CHUYÊN ĐỀ

II.2. SẢN XUẤT PROTEIN NHỜ DNA TÁI TỔ HỢP

Gồm các bước cơ bản:

Chuẩn bị (Nuôi cấy tế bào, thiết kế gen chuyển nhiễm) => chuyển nhiễm DNA vào tế bào để thu nhận PROTEIN thuốc =>chọn lọc các tb đã chuyển nhiễm bằng các marker =>Sản xuất thuốc nhờ cơ thể động vật.

II.2.1. Chuẩn bị

vNuôi cấy tế bào

-                      Tất cả các quy trình đều phải tiến hành nuôi cấy tế bào in vitro trong các môi trường thích hợp.Nuôi cấy tế bào động vật là kỹ thuật không thể thiếu trong công nghệ sản xuất sinh dược phẩm. Thu nhận sinh dược phẩm từ tế bào vi sinh vật đã được tiến hành trong suốt thời gian dài của quy trình. Với tế bào thực vật và động vật, việc nuôi cấy chúng tùy thuộc vào quy trình được sử dụng trong sản xuất thuốc.

-         Các dược chất sẽ tiết ra ngoài môi trường hay lưu giữ trong tế bào.

- Nếu sản xuất các sinh dược phẩm từ các sinh vật chuyển gen thì việc nuôi cấy tế bào in vitro cũng cần trong giai đoạn đầu. Các dược chất sẽ nằm trong máu (động vật), dịch tiết hay các mô của cơ thể (thực vật và động vật).

- Nuôi tế bào động vật: Mô được tách ra từ các cơ quan đặc biệt (da, gan… => đĩa vô trùng =>phân tách nhỏ thành các tế bào đơn (bởi protease) =>đĩa khác chứa môi trường nuôi cấy với huyết thanh => chúng sẽ phát triển, phân chia vài lần và tiến đến sự già yếu.

          Một số dòng không tiến đến sự già yếu, chúng được gọi là tế bào bất tử. Đó là những tế bào “biến dạng”, thay đổi chu kỳ, thường gây khối… do nhiễm virus hay những thay đổi khác dẫn đến sự phân chia và phát triển không kiểm soát.

+       Các tế bào Hela (thu từ Henrietta Lacks, bệnh ung thu cổ tử cung).

+       Tế bào CHO (tế bào buồng trứng chuột Hamster Trung Quốc).

v    Thiết kế gen chuyển

Khi thiết kế gen chuyển cần chú ý kích thước đoạn gen chuyển phù hợp, cần có promoter để hoạt hóa sự biểu hiện gen, gen đích mã hóa protein mục tiêu, trình tự kết thúc chu kỳ hoạt động gen.

II.2.2. Chuyển nhiễm DNA vào tế bào để thu nhận protein thuốc

v    Trong tế bào nhân thật, quá trình chèn một DNA ngoại lai vào tế bào gọi là chuyển nhiễm (transfection).

vCác phương pháp chuyển nhiễm phổ biến trong các quy trình sản xuất thuốc

-                     Chuyển nhiễm bằng hóa chất: Dưới các điều kiện nhất định của môi trường thành phần tủa sẽ lắng và nằm trên bề mặt của các tế bào, sau đó chúng đi vào tế bào thông qua cơ chế nhập bào (endocytosis). Một số DNA sẽ được dẫn dắt vào bộ gen tế bào chủ.

Hình 11.1. Sự chuyển nhiễm của tế bào động vật sử dụng tủa calcium phosphate

-                     Khoan lỗ bằng sung điện: Một sung điện nhanh có thể làm vỡ các vùng của màng một cách tạm thời, tạo thành các lỗ (pore) cho phép các phân tử có cực có thể di chuyển qua, sau đó màng có thể phục hồi nhanh chóng và tạo thành tế bào nguyên vẹn.

-Chuyển nhiễm bằng các peptide gắn DNA:Trình tự peptide cũng được sử dụng để phát triển các peptide gắn chuyên biệt với DNA tổng hợp. Chẳng hạn, peptide tirosine-lysine-alanine-(lysine)8-tryptophan-lysine cho thấy rất hiệu quả trong việc hình thành phức hợp với DNA. Các peptide gắn DNA thường bắt cặp với ligand chuyên biệt cũng có thể được tổng hợp, do đó cho phép định hướng chúng, thông qua các receptor của các phức hợp DNA/peptide vào các kiểu tế bào chuyên biệt khác nhau nhằm thu nhận các protein khác nhau.

-Chuyển DNA trực tiếp:tiêm DNA vào bộ gen

+Nhược điểm: sự sát nhập có tần số rất thấp

+Ưu điểm: sự biểu hiện của gen ngoại lai có thể di truyền qua nhiều thế hệ, thuận lợi cho việc sản xuất thuốc

+ Phương pháp này cũng được ứng dụng vào liệu pháp gen trị bệnh ung thư, khi đó DNA được tiêm vào khối u hay vào các tế bào cơ để biểu hiện các kháng nguyên khối u, chúng có chức năng như là một vaccine

-Chuyển nhiễm thông qua liposome: DNA được đưa vào túi chứa liposome, sau đó chúng có thể thoát ra khỏi endosome thông qua sự phân hủy. Chuyển DNA thông qua liposome là kỹ thuật tương đối đơn giản, hiệu quả cao, do đó thường được lựa chọn cho chuyển nhiểm DNA ngoại lai vào các dòng tế bào thông thường nhằm thu hoạch thuốc.

Hình 11.2. Đưa DNA vào tế bào bằng cationic liposome

Các cationic liposome tích điện dương ở đầu và tích điện âm ở đuôi, bao quanh mảnh DNA trước khi chèn vào tế bào và sau khi dung hợp với màng tế bào.

-         Chuyển nhiễm bằng Vector:Vector động vật có vú đầu tiên dựa vào virus 40 của một loài khỉ (SV40).

Đó là virus gây khối u có DNA mạch đôi với bộ gen chừng 5243bp. Sự nhiễm virus xảy ra ở các tế bào thận thỏ, nhưng chúng có thể nhiễm vào một số tế bào khác, phụ thuộc vào kiểu tế bào và có thể làm tan tế bào hoặc không. SV40 chứa hai nhóm gen biểu hiện.

Các gen ngoại lai có thể được chèn vào bộ gen SV40 để thay thế hoặc một gen sớm, hoặc một gen muộn. Nếu một gen ngoại lai thay thế, chẳng hạn thay thế gen muộn, virus không thể sao chép thích hợp. Sự nhiễm có thể tiến hành sử dụng một virus helper VS40 khiếm khuyết trong một gen sớm để cung cấp chức năng dài của gen ngoại lai. Ngoài ra, hàng loạt vector khác được sử dụng thành công trong công nghiệp sản xuất thuốc.

ĐIỂM KHỞI ĐẦU SAO CHÉP

SV 40

5,243 bp

Hình 11.3. Bộ gen của SV40

SV40 có hai đơn vị phiên mã, mà sự biểu hiện của nó được điều hòa từ các promoter sớm và muộn. Cả hai đều phiên mã sản xuất các sản phẩm protein.Các kháng nguyên T lớn và nhỏ rất cần cho quá trình sao chép, trong khi đó protein VP hình thành vỏ capsid virus.Các trình tự intron tách ra trong suốt quá trình cắt nối (nét đậm).

II.2.3. Các marker chọn lọc và sự khuyếch đại của gen sản xuất thuốc

Việc sát nhập của DNA vào tế bào người hay động vật cần được đánh giá sự thay đổi kiểu hình khác với những tế bào không chuyển nhiễm thành công. Các tế bào đã chuyển nhiễm thường liên quan đến khả năng khiếm khuyết dinh dưỡng.

Dựa vào đó mà có một số marker chọn lọc các tế bào đã chuyển nhiễm như:

§  Gen Tk virus HSV (herpes simplex virus): giúp các tế bào chuột khiếm khuyết enzyme thymidine kinase có thể phát triển trên môi trường HAT (chứa hyphoxanthine, aminopterin và thymidine)

§  Các gen kháng kháng sinh như: gen kháng ampicillin, Tn5 transposon E.coli mã hóa gen kháng kanamycin

§  Sự tiếp xúc của tế bào động vật với các độc tố ở mức cao trong một thời gian dài có thể hình thành các dòng tế bào có khả năng kháng độc

Chẳng hạn, tế bào chuột tiếp xúc với methotrexate =>ba kiểu đột biến tạo ra kháng thuốc: đột biến trong enzyme DHFR tạo ra sự kháng nhân tố ức chế; các đột biến ngăn cản sự đưa thuốc vào; sự khuếch đại của locus Dhfr làm gia tăng số bản sao của gen Dhfr, tạo ra một lượng enzyme vượt quá tác động của thuốc

Sự khuyếch đại của gen sản xuất thuốc

Việc chèn gen ngoại lai vào các tế bào động vật thường không phải lúc nào cũng hiệu quả để sản xuất các protein

Gen ngoại lai biểu hiện phải được kết hợp với các nhân tố kiểm soát dịch mã và phiên mã thích hợp cho kiểu tế bào sản xuất protein đó

Nhiều promoter cơ bản điều hòa sự biểu hiện gen trong một số kiểu tế bào và mô có tính chuyên biệt (promoter CMV có hoạt tính phiên mã trong các tế bào gan)

Các gen biểu hiện trong các tế bào cũng cần các vị trí polyadenin hóa, các tín hiệu kết thúc phiên mã và các nhân tố kiểm soát dịch mã khác

II.2.4. Sản xuất thuốc nhờ cơ thể động vật

Một nhánh mới của chăn nuôi được nghiên cứu và phát triển từ các phòng thí nghiệm của các trường đại học và các công ty CNSH, gọi là “pharming”

1982: phát triển các chuột chuyển gen

1987: chuột đầu tiên sản xuất ra thuốc cho người (nhân tố hoạt hóa plasminogen mô, chữa các cục máu đông)

2000: Công nghệ sản xuất sinh dược phẩm trong các vật nuôi được thương mại hóa

Bằng kỹ thuật di truyền, các gen mã hóa cho protein thuốc quan tâm được chuyển vào một sinh vật khác để sản xuất lượng lớn thuốc. Kỹ thuật này được sử dụng để phổ biến các đặc tính mới của một sinh vật cũng như khởi động sự sản xuất protein thuốc

Một số thuốc như tPA, các erythropoietin bệnh thiếu máu, nhân tố đông... đòi hỏi sản xuất ở tế bào động vật có vú

II.3. KỸ THUẬT LAI TẾ BÀO TRONG SẢN XUẤT PROTEIN THUỐC

ØLai tế bào (còn gọi là lai tế bào sinh dưỡng hay lai tế bào soma) là kỹ thuật áp dụng cho cả tế bào thực vật và tế bào động vật. Với từng đối tượng, kỹ thuật lai có những điểm khác nhau. Kết quả của quá trình lai tế bào là hình thành nên các thể lai (hybridoma) mang đặc tính của cả hai tế bào ban đầu tạo nên nó

ØSự tạo thành tế bào lai in vivo là vô cùng hiếm

ØBằng phương pháp nuôi cấy in vitro, có thể tạo các loại tế bào lai của cùng một mô, các mô khác nhau của một cơ thể, hay các cơ thể khác nhau của cùng một loài, thậm chí cả các loài khác nhau

ØNăm 1960: Barski, Sorieul và Cornefert đã tạo được tế bào soma lai in vitro đầu tiên khi nuôi trộn lẫn các tế bào sarcoma của hai dòng chuột khác nhau

ØSự kết dính tự nhiên có xác suất thành công thấp và thường không định hướng

Khi sử dụng các nhân tố kích thích, sự dung hợp tế bào xảy ra nhanh, dễ dàng, tần số cao

II.3.1.PHƯƠNG PHÁP LAI TẾ BÀO

a.     Chuẩn bị tế bào

Các tế bào u tủy được thu nhận bằng ly tâm, rửa trong môi trường D’MEM không chứa huyết thanh và huyền phù ở nồng độ 107 tế bào/ml. Các tế bào lách hay các tế bào nút màng treo ruột của động vật đã gây đáp ứng miễn dịch, được thu nhận bằng cách tách mô, nhờ các tấm kim loại không rỉ và một phiến đỡ vô trùng.

Lách từ ruột đã gây đáp ứng miễn dịch, nhìn chung có thể thu được 108 tếbào dòng limpho, trong khi đó lách và các hạch treo ruột có thể thu được 4x108 tế bào. Các tế bào này cũng được huyền phù trong môi trường D’MEM không có huyết thanh.

b.     Một số tác nhân kích thích sự dung hợp tế bào

Thông thường, trước khi hai tế bào được hợp nhất thành, chúng phải được tiếp xúc nhau bề mặt. Vì bên ngoài màng tế bào mang điện tích âm nên giữa các tế bào với nhau có 1 lực đẩy, do đó để chúng có thể tiếp cận nhau phải cần có các lực tác động từ bên ngoài. Có rất nhiều các kỹ thuật để thực hiện điều này, bao gồm phương pháp hóa học (PEG), ly tâm, lực đẩy chân không. Điện di 2 chiều dựa trên các sung điện trường không ổn định, có thể cảm ứng tạo 2 cực trong tế bào, nhằm gây các ảnh hưởng:

- Các tế bào di chuyển đến nơi có sung điện trường mạnh nhất.

- Khi các tế bào di chuyển đến các khoảng cách gần nhau, chúng sẽ hình thành các dạng “chuỗi ngọc” (pearl chains).

Hóa chất: nhiều hóa chất có tác dụng kết dính màng tế bào ở những mức độ khác nhau, phổ biến hơn cả là PEG (polyethylenglycol). Sự dung hợp bằng hóa chất luôn có vai trò của các phần tử hormone (tạo tín hiệu thông tin hoạt hóa bề mặt màng tế bào).

Các tác nhân vật lý:có thể dùng sốc nhiệt, sung điện, sóng siêu âm...Trước đó nên dùng hormone kích hoạt để đạt tỷ lệ cao nhất các tế bào ở cùng một giai đoạn chu kỳ, khi đó hiệu suất dung hợp cũng sẽ cho cao nhất.

Virus:vỏ một số virus hiện diện những chất có hoạt tính kết nối. Cho virus nằm giữa hai tế bào, chúng sẽ mở màng hai bên, nhờ đó hai tế bào sẽ dung hợpđược. Đây là tác nhân được con người sử dụng thành công đầu tiên, ví dụ virus Sendai.

Sendai là virus động vật có màng chứa nhiều vị trí kết dính (attachment sites).Chúng có khả năng giữ các tế bào gần nhau và kéo dài rất chặt, làm màng của 2 tế bào dung hợp.Kết quả là hình thành thể tế bào chứa 2 nhân từ 2 loài khác nhau (heterokaryon).

Vi tiêm: bơm trực tiếp nhân của tế bào này vào trong một tế bào khác. Đây là phương pháp hiệu quả và an toàn nhất trong dung hợp tế bào.

Phương pháp poliethylenglicol (PEG) đã được áp dụng như một yếu tố dung hợp trong việc lai tế bào soma của nhiều loài động vật và thực vật. Nó cho hiệu quả tương đương với kỹ thuật chuyển DNA vào tế bào trần, với cùng lúc nhiều tế bào được chuyển nạp. Trong phương pháp PEG, gen lạ được chuyển nạp (Davey và ctv,1980) nhờ PEG kích hoạt sự dung hợp tế bào trần, tạo khả năng du nhập dễ dàng vào tế bào.

Dung hợp điện (electrofusion): Hai hay nhiều tế bào có thể được cảm ứng để hợp nhất thành một tế bào lớn bằng cách sử dụng các sung điện trong một điện trường ổn định. Quá trình này được ứng dụng để tạo tế bào lai, sản xuất kháng thể đơn dòng và liệu pháp miễn dịch. Kháng thể đơn dòng tạo ra bởi phương pháp này có độ đồng nhất cao hơn so với kháng thể đơn dòng tạo ra bởi các phương pháp khác. Electrofusion đã được dùng để hợp nhất bộ gen trong quá trình tạo phôi động vật. Electrofusion cũng có thể được dùng trong thí nghiệm để nghiên cứu các cơ chế của màng và sự hợp nhất của tế bào.

c. Một số đặc tính của tế bào lai

Các dòng tế bào lai thành công được nuôi cấy sẽ có sự khác biệt so với các tế bào ban đầu ở các đặc điểm: (1) có khả năng tạo thành khối u khi tiêm vào chuột mang tính tương hợp mô; (2) số lượng và hình thái NST thay đổi.

Sự hoạt hóa của nhân: Khi lai các tế bào mang nhân hoạt hóa như lympho bào của chuột hay tế bào ung thư Hela của người với tế bào mang nhân bất hoạt (ví dụ tế bào hồng cầu gà), có thể thu được tế bào lai có chứa cả nhân của hồng cầu gà và nhân của tế bào lympho chuột (khi lai với tế bào chuột), hoặc người (khi lai với tế bào Hela).

Trong môi trường tế bào chất của tế bào lai, nhân của hồng cầu gà được hoạt hóa thể hiện ở các hiện tượng đặc thù sau:

- Khối lượng nhân tăng. Có sự tạo thành hạch nhân và tạo nhiều ribosome.

- Có sự xuất nhập các protein người (nếu lai với Hela) từ tế bào chất vào nhân.

- Có sự tổng hợp DNA và RNA. Có sự tồn tại nhiều loại protein đặc trưng cho gà.

- Tạo tế bào lai syncaryon chứa một nhân, trong đó đa số NST của gà bị mất.

Sự tổng hợp RNA và DNA trong tế bào lai: khi nghiên cứu tiến trình tổng hợp các RNA và DNA trong tế bào lai giữa đại thực bào và melanom, người ta đã chứng minh sự tổng hợp DNA trong nhân của đại thực bào lại không phụ thuộc vào sự tổng hợp RNA và protein trong nhân của nó, mà phụ thuộc các nhân tố ở tế bào chất của tế bào melanom.

Điều hòa hoạt động của RNA và DNA trong tế bào lai: Khi tế bào lai được tạo ra từ hai tế bào có đặc tính hoạt hóa, hoặc bất hoạt khác nhau về tổng hợp RNA và DNA trong nhân, tế bào có hoạt tính cao sẽ kích thích nhân tế bào không có hoạt tính (hay hoạt tính thấp hơn). Nhân không có hoạt tính hay có hoạt tính thấp sẽ đạt mức tổng hợp RNA và DNA như ở nhân có hoạt tính cao hơn.

Sự biến đổi của bộ NST trong tế bào lai:phân tích bộ NST của tế bào lai có tầm quan trọng trong việc xác định các tế bào dung hợp có thật sự là tế bào lai hay không, điều này cho phép tìm hiểu nhiều vấn đề về cấu trúc, tâp tính lai của NST, cấu trúc hiển vi chứa thông tin di truyền của tế bào. Bằng phương pháp đánh dấu NST và các phương pháp tế bào khác (xác định kiểu nhân, nhuộm cắt băng, lai DNA), người ta đã làm sáng tỏ nhiều vấn đề về di truyền và biến dị của các tế bào lai soma.

Trong tế bào lai khác loài (chuột và người, chuột và khỉ, chuột và gà...) khi hai bộ NST của bố mẹ tổ hợp lai với nhau sẽ xảy ra sự biến mất một số NST của một trong hai bộ, hoặc cả hai bộ NST.

Các quần thể tế bào lai chứa bộ NST rất đa dạng về mức bội thể (heteropolyploid), điều này tùy thuộc loài, loại mô sử dụng, trạng thái NST của tế bào bố mẹ trước khi đem lai và cả trạng thái hoạt động của gen. Xu thế là NST nào bị tổn thương hoặc chứa nhiều gen hoạt động sẽ bị thải loại trong tế bào lai.

Số lượng NST bị mất cũng như tốc độ mất, tùy thuộc vào sự khác biệt chủng loại giữa tế bào bố mẹ, dòng tế bào lai và tùy thuộc cả thế hệ các tế bào.Ví dụ trong tế bào lai giữa chuột nhắt và chuột hamster, sự thải loại NST xảy ra chậm, còn trong tế bào lai giữa người với gà, thải loại NST xảy ra nhanh hơn trong giai đoạn sống đầu tiên, càng về sau sự thải loại càng chậm dần cho đến khi tế bào lai mang số NST ổn định (giữ lại 1-3 NST của người).

Giữa các dòng của cùng một tế bào lai, sự thải loại NST diễn ra rất khác nhau, ví dụ tế bào lai giữa chuột và người có dòng vẫn giữ nguyên bộ NST người suốt bốn tháng, trong khi dòng khác thải loại tới 50% số NST. Giữ lại hay thải loại NST này của bố hoặc mẹ ở tế bào lai xảy ra không ngẫu nhiên, mà tuân theo các cơ chế tương tác giữa hai bộ gen trong trạng thái tế bào chất chung của tế bào lai và với môi trường nuôi in vitro.

Sự biểu hiện của gen thành các tính trạng kiểu hình ở tế bào lai: Để kết luận về sự biểu hiện tính trạng, các tế bào lai phải được theo dõi số phận và đời sống qua các đặc tính biểu hiện. Ví dụ kiểu gen thành các tính trạng kiểu hình (chủ yếu là tổng hợp các protein, các enzyme), sự tạo các siêu cấu trúc, sự biệt hóa tế bào về hình thái và một số đặc tính sinh lý, sinh hóa khác nhau (như phản ứng với tác nhân kích thích, sự sinh sản và phát triển). Nói chung, nên dựa vào sự phân tích các tính chất sau:

-       Đặc tính hình thái, tốc độ tăng trưởng, sự ức chế tiếp xúc bề mặt và sự già (được gọi là kiểu đánh dấu A).

-       Các đặc tính sinh lý và miễn dịch, nhu cầu chất dinh dưỡng (kiểu đánh dấu B).

-       Sự biểu hiện các protein đặc trưng, ví dụ các enzyme, globulin miễn dịch, hormone (kiểu đánh dấu C).Được sử dụng nhiều nhất

-         Đặc tính nhạy cảm với các chất có hoạt tính sinh học nào đó (kiểu đánh dấu D).

Chọn hai dạng tế bào bố mẹ khác nhau một trong các đặc tính trên, xem đó là kiểu đánh dấu để theo dõi và phân tích ở tế bào lai.

d.   Chọn lọc dòng tế bào lai

Dựa trên môi trường chọn lọc, chỉ có tế bào lai mới phát triển được trên môi trường này.Sau đó, tách thu nhận tế bào đơn, nuôi cấy, kiểm tra việc tạo kháng thể của chúng.

Trường hợp cụ thể: lai giữa tế bào lympho B của chuột và tế bào ung thư tủy xương có kiểu hình HGPRT(-), không có enzyme hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase. HGPRT cần cho tổng hợp purine (A,G) từ hypoxanthine.Khi chuyển hỗn hợp tế bào lên môi trường HAT, aminopterin sẽ kìm hãm hoạt tính của dihydrofolate reductase vốn xúc tác tổng hợp purine. Chỉ có tế bào lai có đặc tính phân chia của tế bào ung thư và HGPRT của tế bào lách có thể tăng trưởng trên môi trường HAT.

e.   Phân tích gen của dòng tế bào lai

Phương pháp Southern blot: phát hiện chuỗi DNA có tính chất tương đồng với probe

Ứng dụng: xét nghiệm sự thể hiện gen được chuyển, chẩn đoán các bệnh di truyền, phát hiện các tác nhân gây bệnh là vi trùng, virus

Hai trường hợp: sử dụng hệ thống đồng vị phóng xạ, hệ thống đồng vị không phóng xạ

•      Đánh dấu đồng vị phóng xạ: phổ biến trong phân tích genome với RFLP. Sử dụng một loại phim để phát hiện thể probe được đánh dấu bằng P32

Trường hợp thứ hai, DNA được phân biệt trên agarose gel và được biến tính thành mạch đơn:

PPhương pháp Karyotype cổ điển:Tiến trình thông thường gồm việc bổ sung chất nhuộm (thường dùng Giemsa) vào NST ở giai đoạn metaphase. Tùy theo mục đích để sử dụng thuốc nhuộm có tác động khác nhau trên NST cần phân tích. Giemsa làm nhuộm màu các band trên NST.Mỗi NST sẽ được nhận diện bởi các vạch.

Karyotype cải tiến:sử dụng các thuốc nhuộm phát huỳnh quang có khả năng dính vào các vùng xác định của NST. Cho phép nhận biết ngẫu nhiên các NST được thay thế.Giúp phát hiện hiệu quả các NST thay đổi, vốn rất quan trọng cho các thử nghiệm lâm sàng trước và sau khi sinh, cũng như thử nghiệm ung thư và nhiều bệnh khác.

Sử dụng một dãy các probe đặc trưng cùng với một lượng thuốc nhuộm thay đổi, nhiều cặp NST khác nhau sẽ cóchung các giá trị quang phổ. Chúng có mức độ màu sắc thay đổi khác nhau, không thể quan sát bằng mắt thường mà phải thông qua chương trình phần mềm của máy vi tính để tạo ra hình ảnh quan sát được các vạch màu cho mỗi cặp NST,kết quả đầy màu sắc trên phim.

Ưu điểm của phương pháp là các cặp NST dễ phát hiện hơn vì các cặp tương đồng sẽ có cùng màu và các trạng thái bất thường hoặc có sự trao đổi chéo cũng dễ dàng nhận diện, phát hiện các vị trí thay đổi trên NST, vốn rất khó nhận diện bởi phương pháp phân tích bằng vạch thông thường.

FISH:Fluorescent In Situ Hybridization là một phương pháp quan trọng để xác định vị trí gen bằng huỳnh quang khi lai tại chỗ. NST được cố dịnh trên lame, DNA được làm biến tính thành mạch đơn và lai với mẫu thử đánh dấu của gen. Vị trí lai được xác định dưới kính hiển vi. Nếu DNA được đánh dấu bằng biotin thì tín hiệu được phát hiện bằng ánh sáng huỳnh quang của các phân tử gắn với protein avidin, chất này gắn đặc hiệu vào biotin.

II.3.2. Ứng dụng của tế bào lai

Tế bào lai có khả năng ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu và đời sống, đem lại nhiều lợi ích cho con người. Có các ứng dụng nổi bật:

Lập bản đồ gen:Nguyên tắc là lai tế bào sinh dưỡng của hai loài khác nhau. NST sau lần phân bào đầu tiên có sự phân chia không bình thường, một số tế bào mang nhiều NST người hơn và số tế bào còn lại mang phần còn lại

Sử dụng kỹ thuật này có thể tìm ra dòng tế bào mang các đặc điểm mong muốn, phù hợp với các NST khác của tế bào. Khi thực hiện trên hàng trăm ngàn các thử nghiệm kiểm tra hoạt động của NST, sẽ giúp xác định được các tế bào mang đặc tính mong muốn

Năm 1967, M.C.Weiss và H.Green sử dụng kỹ thuật lai tế bào soma, lần đầu tiên đã xác định được gen TK (mã hóa enzyme thymidine kinase) nằm trên NST 17.

Sản xuất kháng thể đơn dòng:Kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody – mAb) là tất cả hậu thế được tạo ra từ một tế bào lai (hybridoma) ban đầu, vì thế chúng hoàn toàn giống nhau. mAb được tạo ra liên tục từ tế bào lai trong môi trường nuôi cấy, chúng chỉ nhận diện duy nhất một yếu tố quyết định tính kháng nguyên, nhờ thế, tính đặc hiệu rất cao.

Trước 1975, chỉ có thể sản xuất kháng thể đa dòng bằng cách đưa vào động vật một kháng nguyên để tạo ra một đáp ứng miễn dịch, sau đó thu những kháng thể hiện diện trong máu của con vật.

Tuy nhiên, tính hiệu quả của kháng thể đa dòng thay đổi theo từng mẻ sản xuất.    

Vì vậy, vấn đề đặt ra là làm cách nào để tạo được một dòng tế bào có khả năng sinh sản trong môi trường nuôi cấy và tạo ra duy nhất một loại kháng thể có ái lực cao với kháng nguyên đặc hiệu.Những dòng tế bào như thế sẽ cung cấp một nguồn liên tục và ổn định các kháng thể đồng nhất.

Thật đáng tiếc, lympho B là tế bào duy nhất có khả năng tổng hợp kháng thể, nhưng lại không thể sản sinh trong môi trường nuôi in vitro.

=>Tạo ra một tế bào lai có thể giải quyết được vấn đề này. Tế bào lai sẽ mang gen của lympho B mã hóa cho kháng thể, đồng thời có chức năng phân chia của một tế bào tương thích để cho phép tế bào tăng trưởng trong môi trường nuôi.

Lympho B trong điều kiện bình thường thỉnh thoảng cũng bị đột biến thành tế bào ung thư (tế bào ung thư tủy xương). Các tế bào B đột biến này có khả năng tăng trưởng trong môi trường nuôi, trong khi vẫn giữ lại đặc tính của tế bào B. Vì thế, tế bào ung thư tủy xương, đặc biệt là các tế bào không sản xuất kháng thể, trở thành ứng cử viên cho việc dung hợp với tế bào B trong sản xuất kháng thể.

Năm 1975, những ý tưởng này đã trở thành hiện thực khi Kohler và Milstein nghiên cứu thành công một quy trình cho phép dung hợp tế bào ung thư tủy xương với tế bào lympho B từ lách của động vật đã được gây đáp ứng miễn dịch. Những tế bào dung hợp này vừa mang đặc tính phân chia liên tục của tế bào ung thư tủy xương, vừa có khả năng tạo ra kháng thể, chống lại kháng nguyên của tế bào lympho B lách chuột.

Quy trình này, cùng với phương pháppha loãng hạn chế cho phép tạo ra một dòng tế bào có khả năng tồn tại vĩnh viễn trong môi trường nuôi cấy (bởi tính bất tử - immortal character), mà vẫn tiếp tục tổng hợp kháng thể từ một tế bào dung hợp ban đầu.

II.4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH TẠO KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG

          II.4.1. Các nguyên tắc cơ bản

Chọn động vật chủ để gây đáp ứng miễn dịch và tế bào u tủy cho dung hợp tế bào:

          Vật chủ: Hầu hết các kháng thể được sản xuất đến nay được tạo ra từ việc sử dụng chuột chủng BALB/C, LOU/wsl bởi các tế bào u tủy có thể được phát triển từ các u bào tương cảm ứng trong chủng chuột này bằng cách tiêm dầu khoáng vào màng bụng. Nhìn chung, giá thành thấp và dễ dàng thao tác, các loài gặm nhấm là sự lựa chọn đầu tiên của các nhà nghiên cứu như là một nguồn các tế bào dòng lympho.

Tế bào cho dung hợp:

-         Tế bào u tủy:chọn lọc dựa vào sự mất enzyme hypoxanthene-guanine phosphoribosyl transferase (HGPRT) và do vậy chúng không thể sử dụng con đường chuyển hóa “cấp cứu” (salvage pathway) cho tổng hợp DNA khi có hiện diện chất ức chế tổng hợp folic acid là aminopterin.

-         Các tế bào lymphocyte bình thường không khuếch đại trong nuôi cấy, nhưng khi chứa gen HGPRT, các tế bào lai sẽ phát triển tốt trong môi trường có chứa aminopterin (A) được bổ sung với hypoxanthine và thymine (môi trường HAT).

          Các sản phẩm lai từ các tế bào khác loài thường không ổn định so với lai từ các tế bào giống nhau.

          Chọn lựa kháng miễn dịch

          Không cần thiết lắm phải sử dụng một kháng nguyên tinh sạch cho việc gây đáp ứng miễn dịch (mặc dù nó có thể tạo ra được một khác biệt về chất lượng gây đáp ứng miễn dịch). Các kháng nguyên có thể là các dịch chiết từ tế bào, cả tế bào hay những protein tái tổ hợp được sản xuất từ vi khuẩn, nấm men, tế bào côn trùng…

          Chuẩn bị kháng nguyên cho gây đáp ứng miễn dịch

-         Kháng nguyên hòa tan: Các protein hay các carbohydrate được sử dụng, chúng được trộn theo tỷ lệ 1/1 với tá dược Freund để tạo thành các nhũ tương ổn định bằng cách vortex – khi hút một giọt bằng Pasteur pipette cho vào bề mặt nước, chúng sẽ hình thành giọt ổn định ít nhất một giờ. Sử dụng tá dược thường cải thiện sự đáp ứng miễn dịch.

Tá dược Freund là một loại dầu, hoạt động như là một tác nhân giúp giải phóng các kháng nguyên chậm. Tá dược khác cũng được sử dụng là aluminium hydroxide hay các kháng thể gây tủa đặc biệt.

-            Các kháng nguyên tế bào sống: Cả tế bào, hoặc huyền phù của chúng bám dính sẽ được tách ra bằng trypsin/ EDTA, để sau đó tái huyền phù trong dung dịch PBS, hay môi trường không có huyết thanh và tiêm trực tiếp vào động vật mà không cần kèm tá dược.

-            DNA plasmid: Có thể tạo ra sự đáp ứng miễn dịch bởi sự chuyển trực tiếp các DNA vào mô cơ hay các mô khác. Một số tế bào cơ sẽ biểu hiện gen chuyên biệt và các protein tái tổ hợp có thể hoạt hóa hệ miễn dịch chủ. Một các khác, DNA trần hay các tiểu phần vàng được bao bọc DNA plasmid với nồng độ thấp có thể chuyển vào mô bằng súng bắn gen hay các phương pháp khác.

-         Các peptide: Các đoạn peptide chứa 20 – 30 amino acid thường chỉ gây đáp ứng kém hay không gây đáp ứng, do chúng thiếu các trình tự nhận diện bởi tế bào T helper. Do đó, các peptide nên kết hợp với các protein lớn hơn, chứa nhiều epitope hoạt hóa tế bào T. Việc kết hợp này có thể sử dụng glutaradehyde nối các peptide trong các cấu hình, hoặc bởi các cầu nối disulfide.

Phương pháp tiêm phổ biến

-            Tạo các tế bào lách miễn dịch: Để thu nhận được kháng thể chuyên biệt với hàm lượng cao trong huyết thanh, người ta thường tiêm cho chuột tại ba đến bốn vị trí dưới da hay vào cơ vùng bụng. Sự gây đáp ứng miễn dịch được lặp đi lặp lại từ hai đến bốn tuần, sau đó thu nhận máu từ cơ hay từ cổ để xác định sự xuất hiện của kháng thể mong muốn.

Việc gây đáp ứng miễn dịch sẽ kích thích sản xuất các tế bào B và các tiền thân của chúng trong các hạch lympho địa phương và lách.Các tế bào tiết kháng thể trưởng thành dung hợp kém với các tế bào u tủy, và do đó nên sử dụng các tế bào tiền thân. Do nguyên nhân này mà các động vật sẽ được tiêm mũi kháng nguyên cuối cùng chừng hai đến ba ngày trước khi tế bào lách hay tế bào hạch lympho được thu nhận.

-            Gây miễn dịch thông qua các vết đốm Peyer của chuột: Ở chuột, tế bào từ các hạch lympho là một nguồn đặc biệt. Người ta thường sử dụng tế bào từ các hạch treo ruột của động vật gây miễn dịch, thông qua các vết đốm của hạch Peyer. Giống với việc thu nhận lách, động vật được tiêm lần nữa trước ba ngày tách hạch treo ruột.

Sự phát triển các dòng tế bào u tủy

Cũng có thể sử dụng hai chủng chuột (NS1/1 Ag4.1 và Sp2/0) và dòng tế bào u tủy Y3Ag1.2.3 để tạo ra các tế bào lai cùng loài (chuột × chuột). Các tế bào u tủy có thể nuôi tăng sinh trong các dụng cụ nhựa với môi trường thích hợp. Trong nuôi cấy tĩnh, tế bào u tủy Y3 phát triển như một dòng tế bào bám dính, do vậy sẽ không dung hợp được với các lymphocyte. Do đó, phải nuôi chúng ở dạng huyền phù đơn trong bình quay.

-       Dung hợp tế bào: các tế bào lách và tế bào u tủy được trộn chung, chúng sẽ tạo thành các cụm tế bào khi ly tâm. Thêm vào một lượng nhỏ dung dịch PEG (polyethylenglycol), các cụm tế bào sẽ được tách ra một cách nhẹ nhàng. PEG làm biến đổi cấu trúc của lớp lipid trên màng plasma, từ đó phá vỡ một phần màng của hai tế bào kế cận và tạo ra sự sát nhập hai màng. Kết quả là hai tế bào này hợp nhất thành một tế bào dị hợp (heterocaryon/ heterokaryon) mang bộ gen với số lượng NST ban đầu gấp đôi.

PEG là một chất độc nên cần được sử dụng ở mức tối thiểu. Các tế bào sau khi dung hợp được rửa nhằm loại bỏ PEG và chuyển qua môi trường HAT để hồi sức, sau đó chúng được nuôi trong các đĩa 24 giếng.

-         Lựa chọn:

Không phải tất cả các tế bào đều được dung hợp dưới tác dụng của PEG và cũng có rất nhiều tế bào dung hợp là thể đồng hợp.

          Những tế bào myeloma (tế bào đơn ban đầu và tế bào tự dung hợp) sẽ phát triển lấn át các tế bào dung hợp trong môi trường nuôi cấy, do đó cần phải chọn lọc để loại đi các tế bào không phải tế bào dung hợp mong muốn.

          Tế bào lai được sàng lọc cơ bản dựa trên khả năng tăng trưởng trong môi trường HAT mà cả tế bào lách và các tế bào myeloma đều không thể tăng trưởng được.

          Những tế bào lai sống sót được chuyển sang nuôi trong môi trường HT (hypoxanthine thymidine) khoảng 7 – 10 ngày để giảm độc tố của aminopretin đến mức tối thiểu.

          Sau đó tế bào được thay môi trường ISCOVE’S MDM để tạo sự tăng trưởng tối đa.

          Các đĩa được theo dõi trong 2 – 4 tuần kế tiếp để nhận biết sự xuất hiện của các tập đoàn tế bào.

(Tế bào myeloma cung cấp cho tế bào lai khả năng phát triển trong môi trường nuôi cấy (tính bất tử) và tế bào lá lách cung cấp chức năng HGPRT.

Các tế bào myeloma sẽ chết khi nuôi trong môi trường HAT vì chúng là thể HGPRT- không thể tự tổng hợp purine và sự tổng hợp purine theo con đường de novo thì đã bị ức chế bởi sự hiện diện của aminopretin. Các tế bào lách có enzyme HGPRT, nhưng bị giới hạn khả năng phát triển trong nuôi cấy (không có tính bất tử như tế bào ung thư myeloma), sẽ chết trong vòng hai tuần vì hết tuổi đời. Như vậy, chỉ có tế bào hybridoma có thể phát triển trong môi trường có sự hiện diện của HAT).

-       Sàng lọc: Mục đích là xác định các giếng nào có chứa mAbs đặc hiệu mong muốn.

Các giếng có thể chứa các tế bào hybridoma không tạo kháng thể hoặc tạo ra các kháng thể không mong muốn.

+ Tiến hành thử nghiệm miễn dịch được sử dụng cho sàng lọc (thử miễn dịch liên kết enzyme – enzyme linked immunosorbent assay hay ELISA),môi trường trong các giếng có biểu hiện tăng trưởng được kiểm tra tìm kháng thể.

+ Các tế bào sản xuất mAb đặc hiệu mong muốn (xác định bằng ELISA) được đem tạo dòng hoặc đông lạnh trong nitơ lỏng.

-       Tạo dòng: Các giếng nuôi thường chứa một hỗn hợp các hybridoma. Thêm nữa, một vài hybridoma mất khả năng sản xuất kháng thể do mất NST. Cho nên việc ngăn ngừa các hybridoma không thích hợp phát triển, lấn át các hybridoma quan tâm là rất quan trọng, do vậy phải tạo dòng các hybridoma quan tâm.

Có hai cách:

phương pháp agar mềm: việc tạo dòng các hybridoma được tiến hành trên môi trường bán rắn (môi trường agar có nồng độ thấp), chúng sẽ phát triển thành các tập đoàn. Ưu điểm của phương pháp agar mềm là có thể tạo được một tập đoàn bắt nguồn từ một tế bào đơn. Tuy nhiên, nhiều hybridoma không thể mọc được trên môi trường agar mềm.

phương pháp pha loãng tới hạn: các tế bào được nuôi trong các giếng ở một nồng độ tính toán sao cho mỗi giếng chỉ có một tế bào.

Với cả hai phương pháp, mục đích cuối cùng là phải tạo dòng hybridoma vài chu kỳ cho đến khi thu được hybridoma ổn định.

-         Sản xuất: Một số lượng lớn mAbs có thể được sản xuất bởi cả phương pháp nuôi cấy trong ống nghiệm, hay thông qua các thế hệ chuột có khối u ascites. mAbs sản xuất trong ống nghiệm đôi khi quá loãng và nói chung thường bị nhiễm bởi các thành phần huyết thanh bò (bovine serum) trong môi trường. Do đó, phải tinh sạch và cô đặc mAb.

Ascites được sản xuất bởi tiêm hybridoma vào màng bụng của chuột.Các tế bào hybridoma sẽ tạo một khối u ascites và tiết mAbs vào màng bụng chuột. Dịch ascites sau vài tuần được thu lại. Ascites có thể sản xuất kháng thể ở nồng độ rất cao.Dịch ascites còn một ưu điểm khác là ít khi bị nhiễm bởi các IgG khác ở chuột.

Việc tạo ra kháng thể đơn dòng không chỉ dựa trên phương pháp tạo dòng lai tế bào chuột-chuột, mà còn có thể lai giữa các dòng tế bào những loài khác như thỏ hay người. Tuy nhiên, đến nay, tạo kháng thể đơn dòng trên chuột vẫn là phương pháp thành công nhất. Điển hình là phương pháp sản xuất kháng thể đơn dòng dựa trên việc dung hợp tế bào lách chuột Balb/C với dòng tế bào ung thư tủy xương Myeloma Sp2/0 ở chuột.

Hình 11.5. Quy trình cơ bản tạo kháng thể đơn dòng từ chuột

II.4.2. Tạo kháng thể đơn dòng từ cơ thể người

Các quy trình trên mang lại đầy hứa hẹn, nhưng vẫn còn bất lợi khi phải dùng phản ứng nối hóa học và các kháng thể thu được lại không có nguồn gốc từ con người.

Hiệu ứng các phản ứng nối hóa học rất thấp và sự bắt cặp lại xảy ra ở các vị trí ngẫu nhiên.Các quy trình hóa học cũng có thể làm mất hoạt tính enzyme, hay thậm chí chỉ sử dụng được phân nửa trong số đó.Tóm lại, thành phần kháng thể vẫn nên có nguồn gốc từ người để ngăn chặn các phản ứng miễn dịch chéo và tính mẫn cảm ở bệnh nhân.

Rất khó để tạo nên kháng thể đặc hiệu không phản ứng chéo, vì như thế cần phải thu được các kháng thể đơn dòng từ người, bằng các kỹ thuật tế bào lai cổ điển.

-       Các tế bào dung hợp từ tế bào ung thư tủy xương chuột và lympho bào chứa NST người thường kém ổn định, vì thế tế bào tạo được các kháng thể đơn dòng có nguồn gốc từ người là cực kỳ hiếm.

-       Sẽ không hiệu quả khi các dòng tế bào ung thư tủy xương người được thay thế bằng dòng tế bào ung thư tủy xương chuột.

-       Vì tính đạo lý, không thể chấp nhận việc gây miễn dịch cho người bình thường với nhiều kháng nguyên khác nhau.

Chính vì những lý do trên, các nhà khoa học đã nỗ lực nhằm tìm ra một cách tiếp cận khác để thu được kháng thể đơn dòng có nguồn gốc từ người.

     Phương pháp cơ bản

          Nguyên tắc: hoạt hóa tế bào người để tạo kháng thể và xử lý với kháng nguyên chỉ thị có đánh dấu huỳnh quang.

-       Sàng lọc các tế bào B bằng kỹ thuật phát huỳnh quang. Bản thân tế bào B không tăng sinh trên môi trường nuôi, do đó chúng cần được biến nạp bằng virus Epstein-Barr để phát triển ổn định. Một số dòng tế bào B biến nạp có thể tiết kháng thể đơn dòng nguồn gốc từ người, nhằm phản ứng với các kháng nguyên chọn lọc.

-       Đưa tế bào có nguồn gốc từ hệ thống miễn dịch người vào một chủng chuột đã bị đột biến mất hầu hết các phần quan trọng trong hệ thống miễn dịch tự nhiên của chúng.

Sau khi ghép các tế bào gốc của hệ thống miễn dịch người vào chuột, con chuột này sẽ thu nạp hệ thống miễn dịch từ người và chúng có thể sản xuất kháng thể có nguồn gốc từ người. Nhược điểm của phương pháp này là năng suất rất thấp, ái lực của kháng thể đơn dòng với kháng nguyên rất yếu.Hơn nữa, do các cá nhân không được gây miễn dịch, cho nên tế bào tiết kháng thể nhận diện được kháng nguyên mục tiêu cũng rất thấp.

Phương pháp khác

-       Đưa gen miễn dịch người vào các dòng tế bào gốc của chuột để tạo nên chuột chuyển gen, nhằm tạo ra Ig người sau khi gây miễn dịch với kháng nguyên đặc hiệu.

-         Phân lập các tế bào tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu từ chuột chuyển gen bằng phương pháp tế bào lai chuẩn. Sàng lọc các dòng tế bào có phản ứng dương tính.

-         Xác định dòng tế bào sản xuất kháng thể được mã hóa từ gen của người.

Phương pháp này có thể tạo ra chuột chuyển gen có biểu hiện dạng tự nhiên của cả hai gen mã hóa cho chuỗi nặng và chuỗi nhẹ của phân tử kháng thể.

Việc nhân tính hóa chuột khiếm khuyết hệ thống miễn dịch và việc tạo ra dòng chuột chuyển gen đều là cách thủ công để sản xuất kháng thể đơn dòng người. Chiến lược sử dụng kỹ thuật gen có tính công nghiệp hơn, nhằm tạo ra kháng thể liệu pháp cho người và các protein có hiệu quả kết hợp với mục tiêu và tiêu hủy chúng.

II.4.3. Kháng thể đơn dòng từ tế bào lai người-chuột

Sự điều chỉnh tự nhiên các chức năng của kháng thể làm cho chúng biến đổi từ kháng thể đơn dòng chuột sang dạng có chứa một phần kháng thể người, nhưng vẫn giữ được tính đặc hiệu kết nối với kháng nguyên ban đầu. Dạng lai này được gọi là kháng thể khảm (chimaeric antibody) hay kháng thể có “tính người” (“humanized” antibody).

Phương pháp cơ bản

-         Thay thế phân đoạn Fc của kháng thể đơn dòng bằng trình tự đó từ người (phân đoạn Fc có vai trò hoạt hóa đáp ứng miễn dịch và kích thích tạo kháng thể ở người).

-         Thay trình tự DNA mã hóa cho vùng Fv của cả hai chuỗi nặng và nhẹ trong kháng thể người bằng trình tự DNA mã hóa cho chuỗi nặng và nhẹ từ kháng thể đơn dòng của chuột.

Mục đích

-            Giảm tính quá mẫn, đưa nhân tố hoạt hóa Fc có hoạt tính từ người vào chuột.

-            Tạo dòng DNA của cả hai chuỗi ghép bằng một vector biểu hiện và biến nạp vào tế bào lympho B đã nuôi cấy.

-            Chọn lọc các kháng thể ghép: Khi kháng thể ghép chứa các vị trí kết hợp từ kháng thể đơn dòng chuột tương tác trực tiếp với bề mặt tế bào ung thư kết tràng, kháng thể tồn tại trong hệ thống tuần hoàn lâu hơn khoảng sáu lần so với kháng thể đơn dòng hoàn toàn từ chuột, vì vậy, làm tăng thời gian tác động. Tuy nhiên chúng không có khả năng chống ung thư. Nguyên nhân có lẽ do việc sử dụng kháng thể với liều thấp hay do giai đoạn sớm của ung thư trong đối tượng. Trong nghiên cứu in vivo, loại kháng thể ghép này có hoạt tính rất cao và người ta vẫn hy vọng rằng, các phân tử này trong chừng mực nào đó, có thể phá hủy các cấu trúc tế bào khối u mục tiêu.

Phương pháp khác

-         Thay vào kháng thể người phần CDR của kháng thể đơn dòng chuột. Các kháng thể ghép nối này có ái lực với kháng nguyên tương tự như kháng thể đơn dòng chuột ban đầu, do đó chúng có thể là các yếu tố liệu pháp hiệu quả.

-            Thu nhận cDNA ở dòng tế bào lai từ loài gặm nhấm mã hóa chuỗi nặng và nhẹ.

-            Khuếch đại vùng biến đổi của cDNA bằng PCR. Các đoạn mồi oligonucleotide dùng trong phản ứng khuếch đại phải bắt cặp bổ sung theo chiều 5’-3’ của đoạn DNA mã hóa cho vùng biến đổi, nơi có trình tự bảo tồn rất cao đối với từng kháng thể.

-            Tạo CDR từ trình tự nucleotide của cDNA mã hóa chuỗi nặng và nhẹ (VH và VL).

-            Dịch mã để xác định vùng nào mã hóa cho CDR, vì vùng này có trình tự biến đổi rất lớn trong khi trình tự khung đọc mở lại cố định.

-         Tổng hợp 6 cặp mồi PCR oligonucleotide dựa trên trình tự DNA mã hóa CDR của loài gặm nhấm. Mỗi cặp mồi được thiết kế để khởi động quá trình tổng hợp DNA cho một trong sáu CDR của loài gặm nhấm (ba của chuỗi nặng, ba của chuỗi nhẹ). Ngoài ra, mỗi cặp mồi (primer – P) có thêm 12 nucleotide ở đầu 5’; bổ sung với vùng không mã hóa (flanking region – FR) bên sườn khung đọc mở của DNA người mã hóa cho CDR loài gặm nhấm.

-            Thay thế toàn bộ trình tự DNA của CDR người bằng DNA được khuếch đại từ CDR loài gặm nhấm bằng cách gây đột biến gen liên quan đến các nucleotide này. Mỗi chu kỳ sẽ thay thế dần một CDR. Quá trình này, nếu hiệu quả sẽ ghép CDR của loài gặm nhấm vào trong phân đoạn kháng thể người.

-            Dòng hóa những cDNA mã hóa cho vùng biến đổi được nhân tính hóa vào một vector biểu hiện, đưa vector này vào tế bào chủ thích hợp, thường là E.colihay tế bào động vật có vú, để tạo ra kháng thể.

Chỉ có CDR, chứ không phải là cả phân đoạn đóng góp vào khả năng kết hợp kháng nguyên của một kháng thể.Tuy nhiên, nếu kháng thể nhân tính hóa này không kết nối đủ chặt với kháng nguyên mục tiêu thì thực hiện biến đổi một vài acid amin trong phân đoạn, bằng các đột biến liên quan trực tiếp tới các oligonucleotide.

Ngày nay, quy trình này đã được ứng dụng để tạo ra hơn 50 kháng thể đơn dòng khác nhau có chứa gen người. Chắc chắn một điều là trong tương lai, các thư viện tái tổ hợp (biểu hiện qua phage các cấu trúc của mRNA từ tế bào lympho B người, của các động vật cho không được gây đáp ứng miễn dịch), sẽ là cách thích hợp để sản xuất kháng thể đơn dòng và phân đoạn các kháng thể.

Tinh sạch các kháng thể đơn dòng

-       Phân tách sử dụng protein A: Sắc ký ái lực protein A được sử dụng rộng rãi cho tinh sạch kháng thể (và một số trường hợp khác) là lý tưởng nhất, có thể thu được kháng thể tinh sạch đến 95% chỉ trong một bước. Kết quả phân tách rất hiệu quả với endotoxin, DNA và virus. Protein A được tách từ phương pháp này có hoạt tính miễn dịch in vivo.

Một biến tấu khác của protein A cũng được sử dụng (Protein G). Trong tất cả các trường hợp, việc rửa được tiến hành bằng dung dịch đệm pH thấp. Đối với hầu hết các kháng thể, cần đưa pH về gần trung tính và pha loãng để tránh các tác động của bất kỳ tác nhân nào có thể làm hư hại kháng thể.

-       Tinh sạch kháng thể đơn dòng bằng trao đổi ion: Bất lợi của protein A và các hệ thống tương tự là chi phí cao, một số kháng thể lọt qua, các điều kiện tiến hành nghiêm ngặt và không hiệu quả với Ig, do vậy một vài chiến lược khác đã được thử nghiệm, chủ yếu là tiến hành hệ thống trao đổi ion.

-            Những chiến lược khác để tinh sạch kháng thể đơn dòng: Sắc ký ái lực kim loại cố định (Immobilized metal affiniti chromatography – IMAC) cũng cho thấy hiệu quả cho việc tinh sạch các immunoglobulin. Cơ chế gắn kết này phụ thuộc sự hiện diện của histidine bảo tồn cao ở vùng Cg3 của tất cả các phân tử kháng thể động vật có vú.

Hydroxyapatite gần đây cũng được dùng cho tinh sạch các kháng thể đơn dòng.