Câu 4: Phương pháp tách RNA tổng số và mRNA

1. Tách RNA tổng số:

RNA kém bền và dễ bị phân hủy bởi E ribonuclease ( RNase ) có nhiều ở khắp nơi, hoạt tính cao lại bền với nhiệt độ vì vậy điều kiện thao tác để tách chiết phải được tiến hành trong môi trường vô cùng nghiêm ngặt. Phương pháp tách chiết được tiến hành:

_ Tế bào được nghiền với chất tẩy rửa SDS, sarcosyl nồng độ cao, nitơ lỏng để biến tính protein. Đồng thời mẫu cũng được nghiền với chất khử (2_mercaptoethanol) để ức chế RNase, nước sử dụng cũng được sử lý vơi DEPC ( diethylpyro carbonat ) để loại bỏ RNase.

_ Các protein, DNA được loại bỏ qua xử lý mẫu với hỗn hợp dung môi trizol, khi ly tâm ta tách được RNA trong pha nước. DNA ở PH=4 bị hấp phụ vào pha dưới cùng với phenol, protein bị biến tính nằm giữa hai pha cũng bị loại bỏ cùng với pha phenol.

_ RNA trong pha nước được hút ra sau đó tủa bằng isopropanol để -200C, ly tâm và rửa lại bằng ethanol 79%, thu hồi RNA tinh khiết. Chất lượng của RNA tổng số được đánh giá sơ bộ qua điện di trên gel agarose. RNA tổng số chưa nhiều rRNA, tRNA, mRNA...

2. Tách mRNA:

Dựa vào kích thước, trọng lượng phân tử người ta có thể tiến hành sắc ký, điện di, hoặc ly tâm để tách từng loại RNA. Phương pháp tách mRNA:

Nhờ đặc điểm mRNA có đuôi polyA do đó người ta tách mRNA ra khỏi mẫu bằng phương pháp sắc ký ái lực oligodt_xenlulose. Ngày nay có loại viên bi từ, trên bề mặt có gắn oligodt. Sau khi mRNA gắn trên bề mặt các viên bi từ, thông qua liên kết bổ sung với oligodt, thu nhận các viên bi và đem ly tâm ta thu được mRNA tinh khiết.