Câu 4: Enzyme cắt ghới hạn (RE: Restriction enzyme) : Đặc điểm. tính chất,  và vai trò trong ktdt?

1.     Lịch sử phát hiện:

Năm 1962, lần đầu tiên V.Arber đã chứng minh rằng vi khuẩn có những enzyme đặc biệt có khả năng phân biệt đc ADN của mình và ADN lạ. Các enzyme này có khả năng “hạn chế” sự p.triển của các phage trong tb v.khuẩn bằng cách phân hủy ADN của phage một cách đặc hiệu nên các enzyme này đc gọi là các e. cắt hạn chế ( restriction enzyme), các E. này có vai trò rất q.trọng. chúng đc xem như là chìa khóa sử dung kt tái tổ hợp ADN.

 Năm 1970, Hamitton Smith đã tách đc RE từ V.khuẩn Haemophilus influenzae, chủng Rd đg.là hind II

·        Đặc điểm:

- E. giới hạn phân hủy bất kỳ ADN ngoại lại nào xâm nhập vào tế bào VK.

- Các E. giới hạn có đặc tính cắt ADN không đặc hiệu loài,nghĩa là RE tách chiết từ VK có thể cắt ADN của tb Đvật, tv, và vi khuật khác ở cùng vị trí giới hạn hay điểm giới hạn. Số lượng và kích thước đoạn cắt dài hay ngắn. tùy thuộc vào số lượng điểm giới  hạn trên phân tử ADN. Bản đồ trình tự các vị trí cắt bởi E. g/hạn gọi là  bản đồ g/hạn.

- Các E. g/hạn có 3 kiểu: I,II,III. Các E. đc dùng phổ biến ngày nay thuộc kiểu II, có cơ chế tác động đơn giản nhất. Chúng là các Nuclease và vì chúng cắt tại 1 vị trí nằm bên trong sợi ADN, nên g.là endonuclease g/hạn kiểu II, Mặc dù chúng ta thường gọi đơn giản là các E. g/hạn.

- Các RE nhận biết ADN mạch kép ở những trình tự điểm nhận biết cắt ADN ở ngay điểm này hay điểm kế cận. Các trình tự nhận biết (recognition sequences) thường có trình tự 4-6 cặp nucleotide, đôi khi có tới 8 cặp Nu. Nếu có 4 loại Nu của p.tử ADN sắp xếp ngẫu nhiên sẽ có 4 kiểu sắp xếp khác nhau. Trường hợp E. g/hạn nhận biết trình tự ADN đặc hiệu gồm 4 cặp Nu, cứ 44 = 256 cặp Nu sẽ có 1 vị trí cắt. Khi các E. g/hạn nhận biết trình tự ADN đặc hiệu có 6 cặp Nu, cứ 46 = 4096 cặp Nu có 1 chỗ bị cắt. Những trình tự nhận biết đối xướng đảo ngược nhau g.là Panlindrom, chẳng hạn E. EcoRI hay Pvu II.

Các kiểu cắt: có 2 kiểu : tạo đầu bằng và tạo đầu lệch cố kết.

   +  Kiểu tạo đầu bằng: E g/h cắt ở vị trí giữa trìh tự nhận biết. Các đầu bằng bị cắt không có k/năng tự kết hợp với nhau. Để nối các đoạn ADN lại với nhau cần sd E. nối­_Ligase, or các đoạn nối (linker) hay các adaptor chuyên dụng cho mỗi loại enzyme.

   + Kiểu cắt tạo đầu lệch (đầu dính): Vị trí cắt nằm cạnh trình tự nhận biết, các dầu lệch có thể tự nối lại với nhau sau khi cắt mà ko cần sự có mặt của E. nối- Ligase. Nhờ đặc tính này E. cắt g/hạn tạo đoạn nối ADN có đầu lệch đc sd nhiều trong kt ADN tái tổ hợp.

-         Các p.tử ADN khác nhau, đc cắt bởi cùng 1 loại E g/hạn, có k/năng kết hợp với nhau tạo nên các p/tử ADN tái tổ hợp qua các đầu dính. Các đoạn ADN đc tạo ra nhờ hoạt tính cắt tạo đầu dính của E g/hạn có thể tự nối lại với nhau, or nối với những đoạn ADN có các đầu tương tự, nên đc sd rất nhiều trong kt ADN tái tổ hợp.

-         Cách gọi tên của E g/hạn dựa trên qui ước quốc tế:

 Tên E g/h đc ghép bởi chữ cái đầu tiên in hoa chỉ tên Chi hoặc loài vsv mà từ đó E g/hạn đc tách chiết. Hai chữ tiếp theo viết chữ in thường chỉ giống của vsv. Những chữ và số la mã tiếp theo là tên của chủng và thứ tự dòng của loài vsv cụ thể đã tách chiết Enzyme.

VD: EcoRI: E (chi) , co (loài), R (chủng) , I (thứ tự dòng)