR

Oligonucleotide mồi NHPF2: 5'-CGT TGG AGG TTC GTC CTT CAG

T-3 'và NHPR2: 5'-GCC ATG AGG ACC TGA CAT CAT C-3,

tạo ra một amplicon 379 bp, được sử dụng trong PCR thông thường

phân tích (Nunan et al, 2008). Nồng độ mồi (F2/R2) được sử dụng cho

eachwas 0,31 mM. PCRwas tiến hành trong một thể tích cuối cùng là 25 ml. PuRetaq

Ready-to-PCR hạt (GE Healthcare) đã được sử dụng. Việc đi xe đạp

các thông số như sau: 1 chu kỳ ở 95 ° C tiếp theo là 25 chu kỳ

60 ° C trong 30 giây, 72 ° C tại 30 giây và 95 ° C trong 30 giây, và kết thúc với một trận chung kết

mở rộng ở 60 ° C trong 1 phút và 72 ° C trong 2 phút. Tất cả các amplificationswere

thực hiện trong một chu EppendorfMaster. Sau amplifications,

Các sản phẩm PCR được electrophoresed 1,5% agarose gel có chứa

0,5 μgml

-1

ethidium bromide và hình dưới ánh sáng tia cực tím

và kỹ thuật số chụp ảnh bằng AlphaImager (Alpha Innotech).

2.5. Phân tích thống kê

Các phân tích thống kê được thực hiện trong STATA IC10. So sánh

vi khuẩn tải có nghĩa là ± SE đã được xác định bởi hai mặt t-test

(Α = 0,05). Phân tích tồn tại được xác định bởi các Kaplan

Phân tích sự tồn tại Meier (Kaplan và Meier, 1958).

3. Kết quả

3.1. Phân tích đặc trưng của qPCR

Các đặc trưng phân tích của các qPCR NHP được xác định bằng

sử dụng các vi sinh vật khác nhau bao gồm cả NHP-B từ hai khác nhau

nguồn gốc (Texas andMexico). DNA chiết xuất fromshrimp nhiễm

bệnh virus, bao gồm cả WSSV, IHHNV, HPV, và MBV và vi khuẩn

188 L. F. Aranguren et al. / Nuôi trồng thủy sản 307 (2010) 187-192diseases Spiroplasma penaei, vi khuẩn Vibrio spp., Và một rickettsia-như

vi khuẩn phân lập từ Madagascar, được sử dụng như là các mẫu.

Kết quả âm tính được tìm thấy với tất cả các vi sinh vật khác.

Các kết quả chỉ được tìm thấy trong các mẫu DNA rằng

có NHP-B từ Texas và Mexico.

3.2. Phân tích độ nhạy cảm của qPCR

Để xác định độ nhạy phân tích của qPCR NHP, một bp 177

NHP mảnh vỡ có chứa các trình tự mục tiêu của qPCR được sử dụng như một

tiêu chuẩn bằng cách kiểm tra các pha loãng nối tiếp từ 1 × 100

1 × 108

bản. Nó

đã được tìm thấy tại 10 bản của NHP-B đã được phát hiện trong hai trong số sáu

xét nghiệm, trong khi 100 bản đã được phát hiện trong tất cả các xét nghiệm với một 0,5

có nghĩa là Độ lệch chuẩn (SD) (Bảng 1), do đó các giới hạn phát hiện

coi là 100 bản (Hình 1). Để xác định các khả năng tái

qPCR NHP, sáu đường cong tiêu chuẩn được so sánh trên một bản ghi-7

khoảng 100-1 × 108

bản sao cho mỗi phản ứng (Bảng 1).

SD trong mỗi runwas giữa 0,0 đến 1,1 trong 102

bản sao và 0,1

đến 0,3 108

bản. Đối với các dữ liệu kết hợp fromthe sáu độc lập

chạy, therewasno tuyến tính mối quan hệ giữa SDand định lượng

chu kỳ Cq giá trị (trước đây gọi là ngưỡng chu kỳ) (Bustin et al, 2009),

(PN0.05), cho thấy consistencies trong pippeting. Đối với khảo nghiệm liên

sao chép, các giá trị SD giữa 0,2 và 0,8 đã được tìm thấy, cho thấy

độ tin cậy tốt trong khảo nghiệm này. Các R2

sáu đường cong tiêu chuẩn được

luôn luôn lớn hơn 0,98, cho thấy khả năng tái tốt, và cũng có thể,

giá trị hiệu quả phản ứng dao động giữa 0,97 và 1,06 cho thấy

tối ưu hóa các giao thức (Hình 1).

3.3. Thách thức thử nghiệm

Nhiễm trùng NHP-B đã được khẳng định trong những chiếc xe tăng bị nhiễm bệnh trong

thách thức kiểm tra bằng cách sử dụng các phần mô học của gan tụy.

Tổn thương điển hình của nhiễm trùng NHP-B, bao gồm cả sự xâm nhập hemocyte và

u hạt trong HP với phù intratubular, được quan sát thấy ở

triệu chứng tôm. Các động vật lấy mẫu từ bể điều khiển

xét nghiệm âm tính NHP-B bằng phương pháp PCR và qPCR. Đỉnh cao tỷ lệ tử vong

tìm thấy được giữa 35 và 63 d.p.i. Sau khi 116 d.p.i, tôm

từ mỗi dân số được tính và sự tồn tại cuối cùng là

xác định (Bảng 2). Đường cong sống sót tương tự trong hai

xe tăng bị nhiễm bệnh (dữ liệu không hiển thị).

Với mô hình tồn tại tương tự trong hai xe tăng bị nhiễm bệnh (pN0.05),

sự tồn tại kết quả dữ liệu đã được gộp lại và phân tích bởi các Kaplan

Phân tích sự tồn tại Meier. Đường cong sống sót của dân COL

lớn hơn đáng kể so với dân số SPF Kona (p = 0.0002)

(Bảng 2). Thời gian ước tính cho sự sống còn 75% là 35 ngày trong Kona

đường dây, so với 77 ngày trong dân số COL. Sự tồn tại cuối cùng tại

cuối của nghiên cứu sau 116 ngày là 41% trong Kona và 71% trong

COL dân số (Hình 2).

3.4. HP và phân định lượng

Mười bốn tôm mỗi mỗi dân số trung bình trong mỗi bể chứa được phân tích

NHP qPCR. Trong bể 1, 100% của những người sống sót fromthe COL và Kona

dân số cho thấy NHP-B trong HP, trong khi trong bể 2, 78,5%

người sống sót từ mỗi dân số đã đưa ra một khảo nghiệm qPCR tích cực cho NHP-B.

Trong bể 1, NHP-B bản sao số trong dân số COL dao động từ

2,8 × 103

đến 4,5 × 107

bản sao mg-1

DNA được quan sát thấy trong khi ở

dân số Kona bản sao NHP-B mg-1

DNA từ

3,0 × 102

đến 8,8 × 107

. Trong bể 2 bản sao số NHP-B trình bày trong

populationwere COL from0 đến 3,1 × 102

bản sao mg-1

DNA. Trong

Kona dân số khoảng 0-3,3 × 102

bản sao mg-1

của

DNA. Không có sự khác biệt đáng kể trong NHP-B có nghĩa là bản sao

số giữa các quần thể một trong hai bể (pN0.05) (Bảng 3).

Tất cả các mẫu phân tích cực cho NHP qPCR trong bể 1 (10/10)

có nghĩa là số lượng bản sao 4,2 × 106

bản sao mg-1

DNA Trong bể 2, 83,3%

(10/12) của các mẫu đã được tích cực, với một số lượng bản sao trung bình của

4,3 × 103

bản sao mg-1

DNA.

3.5. So sánh các NHP qPCR vs PCR

Tất cả các mẫu được điều hành bởi qPCR cũng đã được điều hành bởi thông thường

NHP PCR được mô tả bởi Nunan et al. (2008). By qPCR, tất cả các mẫu HP

tích cực trong bể 1, tuy nhiên thông thường PCR chỉ có 75%

các mẫu này là tích cực. Có nghĩa là số lượng bản sao của tiêu cực

Bảng 1

Độ lặp lại của qPCR thời gian thực TaqMan trong sáu xét nghiệm khác nhau. SD: độ lệch chuẩn; Cq: xác định số lượng chu kỳ.

NHP

bản sao

Nội khảo nghiệm SD (trung bình Cq giá trị so với bản sao) liên khảo nghiệm SD

(Có nghĩa là Cq giá trị)

123456

1 × 102

1.1 (36,5) 0,6 (36,2) 0,7 (36,4) 0,7 (36,3) 0.0 (35,3) 0,1 (35,8) 0,5 (36,1)

1 × 103

0,2 (32,8) 0,1 (33,2) 0,1 (32.0) 0,8 (33.0) 0,4 (31,6) 3.1 (34,2) 0,8 (32,8)

1 × 104

0,5 (29,9) 0,2 (29,4) 0,2 (29,3) 1.2 (30,1) 1.2 (30,1) 1.3 (29,6) 0,8 (29,7)

1 × 105

0,1 (25,7) 0,4 (26,4) 0,2 (25,6) 0,2 (25,8) 0,3 (25,4) 0.0 (25,1) 0,2 (25,7)

1 × 106

0,1 (22,2) 0,3 (22,5) 0.0 (22,4) 0,3 (22,2) 0,2 (21.0) 0.0 (22,1) 0,2 (22,1)

1 × 107

0,1 (18,9) 0,1 (18,8) 0,1 (19.0) 0,2 (18,7) 0,2 (17,9) 0,3 (18,5) 0,2 (18,6)

1 × 108

0,1 (15,6) 0,2 (15,5) 0,3 (16,1) 0,1 (16.0) 0,2 (15,3) 0,1 (15,6) 0,2 (15,7)

Hình 1. Tiêu chuẩn đường cong của bản sao số NHP-B vs Cq (chu kỳ xác định số lượng) giá trị. Tinh khiết pNHP1 plasmid serially pha loãng từ 1 × 108

10 bản và được sử dụng làm mẫu trong

qPCR.

189 L. F. Aranguren et al. / Nuôi trồng thủy sản 307 (2010) 187-192samples bằng phương pháp PCR là 2,6 × 103

bản sao mg-1

DNA từ

3,0 × 102

lên 4,6 × 103

, Trong khi số lượng bản sao có nghĩa là trong tích cực

mẫu bằng phương pháp PCR là 2,8 × 107

bản sao mg-1

DNA và dao động từ

5,3 × 103

đến 8,8 × 107

. Trong bể 2, cho thấy sự sống còn cao hơn,

% các trường hợp tích cực của NHP-B qPCR trong các mẫu HP là 78,5%.

PCR, chỉ có 14,2% các mẫu này là tích cực. Bản sao có nghĩa là

con số này là 1,2 × 102

bản sao mg-1

DNA (Bảng 3).

Một cách tiếp cận để xác minh sự khác biệt về độ nhạy cảm giữa

NHP qPCR và NHP-B PCR, một mẫu dương tính với một bản sao được biết đến

(8,7 × 107

bản sao mg-1

DNA) là việc sử dụng pha loãng nối tiếp

từ 107

đến 101

. Đây là loạt pha loãng mẫu đã được điều hành bởi cả hai PCR

và qPCR. By qPCR tất cả các mẫu đã được tích cực. Cùng một mẫu

chạy bằng phương pháp PCR cho thấy rằng chỉ có những mẫu với một bản sao vi khuẩn cao

số dương tính (8,7 × 107

, 8,7 × 106

và 8,7 × 105

) (Hình 3A).

Mẫu với 8,7 × 104

và thấp hơn không được phát hiện với NHP-B

PCR xét nghiệm (25 chu kỳ).

Sau khi tăng chu kỳ PCR đến 35, mà không thay đổi bất kỳ khác

tham số trong giao thức PCR, tăng trong việc phát hiện của NHP-B

đã được quan sát (Hình 3B). Mẫu 3 (8,7 × 103

) Và 4 (8,7 × 104

) Mà

tiêu cực trong 25 chu kỳ PCR, kết quả dương tính sau 35 chu kỳ,

cho thấy một sự gia tăng 2 đăng nhập vào sự nhạy cảm của khảo nghiệm với điều này

sửa đổi.

Phân tích tương tự được tiến hành với các mẫu HP từ bể

1. Sau 35 chu kỳ, năm trong bảy mẫu thatwere ban đầu tiêu cực

đã được tìm thấy là tích cực. Có nghĩa là số lượng bản sao của những năm

mẫu được 2,7 × 103

.

4. Thảo luận

Trong nghiên cứu này, một xét nghiệm PCR định lượng được phát triển để phát hiện và

định lượng NHP-B trong các mô tôm. Giới hạn phát hiện của qPCR này

1 × 102

bản. Trình tự từ pNHP1 cho thấy 100%

sắc với mảnh vỡ của 16 NHP chuỗi S rRNA báo cáo

Loy et al. (1996). Với NHP-B từ hai địa lý khác nhau

khu vực (Mexico và Texas) và một số tác nhân gây bệnh tôm,

chỉ có kết quả tích cực được tìm thấy với hai NHP-B phân lập,

cho thấy tính đặc hiệu cao khảo nghiệm này. Nghiên cứu duy nhất trong đó

NHP-B đã được định lượng đã được phát triển bởi Vincent và Lotz

(2005). Trong nghiên cứu (2005) Vincent và Lotz, một giới hạn phát hiện của 10

copieswas reportedwhen 5 ml của mẫu DNA mẫu sau 45 chu kỳ

được sử dụng. Hơn nữa, khi khảo nghiệm này được sử dụng trong nghiên cứu này,

kết quả không phù hợp được tìm thấy với số lượng bản sao. Trong và Vincent

Lotz giao thức, các mẫu đã được mạnh mẽ tích cực của truyền thống

PCR (giới hạn phát hiện khoảng 105

), Đã đưa ra một số lượng bản sao thấp (từ 0

và 5 × 102

) Với các giao thức qNHP-B, cho thấy đánh giá thấp

số lượng bản sao của vi khuẩn. Kết quả tương tự đã được tìm thấy trước đây

trong phòng thí nghiệm của chúng tôi (B. Poulos, dữ liệu chưa được công bố). Tuy nhiên, lý do

hiệu quả khuếch đại thấp với Vincent và Lotz (2005)

khảo nghiệm là không rõ ràng.

Không có sự khác biệt tải NHP-B cuối cùng đã được tìm thấy giữa COL và

Kona trong một trong hai xe tăng-B NHP thách thức (pN0.05). Rất ít

nghiên cứu đã được tập trung vào định lượng tải virus / vi khuẩn

tôm dân số. Srisuvan et al. (2006) thấy rằng sau khi TSV

thách thức thử nghiệm trong hai quần thể, TSV dòng kháng và dễ bị

SPF Kona dòng, TSV tải lượng virus lớn trong dòng SPF Kona

hơn so với các dòng kháng TSV. Ngược lại, trong thí nghiệm của chúng tôi không có

sự khác biệt trong tải NHP-B đã được tìm thấy, có thể vì sức đề kháng

cơ chế trong vi khuẩn là khác nhau từ virus.

Mặc dù rằng hai xe tăng điều trị được tiếp xúc cùng một

NHP cấy, tải vi khuẩn trong cả hai HPS và phân cao

tôm từ xe tăng 1 (pb0.05). Điều này là kết quả của một

hoạt động nhân vi khuẩn và nhiễm trùng nặng trong tôm.

Giảm tải vi khuẩn trong bể 2 có thể liên quan một còn

prepatent giai đoạn và do đó tỷ lệ tử vong đã bị trì hoãn. Gắn thẻ hai

quần thể khác nhau trong cùng một bể cho phép trực tiếp

so sánh giữa quần thể bất kể mức độ nhiễm trùng khác nhau

giữa xe tăng.

Trong một thử nghiệm thách thức 60 ngày NHP-B sử dụng SPF Kona dòng, sự sống còn

giữa 0 và 30% sau khi nhiễm bệnh hoặc tươi hoặc đông lạnh

chuẩn bị của NHP-B (Crabtree et al, 2006). Điều này so sánh với

48% sống trong các thí nghiệm của chúng tôi ước tính fromthe Kaplan phân tích tại

60 ngày kể từ ngày bài bị nhiễm trùng. Dân số COL rõ ràng là khả năng chống

NHP-B hơn dân số Kona SPF lớn hơn đáng kể

tồn tại (Hình 2). Mức cao sức đề kháng của dân số COL

phù hợp với tỷ lệ nhiễm trùng rất thấp bởi NHP-B

thương mại phát triển ao ở Colombia. Hầu hết các nước trong

Mỹ trang trại P. tôm thẻ chân trắng có tập phim của NHP. Quốc gia,

bao gồm Peru, Ecuador, Venezuela, Brazil, Mexico và Trung

Các nước Mỹ, có báo cáo dịch NHP trong người chưa thành niên

giai đoạn tỉ lệ chết gây ra khoảng 50-99% (Lightner, 1996).

Không giống như các nước khác, NHP ở Colombia chỉ có được báo cáo trong

ao cá bố mẹ và chỉ là một trường hợp rất ít có được tìm thấy trong phát triển

trong ao (Briñez et al, 2003). Mặc dù có nhiệt độ và

Bảng 2

Thời sự sống còn của hai Penaeus vannamei dân số bị nhiễm NHP-B bằng cách đảo ngược

gavage.

Bể điều khiển

(%)

Điều trị xe tăng (%)

1 2 trung bình

COL 92 60 82 71

Kona 90 32 50 41

Hình 2. Tích lũy sự sống còn của COL và Kona Penaeus vannamei dân số thách thức

NHP-B. COL (rắn vuông) (n = 100) và Kona (hình tam giác vững chắc) (n = 100);

Controls (tiêu tan đường) n = 50. Có nghĩa là ± SE mỗi bản sao.

Bảng 3

Trung bình ± sai số chuẩn của NHP mg bản sao B-1

của DNA trong các mẫu HP COL và Kona tôm Penaeus dân số tôm thẻ chân trắng trong hồ 1 và 2 sau khi thử nghiệm thách thức NHP-B.

Xe tăng xe tăng 1 xe tăng 2

Dân số tôm bị nhiễm bệnh (%)

(N)

Bản sao mg-1

của DNA ± SE

(N = 14)

Tôm bị nhiễm bệnh (%)

(N)

Bản sao mg-1

của DNA ± SE

(N = 11)

COL 100,0 (14/14) 1,61 × 107

± 4,59 × 106

78,5 (11/14) 1,24 × 102

± 2,88 × 101

Kona 100,0 (14/14) 1,52 × 107

± 7,57 × 106

78,5 (11/14) 1,21 × 102

± 3,14 × 101

190 L. F. Aranguren et al. / Nuôi trồng thủy sản 307 (2010) 187-192salinity điều kiện có lợi cho dịch NHP, bệnh dường như được

hạn chế để phụ người lớn và các ao cá bố mẹ ở Colombia.

Cuộc kháng chiến của dân số COL NHP-B bị nhiễm trùng có thể được

liên quan đến quá trình lựa chọn cho sức đề kháng để TSV. Trong thời gian 1992 -

1995 hầu hết các nước Mỹ Latinh tăng P. tôm thẻ chân trắng

bị ảnh hưởng bởi hội chứng Taura gây thiệt hại lớn trong

ngành công nghiệp tôm. Một số programswere tôm giống bắt đầu

tại thời điểm này để phát triển các quần thể kháng TSV. Ở Colombia,

tôm công nghiệp thiết lập một chương trình lựa chọn đại chúng, trong đó người trồng

lựa chọn tôm còn sống sót fromthe cao TSV ao bị ảnh hưởng (Cock và cộng sự

al, 2009). Ba nhà sản xuất lớn nhất ở bờ biển Ca-ri-bê đã bắt đầu

nâng cao những người sống sót từ nhiều ao hồ bị nhiễm TSV. Những trang trại

thường có độ mặn dao động from10-15 ppt vào mùa mưa

35-40 ppt trong mùa khô, nhiệt độ trung bình hàng năm

thường dao động từ 24 ° C đến 32 ° C, điều kiện môi trường

NHP-B có thể gây bùng phát dịch bệnh (Frelier et al, 1992.

Lightner, 1996). Mặc dù mỗi trang trại có lựa chọn riêng của mình và

nhân giao thức, thực hành phổ biến nhất bao gồm các

chuyển giao những người sống sót từ một cái ao thương mại phát triển ra vào khoảng

4 tháng đến một ao mật độ dân số thấp hơn trước khi được chuyển giao

phòng thí nghiệm trưởng thành. Trong mỗi chuyển, lớn khỏe mạnh tôm

không có dị tật, các cơ quan trạng thái bình thường hoặc melanization được chuyển

giai đoạn tiếp theo. Rõ ràng, không xuất hiện bất thường hoặc hấp hối

tôm thông qua từ một trong những giai đoạn tiếp theo trong này bố mẹ

sản xuất chương trình.

NHP-B đã được báo cáo tại các người lớn và bố mẹ dân số

tions trong các trang trại nơi lựa chọn đại chúng được thực hiện với cao

phổ biến trong một số ao (Briñez et al, 2003; Aranguren et al, 2006.).

NHP dấu hiệu lâm sàng điển hình trong tôm có triệu chứng mềm vỏ và

trạng thái bình thường cơ quan. Do đó, một chương trình lựa chọn đại chúng có vẻ như hướng đến

TSV sức đề kháng, nhưng sử dụng như là tiêu chí lựa chọn sự sống còn và

loại bỏ các động vật có vỏ mềm và các cơ quan trạng thái bình thường, trong

sự hiện diện của cả hai TSV và NHP-B đồng thời sẽ lựa chọn cho

đề kháng với cả hai TSV và NHP-B. Áp lực chọn lọc ban đầu

phát triển ra khỏi giai đoạn có thể có được thấp do mức độ thấp của NHP-B

gặp phải trong ao nuôi thịt. Tuy nhiên, do gần như liên tục

sự hiện diện của NHP-B trong ao nuôi cá bố mẹ, tôm không bị nhiễm bệnh trong các

lựa chọn ban đầu từ thương mại phát triển ra khỏi ao có thể sẽ có

bị thách thức bởi NHP-B trong giai đoạn trưởng thành trong các bố mẹ

ao. Vì vậy, lựa chọn cho NHP-B resistancewould có thể được

tăng cường tiếp xúc liên tục NHP-B là các chính

bệnh hiện diện trong các ao cá bố mẹ. Cuộc kháng chiến thu được trong

cách này hoặc có thể là đề kháng với nhiễm trùng hoặc khả năng

tồn tại và phát triển khi các hãng không có triệu chứng. Aranguren et al. (2006)

cho thấy rằng các tàu sân bay không có triệu chứng, hoặc động vật có dấu hiệu hạn chế

nhiễm trùng, có khả năng sinh sản, cho thấy mà selectionmay có

được cho kháng chiến ở động vật không có triệu chứng hoặc những người cho thấy thấp

mức độ biểu hiện bệnh. Quan điểm này được hỗ trợ bởi sự thiếu

sự khác biệt trong-B tải NHP SPF Kona dễ bị đường dây và

quần thể kháng COL. Trong các bệnh mãn tính như NHP, sức đề kháng

thường xuyên kiểm soát bởi nhiều gen (Rolff và Siva-Jothy, năm 2003)

và lựa chọn nhiều hơn chu kỳ là có khả năng tăng tần suất

những gen trong quần thể cung cấp sức đề kháng ổn định,

không đột ngột phá vỡ với sự tiến hóa của giống mới

của các đại lý quan hệ nhân quả. Như vậy, việc lựa chọn không có kế hoạch nhiều hơn chu kỳ

đề kháng với NHP, có thể giải thích tỷ lệ rất thấp của NHP

bệnh phát triển ao, hạn chế NHP những ao nơi

chất lượng nước và các yếu tố chưa biết khác có lợi cho sự biểu hiện của NHP

B lây nhiễm.

TSV kháng đường dây đã được lựa chọn trong sự vắng mặt của NHP-B

đã được sử dụng bởi những người trồng thương mại ở Trung và Nam Mỹ.

Trong những lĩnh vực, nghiêm trọng dịch NHP-B đã được báo cáo (Lightner

và Redman, gửi cho xuất bản; Morales-Covarrubias et al.

2006), cho thấy rằng TSV không trao một kháng tổng quát

tác nhân gây bệnh khác bao gồm cả NHP-B.

Tóm lại, chúng tôi mô tả ở đây một timemethod thực cho việc chẩn đoán

và định lượng của NHP-B trong HP tôm và các mẫu phân. Các

khảo nghiệm là cụ thể và nhạy cảm. Độ nhạy của NHP thông thường

PCR có thể được tăng lên đến một giới hạn phát hiện của 103

bản sao bằng cách tăng

số lượng các chu kỳ PCR đến 35. Dân số COL, lựa chọn cho

nhiều thế hệ trong sự hiện diện của nhiễm trùng NHP-B,

đề kháng với NHP bệnh hơn so với dòng Kona SPF. Tỷ lệ thấp

NHP trong ao nuôi thịt thương mại ở Colombia có thể là một kết quả của

sức đề kháng của quần thể COL.

Lời cảm ơn

Công trình này được hỗ trợ bởi Phòng thí nghiệm nghiên cứu bờ biển vùng Vịnh

Hiệp hội Nuôi tôm biển Chương trình, USDA Grant số

USMSFD 2009/19851-UAZ và SK cấp No: NA09NMF4270102

NOAA. Chúng tôi cảm ơn Tiến sĩ Marcela Salazar và Cock Tiến sĩ James cho

quan trọng xem xét các bản thảo này, Linda Nunan và Brenda Noble

cung cấp hỗ trợ kỹ thuật, Rita Redman cho mô học

dịch vụ và Tiến sĩ H. Harris để cung cấp các mô NHP-B bị nhiễm bệnh.

Tài liệu tham khảo

Aranguren, LF, Briñez, B., Aragon, L., Platz, C., Caraballo, X., Suarez, A., Salazar, M. năm 2006.

Hepatopancreatitis hoại tử (NHP) bị nhiễm Penaeus tôm thẻ chân trắng bố mẹ-nữ

chứng khoán: ảnh hưởng đến sinh sản nauplii các thông số và chất lượng ấu trùng. Nuôi trồng thủy sản

258, 337-343.

Bell, T.A., Lightner, D.V., 1988. Sách hướng dẫn của Mô học bình thường tôm Penaeid.Đặc biệt

Xuất bản Thế giới Nuôi trồng thủy sản Hiệp hội, Baton Rouge, LA.

Bradley-Dunlop, DJ, Pantoja, C., Lightner, DV, năm 2004. Phát triển của đơn dòng

kháng thể để phát hiện hoại tử hepatopancreatitis tôm penaeid.

Dis. Aquat. Org. 60, 233-240.

Briñez, B., Aranguren, F., Salazar, M., 2003. Mẫu phân là nguồn DNA cho

chẩn đoán hepatopancreatitis hoại tử (NHP) ở tôm thẻ chân trắng Penaeus bố mẹ.

Dis. Aquat. Org. 69, 55-72.

Bustin, S., Garson, J., Hellemans, J., Huggett, J., Kubista, M., Mueller, R., Nolan, T., Pfaffl

M., Shipley, G., Vandesompele, J., Wittwer, C., 2009. MIQE hướng dẫn: tối thiểu

thông tin cho công bố số lượng thí nghiệm PCR thời gian thực. Clin. Chem.

55 (4), 611-622.

Cock, J., Gitterle, T., Salazar, M., Rye, M., 2009. Chăn nuôi cho khả năng kháng bệnh của penaeid

tôm. Nuôi trồng thủy sản 286, 1-11.

Crabtree, BG, Erdman, MM, Harris, DL, Harris, CNTT năm 2006. Bảo quản của hoại tử

hepatopancreatitis vi khuẩn (NHPB) bằng cách mô đông lạnh từ kinh nghiệm thu thập

tinh thần bị nhiễm bệnh tôm thẻ chân trắng Litopenaeus. Dis. Aquat. Org. 70, 175-179.

Frelier, PF, Sis, RF, Bell, TA, Lewis, DH năm 1992. Nghiên cứu bằng kính hiển vi và siêu

hoại tử hepatopancreatitis trong tôm Thái Bình Dương trắng (Penaeus vannamei)

nuôi trong Texas. Vet. Pathol. 29, 269-277.

Hình 3. NHP-B kết quả bằng cách sử dụng thông thường PCR.A NHP: 25 chu kỳ, B: 35 chu kỳ. Mẫu 1: 8,7 × 101

, 2: 8,7 × 102

, 3: 8,7 × 103

, 4: 8,7 × 104

, 5: 8,7 × 105

, 6: 8,7 × 106

, 7: 8,7 × 107

, NTC: Không

mẫu kiểm soát, + C: tích cực kiểm soát, M: 100 bp thang.

191 L. F. Aranguren et al. / Nuôi trồng thủy sản 307 (2010) 187-192Holthuis, LB, 1980.Loài danh mục. Vol. 1 - tôm và tôm của thế giới. FAO

Tóm tắt Thủy sản số 125. FAO, Rome. 271 trang

Johnson, S.K., năm 1990. Sổ tay bệnh tôm. Texas A & M Sea Grant College

Chương trình Galveston, TX.

Kaplan, E.L., Meier, P., năm 1958. Nonparametric dự toán fromincomplete quan sát. J.

Am. Stat. PGS. 53, 457-481.

Lightner, D.V. năm 1996. Sách hướng dẫn Bệnh Học tôm và các thủ tục chẩn đoán cho

Các bệnh của tôm Penaeid nuôi. Thế giới nuôi trồng thủy sản Hiệp hội, Baton Rouge,

Louisiana.

Lightner, D.V., Redman, R.M. năm 1994. Một bịnh dịch thú hepatopancreatitis hoại tử

nuôi tôm penaeid (giáp xác: decapoda) ở tây bắc Peru. Nuôi trồng thủy sản

122, 9-18.

Lightner, D.V., Redman R.M., trên báo chí. Tình trạng toàn cầu của các bệnh truyền nhiễm đáng kể

tôm nuôi. Kỷ yếu các công nghệ tích hợp cho tôm tiên tiến

sản xuất. Nuôi trồng thủy sản chương trình trao đổi, 2009. Hội thảo, 13-15,

Năm 2009, Honolulu, Hawaii. Ấn phẩm đặc biệt của Tạp chí Hiệp hội Thủy sản châu Á.

Loy, JK, Frelier, PF, Varner, P., Templeton, JW, 1996. Phát hiện của tác nhân bệnh nguyên của

hoại tử hepatopancreatitis trong Penaeus nuôi tôm thẻ chân trắng từ Texas và Peru

bằng phản ứng chuỗi polymerase. Dis. Aquat. Org. 25, 117-122.

Morales-Covarrubias, MS, Osuna-Duarte, AG, Garcia-Gasca, A. năm 2006. Tỷ lệ hiện

hoại tử hepatopancreatitis nữ bố mẹ của tôm thẻ chân trắng Penaeus

tôm thẻ chân trắng với cắt bỏ eyetalk đơn phương và tiêm hormone. J. Aquat. Động vật

18 Y tế, 019-025.

Nunan, M.L., Pantoja, C., Lightner, D.V., 2008. Cải thiện một phương pháp PCR cho

phát hiện hoại tử hepatopancreatitis trong tôm. Dis. Aquat. Org. 80, 69-73.

Pruder, GD, Brown, CL, chứng gầy mòn bắp thịt ngựa, JN, Carr, WH năm 1995. Hệ thống sức khỏe tôm:

hạt giống cung cấp lý thuyết và thực hành. In: Browdy, C.L., Hopkins, J.S. (Eds.), bơi

Thông qua nước Gặp rắc rối. Thế giới Nuôi trồng thủy sản Hiệp hội, Baton Rouge, LA, trang 40-52.

Rolff, J., Siva-Jothy, M.T. năm 2003. Không xương sống sinh thái miễn dịch học. Khoa học 301,

472-475.

Dis. Aquat. Org.

Vincent, A.G., Lotz, J.M., năm 2005. Thời gian khoá học của hepatopancreatitis hoại tử (NHP)

bằng cách sử dụng real-time PCR. Dis. Aquat. Org. 67, 163-169.

Dis.

Aquat. Org.

Vincent, A.G., Breland, V.M., Lotz, J.M. năm 2004. Thí nghiệm nhiễm trùng trắng Thái Bình Dương

Dis. Aquat. Org. 61, 227-233.