Câu 13. Khái niệm gen đối gen, đặc điểm quan hệ gen-đối-gen: Đặc điểm của gen ko độc (gen Avr) của ký sinh. Định nghĩa gen Avr, đặc điểm gen Arv. Gen kháng R và protein R.

* Khái niệm:

Flor đã viết: đối với mỗi gen qui định tính kháng trong cây ký chủ có một gen tương ứng qui định tính gây bệnh trong ký sinh.

Vì mối quan hệ gen-đối-gen thường là quan hệ trội – trội trong khi đó “gen qui định tính gây bệnh” thường được hiểu là gen lăn nên định nghĩa trên của Flor dễ gây nhầm lẫn. Do vây, khái niệm gen-đối-gen của Flor đã được biến đổi một chút cho phù hợp với lý thuyết của ông như sau: “đối với mỗi gen qui định tính kháng trong cây ký chủ có một gen tương ứng qui định tính không độc trong ký sinh và 2 gen này tương tác đặc hiệu với nhau”.

Quan hệ gen-đối-gen cho tới nay đã được chứng minh là tồn tại trong rất nhiều loại bệnh do hầu hết các nhóm tác nhân gây bệnh (nấm, vi khuẩn, virus, tuyến trùng, mollicus...) gây ra.

Các gen cây ký chủ qui định tính kháng (chú ý không nhất thiết phải tuân theo quan hệ gen-for-gen) được gọi chung là gen R. Các gen ký sinh qui định tính không độc của ký sinh được gọi chung là gen Avr. Các ký hiệu R hoặc Avr sẽ được viết thường là r hoặc avr nếu trạng thái của gen là lăn. Các chữ số viết kèm theo (nếu có) cho biết sự tương ứng của các cặp gen. Ngoài qui định chung này, trên mỗi hệ ký sinh – ký chủ, người ta thường sử dụng các ký hiệu riêng.

* Đặc điểm quan hệ gen-đối-gen:

- Phần lớn quan hệ gen-đối-gen là quan hệ trội-trội có nghĩa đối với cây ký chủ, gen qui định tính kháng là gen trội (R) còn gen qui định tính mẫn cảm (thiếu tính kháng) là gen lặn (r); đối với ký sinh, gen qui định tính không độc (không có khả năng gây bệnh) là gen trội (Avr), còn gen qui định tính độc là gen lặn (avr).  Nói cách khác cả gen kháng của ký chủ và gen không độc của ký sinh đều phải được biểu hiện để tạo ra tính kháng.  

- Mỗi gen ký chủ thường nhận biết và tương tác với chỉ gen tương ứng của ký sinh (và ngược lại). Điều này dẫn tới nếu ký chủ có nhiều gen kháng/nhiễm và ký sinh có nhiều gen không độc/độc thì tính kháng chỉ có thể hình thành khi ít nhất có tương tác của một cặp gen tương ứng.

- Số lượng chủng (race) tối đa trong quần thể tác nhân gây bệnh =2n trong đó n là số gen kháng R trong quần thể ký chủ.

- Việc xác định kiểu hình kháng hay nhiễm hoàn toàn dễ dàng khi sử dụng bảng punnett. Khi xây dựng bảng punnett cần chú ý là kiểu gen của cây ký chủ là lưỡng bội còn kiểu gen của ký sinh sẽ hoặc đơn bội hoặc lưỡng bội tùy thuộc loại tác nhân gây bệnh. Ví dụ ký sinh có kiểu gen đơn bội là vi khuẩn, nhiều loại nấm túi (như nấm đạo ôn lúa Pyricularia oryzae); ký sinh có kiểu gen lưỡng bội là tuyến trùng, các loài nấm đảm (như nấm gỉ sắt, than đen...).

- Tính kháng của cây trồng tuân theo quan hệ gen-đối-gen được gọi là tính kháng gen-đối-gen. Tính kháng gen-đối-gen thường là tính kháng đặc hiệu ký chủ, tính kháng đơn gen, tính kháng gen chủ, tính kháng không bền vững.

- Hậu quả của một phản ứng kháng gen-đối-gen thường là phản ứng siêu nhạy/apoptosis.

* Đặc điểm của gen ko độc (gen Avr) của ký sinh:

Sự tồn tại của các Avr gen và sản phẩm của chúng là các Avr protein đã được chứng minh bằng thực nghiệm dựa trên các thí nghiệm của Flor từ những năm 1940. Cho tới nay, nhiều Avr gen đã được xác định từ nhiều nhóm tác nhân gây bệnh bao gồm nấm, vi khuẩn và virus.

Một số thuật ngữ liên quan hiện đang được sử dụng:

Effector (chất hiệu ứng): là phân tử có nguồn gốc từ tác nhân gây bệnh tác động lên tế bào ký chủ, nhờ đó tạo điều kiện cho sự nhiễm bệnh. Một effector được gọi là elicitor khi nó bị cây nhận biết và khởi động phản ứng phòng thủ.

Elicitor (chất kích hoạt): là phân tử có nguồn gốc từ tác nhân gây bệnh khởi động phản ứng phòng thủ dẫn tới tăng cường tính kháng và được cây nhận biết. Khi sự nhận biết được thực hiện nhờ protein R thì elicitor được xem là Avr protein.

* Định nghĩa gen Avr:

Gen Avr là các gen làm cho tác nhân gây bệnh trở thành không độc khi có mặt gen kháng R của cây ký chủ.  Khả năng này của gen Avr có được là do sản phẩm protein của nó cảnh báo tế bào cây ký chủ về sư tấn công của tác nhân gây bệnh và do đó khởi  động phản ứng phòng thủ dẫn tới phản ứng siêu nhạy/apoptosis. Như vậy có thể xem protein Avr là elicitor được cây nhận biết thông qua gen kháng R.

* Đặc điểm

Không giống như gen kháng R, nhìn chung, protein Avr chia sẻ ít đặc điểm chung với nhau.  Dưới đây là một số đại diện Avr gen/protein

Họ gen AvrBs3 của vi khuẩn Xanthomonas. Cho tới nay, khoảng 40 Avr gen của họ này đã được xác định từ nhiều loài Xanthomonas kể cả 1 gen Brg11 của vi khuẩn Ralstonia solanacearum. Các ví dụ của các Avr gen thuộc họ này bao gồm:

X. campestris pv. vesicatoria

AvrBs3, AvrBs4

X. oryzae pv. oryzae

AvrXa5, AvrXa3, AvrXa7, AvrXa10, AvrXa27

X. oryzae pv. oryzicola

Avr/pth3, Avr/pth13, Avr/pth14

X. campestris pv. malvacearum

AvrP6, PthN

X. axonopodis pv. citri

Apl1, Apl2, Apl3, PthA, PthA1, PthA2, PthA3, PthA4, PthB

X. campestris pv. manihotis

PthB

Ralstonia solanacearum

Brg11

Các gen thuộc họ này mã hóa cho các protein chứa khoảng 13 - 23 các chuỗi lặp gồm 34 aa ở vùng trung tâm. Đầu C của các protein này chứa dấu hiệu nhập nhân (Nuclear Localization Signal – NLS) và một vùng hoạt hóa phiên mã (Activated Domain – AD). Cấu trúc này chứng tỏ (đã được chứng minh bằng thực nghiệm) các protein này hoạt động trong nhân và tương tác với quá trình phiên mã của tế bào ký chủ.

Gen AvrPto của vi khuẩn Pseudomonas syringae pv. tomato (gây bệnh đốm đen vi khuẩn cà chua). Gen này mã hóa protein AvrPto có trọng lượng phân tử thấp khoảng 18 kD và được hệ thống tiết loại 3 của vi khuẩn đưa và trong tế bào chất.

Các gen Avr của nấm. Có khá nhiều gen Avr của nấm đã được phân lập. Một số protein Avr là các protein giàu cystein như AvrCf2 của nấm Cladosporium fulvum; AvrP4; AvrP123 của nấm M. lini.  Một số protein Avr được nấm tiết ra ở gian bào (apoplasm) và tương tác với protein R của ký chủ ở bề mặt tế bào; vi dụ như các protein AvrCf2, vrCf4, AvrCf9 của nấm C. fulvum. Một số lại được nấm tiết trực tiếp vào tế bào chất qua vòi hút chẳng hạn như các protein kháng của nấm sương mai, phấn trắng, gỉ sắt.

Các gen Avr của virus. Đối với virus thực vật, các gen  Avr thường liên quan đến 1 protein chức năng của virus. Ví dụ điển hình là protein tái sinh (Replication protein) của Tobacco mosaic virus –TMV là gen không độc tương ứng với gen kháng N trong cây thuốc lá. Ngoài ra, các protein vỏ (Coat Protein – CP) của virus cũng là gen Avr phổ biến của virus.

Một câu hỏi cần đặt ra là tại sao các Avr gen/protein của tác nhân gây bệnh làm giảm khả năng tấn công (mất ưu thế thích nghi) của tác nhân gây bệnh lại vẫn tồn tại trong quần thể tác nhân gây bệnh. Câu trả lời là mặc dù các gen này có thể tương tác (trực tiếp hoặc gián tiếp) với gen kháng thì trong trường hợp không có gen kháng, các gen Avr này vẫn có một số chức năng có lợi cho tác nhân gây bệnh. Ví dụ trên cây cà chua thiếu gen kháng Pto thì  gen AvrPto sẽ tạo điều kiện cho sự gây bệnh của vi khuẩn bằng cách ức chế sự phòng thủ vách tế bào cây (thí nghiệm trên cây Arabidopsis). Các nghiên cứu đối với nấm Phytophthora infestans, Puccinia graminis cho thấy, ngay sau khi áp lực chọn lọc bởi gen kháng R của ký chủ bị mất thì các gen Avr tái xuất hiện.

* Gen kháng R và protein R:

Như đã biết, nhiều loại tác nhân gây bệnh có thể tiếp xúc với cây nhưng nhìn chung cây có thể kháng lại tốt với phần lớn tác nhân gây bệnh. Thậm chí tác nhân có thể tấn công và gây bệnh thì cây vẫn có thể biểu hiện tính kháng với các mức độ khác nhau. Cho tới nay, rất nhiều gen kháng R của cây đã được xác định. Các gen kháng này có thể qui định tính kháng thông qua quan hệ gen-đối-gen hoặc không. Sản phẩm của các gen này gọi là các protein kháng R

* Phân loại protein kháng R:  Hiện nay, các protein kháng R được chia thành 5 lớp dựa trên đặc điểm cấu trúc và vị trí hoạt động của chúng trong tế bào ký chủ. Các protein trong cùng lớp nhìn chung khá bảo thủ.

- Pto:

Lớp protein thứ nhất chỉ gồm 1 thành viên là Pto phân lập từ cà chua. Pto có 1 vùng có hoạt tính xúc tác kinase. Pto là gen kháng hoạt động trong tế bào chất. Pto là protein kháng chống vi khuẩn P. syringae pv. tomato mang gen AvrPto. Pto có hoạt tính kinase điều khiển dẫn truyền tín hiệu trong tế bào chất dẫn tới phản ứng siêu nhạy.

- CNL (CC-NB-LRR)

Lớp protein kháng thứ hai gồm một số lượng lớn protein có cấu trúc gồm (1) một vùng khóa kéo leucine (leucine-zipper – LZ) hoặc một chuỗi xoắn kép (coiled-coil – CC) ở đầu amin; (2) một vùng có khả năng liên kết nucleotide (nucleotide binding – NB) ở vùng trung tâm; và (3) một vùng lặp giàu leucine (leucine-rich repeats - LRR) phía đầu carboxyl. Các protein của lớp này hoạt động trong tế bào chất. Các ví dụ về protein lớp CNL trình bày ở Bảng 2.

- TNL (TIR-NB-LRR)

Lớp protein kháng thứ ba là lớp có số lượng lớn nhất và chỉ có ở cây 2 lá mầm. Về cấu trúc, lớp protein TNL tương tự lớp CNL nhưng thay vì chuỗi CC là một chuỗi TIR. Chuỗi TIR là một vùng protein tương đồng với receptor Toll (của ruồi dấm) và receptor Interleukin-1 (của người) (TIR = Toll/Interleukin-1 Receptor). Tương tự protein kháng lớp CNL, các protein của lớp TNL cũng hoạt động trong tế bào chất. Các ví dụ về protein lớp TNL trình bày ở Bảng 2.

Cả 2 lớp CNL và TNL còn được xếp vào chung một họ protein kháng gọi là họ NB-LRR. Số lượng gen kháng của họ này đươc xem là chiếm số lượng lớn nhất trong các họ protein (Ví dụ trên lúa có hơn 400 gen; Arabidopsis có 150 gen).

Đối với cả 2 lớp, đầu amin (chứa vùng CC hoặc TIR) chịu trách nhiệm tương tác với phân tử được bảo vệ - guardee (xem phần 1.5) hoặc với các phân tử phía hạ lưu của đường hướng dẫn truyền tính kháng. Phần trung tâm là vùng NBS có khả năng liên kết và thủy phân ATP và do đó chịu trách nhiệm khởi động đường hướng dẫn truyền tín hiệu. Ở đầu carboxyl, chuỗi LRR chịu trách nhiệm qui định tính đặc hiệu đối với elicitor mặc dù phần lớn là gián tiếp.

- Cf

Lớp protein kháng thứ tư là một số các protein Cf phân lập từ cà chua như Cf2, Cf4, Cf5, Cf9 qui định tính kháng với nấm Cladosporium fulvum mang các gen Avr tương ứng là AvrCf2, AvrCf4, AvrCf5, AvrCf9. Các protein này thiếu vùng NB; không có hoạt tính kinase. Các prtein nhóm này là các protein xuyên màng với vùng LRR nằm bên ngoài (trên bề mặt tế bào).

- Xa21

Lớp protein kháng thứ 5 chỉ có protein Xa21 phân lập từ lúa. Protein Xa21 là một protein xuyên màng, có một vùng LRR  nằm bên ngoài (trên bề mặt tế bào) và một vùng kinase nằm bên trong tế bào chất.

Một số protein R không thuộc 5 lớp trên gồm:

+ Hml là một enzyme khử độc và kháng nấm Cochlibolus trên ngô.

+ Mlo là một protein màng tế bào lúa miến (barley) mà các đột biến lặn của nó qui định tính kháng nấm phấn trắng và có lẽ điều khiển âm các phản ứng phòng thủ.

+ RPW8 là protein phân lập từ cây Arabidopsis qui định tính kháng nấm phấn trắng theo kiểu không đặc hiệu chủng. PRW8 cũng là một protein xuyên màng.