Câu 6: Các vector chuyển gen và vai trò của chúng trong kt dt?

1.     Các vector chuyển gen:

Để chuyển gen từ sv này sang sv khác có thể đc th/hiện bằng biến nạp ADN hoặc bơm thẳng ADN vào TB. Tuy nhiên, bằng cách đơn giản này hiệu quả thấp vì phần lớn ADN lạ x/nhập vào TB sẽ bị phân hủy, ADN ko TTH thì ko thể tự sao chép thành nhiều bản. Do đó nó sẽ mất dần. Vì vậy cần pải có các vector để vận chuyển gen. vector chuyển gen là p/tử ADN có k/n tự tái sinh, tồn tại độc lập trong TB và mang đc gen cần thiết.

    Vector chuyển gen pải thỏa mãn các yêu cầu tối thiểu sau:

-         Có trình tự khởi sự sao chép (Ori) để tự sao chép mà tồn tại độc lập.

-         Có các trình tự nhận biết cho E g/hạn cắt rồi để hở tạo nơi lắp ráp các đoạn gen lạ. Các trình tự nhận biết này pải xa trình tự khởi sự sao chép để tránh bị cắt nhầm.

-         Có trình tự điều hòa (promoter) tạo thuận lợi cho sự phiên mã gen lạ.

-         Có các gen đánh dấu để dễ dàng phát hiện các gen lạ trong q.trình chọn lọc TB mang gen TTH. Thông thường các vector chuyển gen có gen khác chất kháng sinh hoặc gen tổng hợp chất màu để dễ dàng phát hiện trên môi trường thạch.

-         Vertor chuyển gen pải càng nhỏ càng tốt.

-         Chứa 1 số trình tự nhận biết để dễ dàng trong quá trình dịch mã (trình tự đặc biệt cần thiết cho sự biểu hiện gen).

=>Vertor chuyển gen trong kt dt : plasmid, cosmid, phagemid, NST nhân tạo nấm men, Ti-plasmid.

a) plasmid:

plasmid là những p/tử ADN có kích thước nhỏ (2-5 kb), dạng vòng, nằm trong TBC của TB VK, nấm men...

     plasmid có khả năng tái bản độc lập, ko pụ thuộc vào sự tái bản của bộ gen TB.

     Mỗi TB VK có trung bình khoảng 20 plasmid. Mặc dù các plasmid nói chung có thể bỏ qua (chúng ko cần thiết cho các qt s/trưởng và phân chia của TB VK) nhưng plasmid thường mang các gen có hoạt tính kháng các chất khang sinh như gen kháng Tetracycline (TcR), gen kháng Ampicilline (ApR), gen sinh độc tố,...

      Trong những năm đầu tiên ng/ta sd chính plasmid làm vector chuyển gen nhưng sau đó ng/ta thấy trong plasmid có những đoạn gen ko cần thiết nên ng/ta chỉ cắt những đoạn gen cần thiết.

     plasmid đc phát hiện đầu tiên ở E.coli kí hiệu: E.colEI. Trong kt ADN TTH, các plasmid gặp trong tự nhiên thường đc sửa đổi nhiều để tạo ra các vector có các đặc điểm mong muốn. Để đặt tên plasmid: chữ P đc dùng để chỉ plasmid và tiếp theo đó thường là tên của những người đã phân lập or thiết kế plasmid. Các con số cũng đc sd để phân loại các chủng cụ thể.

VD: pBR 322.   B-Bdivar, R-Rodriguez là 2 tên của tác giả thuộc 2 pòng thí nghiệm khác nhau tạo nên, 322- Chỉ số thư tự.

      Một số plasmid đc sd rộng rãi và phổ biến nhất là: pBR322, pUC 18/19.

*/ plasmid pBR322:

plasmid pBR 322 có kích thước 4363 bp mang 2 gen kháng chất kháng sinh là kháng Ampicilline và kháng Tetracycline, một trình tự khởi sự sao chép và 20 vị trí nhận biết của các restriction enzyme (EcoRI, HindII, BamHI, SalI,..). Trong số đó 11 vị trí nằm trong các gen kháng chất kháng sinh. Khi 1 gen lạ (or 1 đoạn trình tự ADN) đc gắn tại vị trí các gen đó, làm mất k/năng kháng chất k/sinh t/ứng.

         plasmid pBR 322 có k/năng tái bản cao, tồn tại với số lượng trung bình 20-30  bản sao trong mỗi TB và cho phép gắn đoạn ADN lạ có kích thước 6 kb vẫn h/động bình thường.

*/ plasmid pUC 18:

       plasmid pUC 18 là plasmid nhân tạo thuộc thế hệ thứ 3 đc cải tiến từ pBR 322, có kích thước khoảng 2686 bp, mang gen ApR và 1 phần gen lacZ, xen vào giữa gen lacZ là poly linker (đoạn polynucleotide tổng hợp mang 1 chuỗi các trình tự nhận biết của nhiều loại E g/hạn). Các Plasmid trong nhóm nayfk khác nhau ở độ dài các polykinker. Ưu điểm của Plasmid nhóm pUC có kích thước nhỏ, vùng polylinker cho phép gắn bất kỳ 1 trình tự ADN lạ nào, gen lac Z giúp dễ dàng phát hiện ADN TTH bằng cách quan sát m/sắc khuẩn lạc trên môi trường thạch. Bình thường khuẩn lạc có màu xanh do E β-galactosidase đc tổng hợp, nếu khuẩn lạc có màu trắng chứng tỏ gen cần thiết đã gắn vào vector ở vị trí gen lacZ làm cho E. β-galactosidase ko đc tổng hợp.

b) Các vector chuyển gen Phage :

Phage (thực khuẩn thể) là vius xam nhiễm và làm tan VK. Việc sd Phage làm vector chuyển gen có nhiều ưu điểm hơn so với plasmid:

-         Phage đc trang bị 1 hệ thống xâm nhập vào TB VK và có k/năng sinh sôi rất nhanh vì vậy h/quả x/nhiễm của phage cao hơn nhiều so vơi plasmid.

-         Kích thước đoạn gen lạ mà vector phage mag đc lớn hơn rất nhiều so vơi plasmid. Phage có thể tiếp nhận gen lạ có kích thước đến 30kb.

        Hiện nay có 2 loại phage thường đc sd cho m/đích chuyển gen là: λ và M13.

+ phage λ có ADn mạch kép kích thước 18502bp, nằm trong phần đầu của phage λ. Một trong những yếu điểm lớn nhất của các vector λ là trong qt lắp ráp phage mới, phần đầu của phage λ chỉ có thể bọc goi 1 só lượng ADN nhất định (kích thước bộ gen TTh ko đc quá 5%(3kb) so với bộ gen tự nhiên), do vậy nó g/hạn k/thước của các đoạn ADN ngoại lai cần tách dòng. Trong qt bọc gói, các hạt phage có k/năng sống có thể sinh ra với chiều dài ADn nằm trong khoảng 38-51kb. Như vậy, hệ gen phage kiểu dại chỉ có thể mang ADN ngoại lai có k/thước tối đa 2.5kb thì nó mới đủ nhỏ để trở thành phage có sức sống. Sự hạn chế này đã đc tối thiểu hóa bằng cách thiết kế 1 cách cẩn thận các vector có thể tiếp nhận các đoạn ADN có chiều dài tối đa về mặt lí thuyết cho từng trường hợp cụ thể. Các vector như thế đc phân thành 2 nhóm chính: Các vector xen đoạn và các vector thay thế.

+ Phage M 13 có ADN sợi đơn có 10 gen, k/thước 6,4kb và chỉ x/nhiễm đặc trưng các E.coli. Hệ gen của phage M 13 chứa các gen q/trọng, chỉ có 1 vùng năm giữa các gen gồm 507 Nu cho phép gắn xen đoạn ADN lạ, ko gây hỏng c/năng của phage. Vùng này đc dùng để thiết kế 1 loạt các vector M13mp bằng cách xen 1 đoạn polylinker/lacZ α-peptid vào đó. Việc này đã tạo đk cho việc sd hệ thống sàng lọc X-gal để phát hiện các thể tái tổ hợp, Chẳng hạn như từ phage M13 ng/ta gắn thêm gen lacZ vào đoạn giữa sợi đơn ADN tạo nên vector M13mp1.  vector M13mp1 đc cải tiến tạo nên M13mp2, là vector đơn giản nhất có 1 vị trí cắt của E g/hạn EcoRI. Từ vector M13mp2 cải tiến tạo nên vector M13mp7 có 4 vị trí cắt đặc trưng cho các E g/hạn EcoRI, BamHI, SalI và PstI tiện lợi và cho hiệu quả cao trong việc tách dòng gen. Hiện nay có rất nhiều vector chuyển gen đc tạo nên từ phage M13, bluescript M13 là 1 trong những vector đc sd rộng rãi trong kt ADN TTH.

c) Cosmid

    Cosmid vector đc thiết kế để nhân dòng những đoạn ADN lớn (khoảng 40-45kb). Đây  là loại vector nhân tạo kết hợp các thuộc tính của plasmid với phage. Cosmid vector có chứa đầu cos (đầu dính) của phage giúp ADN của phage từ dạng thẳng nối lại thành vòng tròn nên có thể gói bọc dễ dàng trong phần đầu của phge. mặt khác cosmid vector lại có phần gốc plasmid, do vậy chúng có k/năng tự nhân đôi như những plasmid của VK. do hầu như toàn bộ phần ADN của phage đã đc cắt bỏ, nên chúng có k/năng mang đoạn ADN ngoại lai có k/thước lớn. khi đoạn ADN ngoại lai đc ghép nối, các cosmid tái tổ hợp sẽ đc gói bọc trong phage mang ADN TTH ko tự nhân lên đc vì phần ADN của phage đã bị loại bỏ nhưng chúng vẫn có k/năng lây nhiễm vào VK. Sau khi vào VK chúng lại có k/năng tự nhân đôi lên do bản thân trong Vk đã có plasmid bình thường. Cosmid vector chứa đoạn gen lạ có thể dài đến 45kb dùng để lập thư viện gen ở ruồi giấm, chuột và người.

d) Các loại vector khác:

*/ Plasmid Ti:

Plasmid Ti đc sd rộng rãi trong chuyển gen ở thực vật. Nó bắt nguồn từ VK trong đất là Agrobacterium tumifaciens gây bệnh tạo khối u (tumor) ở thực vật. nhân tố gây khối u là Plasmid Ti (Tumor inducing) có ADN vòng tròn, k/thước khoảng 200kb. A. umifaciens x/nhiễm qua các vết thương ở rễ thực vật, chuyển 1 đoạn ADN của Plasmid Ti là T-ADN vào trong cây, đoạn T-ADN của Plasmid Ti khoảng 10-20kb đc gắn vào bộ gen của cây bị bệnh tạo nên các khối u ở cây.

      Plasmid Ti gồm đoạn T-ADN mang gen mã hóa sinh tổng hợp auxin, cytocin và opin, các gen gây khối u (oncogen), gen tái bản (ori) và vùng vir. Vùng vir k/thước khoảng 40kb mang các gen cần thiết cho sự x/nhiễm và chuyển T-ADN vào cây. khi T-ADN đc đưa vào trong cây, các gen h/động sản sinh auxin, cytocin và opin làm cho các TB phân chia ko kiểm soát, tạo nên các khối u. Các dòng A. umifaciens khác nhau có các plasmid Ti có kích thước khác nhau.

       Vùng vir của plasmid Ti bị kích hoath bởi các howph chất có trong mô TB bị tổn thương. Vùng vir gồm 6 gen A,B,C,D,E và G liên quan đến sự cắt chuyển T-ADN vào cây.Vùng T-ADN mang các gen mã hóa tổng hợp auxin, cytocin, opin  và oncogen. Khi thiết kế vector nhân tạo từ plasmid Ti cần thay T-ADN bằng 1 đoạn của pBR 322, có gen chỉ thị kháng các chất kháng sinh tạo nên các vector nhị thể, vector liên hợp,...

       Hiện nay, ng/ta đã thành công trong việc cải bieebj plasmid Ti bằng cách cắt bỏ hầu hết các đoạn gen gây p/triển khối u, chỉ để lại vùng vir và phần T-ADN tối thiểu mang các điểm ghép gen. Loại vector mới này sd rất hiệu quả trong việc đưa đoạn gen lạ vào TB thực vật, ko những đv tv 2 lá mầm mà còn vào tv 1 lá mầm mà đại diện là lúa.

*/ Nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men YAC:

       Nấm men là đối tượng quan trọng trong CNSH. Plasmid có nguồn gốc VK khi đưa vào TB nấm men hoạt động yếu, ko hiệu quả. Ngược lại, Plasmid có ng/gốc từ nấm men đưa vào TB VK cũng ko h/động. Cho tới nay ở sv nhân thật (Eukaryotae) mới chỉ tìm đc 1 loại plasmid duy nhất , đó lad plasmid vòng tròn, có k/thước khoảng 2 micromet, có nhiều trong Tb nấm men Saccharomyces cerevisiae. Sự cải tiến plasmid này qua nhiều bước tạo thành NST nhân tạo nấm men đc gọi tắt là YAC (yeast artificial chromosome). YAC có khả năng mang đoạn gen lạ dài đến 2000kb. Các vector YAC đc ứng dụng nhiều trong tách dòng gen, lập ngân hàng gen và dùng trong chuyển gen ở TB đv và tv.