Câu 12: Khái niệm thư viện cDNA.  Phương pháp xây dựng thư viện cDNA và phát hiện dòng cần tìm:

1. Khái niệm thư viện cDNA:

Ngân hàng cDNA là tập hợp các bản sao cDNA từ tất cả các mRNA của 1 tế bào. Như vậy ngân hàng được thiết lập từ một loại tế bào xác định ( tế bào biệt hóa ) vì thế cDNA mang tính tế bào rất cao.

Mục đích của việc thiết lập ngân hàng cDNA là nhằm nghiên cứu sự biểu hiện của một gen xác định cùng với những vấn đề liên quan đến sự điều hòa biểu hiện gen cũng như mối tương tác giữa các gen trong một quá trình sống.

2. Phương pháp xây dựng:

_ Chiết tách RNA tổng số, ta phải chọn tế bào chứa nhiều mRNA cần thiết và sau đó làm sạch mRNA,

_ Chọn lựa các mRNA chứa nhiều A ( poly A ) bằng cách tách trên cột xenlulose oligo dT,

_ Tổng hợp cDNA sợi kép đầu bằng từ mRNA dưới tác dụng của E sao chép ngược nhờ kỹ thuật nuclease S1 hoặc kỹ thuật Gubler_hoffman,

_ Metyl hóa các vùng hạn chế ( có trong đoạn cDNA đôi ) được nhận biết bởi E EcoRI để vùng này không bị cắt khi thao tác với EcoRI,

_ Tạo đầu dính bắng cách sử dụng đoạn nối linker có trình tự nhận biết bởi EcoRI. Trong trường hợp này chỉ có đoạn nối bị cắt còn cDNA vẫn còn nguyên vẹn  (do được metyl hóa). Đưa cDNA vào vector tạo DNA tái tổ hợp,

_ Ghép cDNA đầu dính vào vector thích hợp đã được mở EcoRI và đã khử nhóm phosphat,

_ Hàn kín mạch nhờ E phosphoryl hóa và E ligase để tạo vector tái tổ hợp,

_ Đưa vector tái tổ hợp vào tế bào chủ và nuôi cấy trong các điều kiện thích hợp để tạo dòng,

_ Xác định dòng cần tìm và thành lập ngân hàng cDNA.

3. Phương pháp phát hiện dòng cần tìm :

1_ Phương pháp lai axit nucleic :

Nguyên tắc là dựa vào khả năng biến tính khi tăng nhiệt độ và hồi tính khi hạ nhiệt độ từ từ của DNA.

Khi tăng nhiệt độ của DNA lên quá nhiệt độ sinh lý hai sợi đơn DNA sẽ tách rời nhau ra do liên kết hydro bị đứt.

Khi hạ nhiệt độ từ từ của khối DNA đã biến tính cùng với các điều kiện thích hợp khác, các mạch đơn bắt cặp trở lại.

Tính đặc hiệu của phản ứng này cho phép bất kỳ trình tự mạch đơn nào cũng tìm gặp mạch bổ sung với nó mặc dù chúng nằm trong hàng triệu các trình tự DNA và RNA khác nhau. Có thể dùng đồng vị phóng xạ đánh dấu để phát hiện đoạn lai.

2_ Phương pháp sử dụng kháng thể:

Nguyên tắc dựa vào phản ứng đặc trưng của một số protein và kháng thể mà chúng ta có thể nhận biết qua phản ứng đặc trưng đó như phản ứng tạo màu, phản ứng kết tủa.

Chọn kháng thể đặc trưng cho protein, tách protein được biểu hiện trong quá trình tạo dòng. Ủ protein với kháng thể đặc trưng. Sau đó tiến hành nhận biết thông qua các dấu hiệu của phản ứng đặc trưng giữa protein và kháng thể.

3_ Phương pháp phát hiện do mất hoạt tính vì xen đoạn

Dựa vào khả năng kháng thuốc của vi khuẩn mang vector tái tổ hợp khi chúng được nuôi cấy trong môi trường kháng sinh.

Cài đoạn DNA lạ vào trong gen kháng thuốc, gen nhận đoạn cài sẽ mất khả năng kháng thuốc. Quan sát những khuẩn lạc mất khả năng kháng thuốc chứng tỏ những khuẩn lạc đó chứa các gen cần tạo dòng.

4_ Phương pháp phát hiện do thay đổi kiểu hình:

Dựa vào khả năng thay đổi màu sắc của khuẩn lạc chứng tỏ rằng khuẩn lạc đó có chứa gen lạ.