Câu 23: Công nghệ tạo động vật chuyển gen:

Công nghệ tạo động vật chuyển gen là một quá trình phức tạp và ở những loài khác nhau có thể khác nhau ít nhiều nhưng nội dung cơ bản gồm các bước chính sau: tách chiết, phân lập gen mong muốn và tạo tổ hợp gen biểu hiện trong tế bào động vật; tạo cơ sở vật liệu biến nạp gen; biến nạp gen vào phôi động vật; nuôi cấy phôi và cấy truyền hợp tử (đối với động vật bậc cao); phân tích đánh giá tính ổn định và sự biểu hiện của gen lạ và tạo ra dòng động vật chuyển gen gốc một cách liên tục, sản xuất động vật chuyển gen.

1. Tách chiết, phân lập gen mong muốn và tạo tổ hợp gen biểu hiện trong tế bào động vật

1.1. Tách chiết, phân lập gen mong muốn:

Một gen ngoại lai trước khi được chuyển vào genome của tế bào vật chủ để tạo ra động vật chuyển gen phải được phân lập và tinh chế hay nói cách khác là nó phải được tạo dòng.

Do đó để tách chiết DNA mẫu chứa gen mong muốn và vector plasmid phải được cắt bởi cùng một loại enzyme hạn chế. Các đoạn DNA mẫu sau khi được cắt có mang gen mong muốn sẽ được xen vào vector plasmid và các đầu của các đoạn DNA mẫu này và các đầu của vector plasmid sẽ được nối với nhau nhờ ligase tạo thành plasmid tái tổ hợp. Sau đó các plasmid tái tổ hợp được biến nạp vào các tế bào vi khuẩn Ecoli và các tế bào vi khuẩn tiến hành sinh trưởng.

Các tế bào vi khuẩn chứa plasmid mang gen mong muốn sẽ được phát hiện bằng mẫu dò. Vector chứa gen này sẽ được tách ra khỏi tế bào vi khuẩn và gen mong muốn sẽ được tách chiết.

1.2.Tạo tổ hợp gen chuyển biểu hiện trong tế bào động vật

Ðể tạo tổ hợp gen chuyển biểu hiện trong tế bào động vật, các vùng chức năng khác nhau của gen có nguồn gốc từ các loài khác nhau có thể được kết hợp lại với nhau trong ống nghiệm bằng cách sử dụng enzyme hạn chế và ligase. Tất cả các thành phần của gen có thể được tách chiết và tái tổ hợp để tạo thành một cấu trúc gen chuyển biểu hiện.

Ở các đầu của cấu trúc đầy đủ này có thể được sửa đổi bằng cách bổ sung các trình tự polylinker chứa một số vị trí nhận biết các enzyme hạn chế khác nhau. Trình tự polylinker cho phép có thể xen vào cấu trúc này một vector để kiểm tra và tạo dòng. Gen chuyển được đi kèm với các trình tự không mã hoá có vai trò điều hoà sự biểu hiện của gen. Các yếu tố điều hoà cũng có thể nằm ở trong đoạn intron. Yếu tố điều hoà ở gần đầu 5’ của gen là promoter, có vai trò quyết định trong việc điều hoà sự biểu hiện của gen.

2. Tạo cơ sở vật liệu biến nạp gen:

Ở động vật có vú thì giai đoạn biến nạp gen thích hợp nhất là trứng ở giai đoạn tiền nhân (pronucleus), giai đoạn mà nhân của tinh trùng và trứng chưa dung hợp (fusion) với nhau. Ở giai đoạn này tổ hợp gen lạ có cơ hội xâm nhập vào genome của động vật nhờ sự tái tổ hợp DNA của tinh trùng và của trứng. Do tế bào phôi chưa phân chia và phân hoá nên tổ hợp gen lạ được biến nạp vào giai đoạn này sẽ có mặt ở tất cả các tế bào kể cả tế bào sinh sản của động vật trưởng thành sau này.

3. Chuyển gen vào động vật

Hiện nay có nhiều phương pháp khác chuyển gen nhau đang được sử dụng để tạo động vật chuyển gen: vi tiêm, chuyển gen bằng cách sử dụng các tế bào gốc phôi, chuyển gen bằng cách sử dụng vector virus...

4. Nuôi cấy phôi trong ống nghiệm (đối với động vật bậc cao)

Tế bào trứng tiền nhân sau khi vi tiêm được nuôi cấy trong ống nghiệm để phát triển đến giai đoạn phôi dâu (morula) hoặc túi phôi (blastocyst). Ở giai đoạn này màng trong (pellucida) bị bong ra và phôi có thể làm tổ được ở dạ con. Những phôi này được cấy chuyển vào con nhận đã được gây chửa giả (pseudopregnant) để phát triển thành cá thể con.

Ðối với động vật bậc thấp như cá không cần giai đoạn này.

5. Kiểm tra động vật được sinh ra từ phôi chuyển gen

Ðể khẳng định động vật có được chuyển gen lạ vào hay không, người ta phải kiểm tra xem gen lạ có xâm nhập được vào bộ máy di truyền của động vật trưởng thành hay không. Người ta sử dụng phương pháp lai phân tử trên pha rắn (Southern blot, Northern blot...) hoặc PCR.

Ðể kiểm tra sản phẩm của gen lạ được đánh giá ở hai mức độ: phiên mã và dịch mã. Sản phẩm phiên mã được đánh giá bằng phương pháp RT-PCR, sản phẩm dịch mã được đánh giá bằng phương pháp Western blot, ELISA hoặc kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA) để phát hiện protein lạ trong động vật. Theo dõi các thế hệ sau của động vật chuyển gen (F1, F2, F3, ...) để xác định gen lạ có di truyền hay không.

6. Tạo nguồn động vật chuyển gen một cách liên tục

Sau khi kiểm tra thấy gen ngoại lai đã được di truyền ổn định, tiến hành lai tạo và chọn lọc để tạo dòng động vật chuyển gen.