Bài 2 Những đặc điểm chung của Vi Sinh Vật

1-Vi sinh vật thuộc giới sinh vật nào?

Vi sinh vật không phải là một nhóm phân loại trong sinh giới mà là bao gồm tất cả các sinh vật có kích thước hiển vi, không thấy rõ được bằng mắt thường, do đó phải sử dụng kính hiển vi thường hoặc kính hiển vi điện tử. Ngoài ra muốn nghiên cứu vi sinh vật người ta phải sử dụng tới phương pháp nuôi cấy vô khuẩn.

Từ trước đến nay có rất nhiều hệ thống phân loại sinh vật. Các đơn vị phân loại sinh vật nói chung và vi sinh vật nói riêng đi từ thấp lên cao là Loài (Species), Chi (Genus), Họ (Family), Bộ (Order), Lớp (Class), Ngành (Phylum), và Giới (Kingdom). Hiện nay trên giới còn có một mức phân loại nữa gọi là lĩnh giới (Domain). Đấy là chưa kể đến các mức phân loại trung gian như Loài phụ (Subspecies), Chi phụ (Subgenus), Họ phụ (Subfamily), Bộ phụ (Suborder),Lớp phụ (Subclass), Ngành phụ (Subphylum).

John Ray Carl Von Linnaeus

Xưa kia John Ray (1627-1705) và Carl Von Linnaeus (1707-1778) chỉ chia ra 2 giới là Thực vật và Động vật. Năm 1866 E. H. Haeckel (1834-1919) bổ sung thêm giới Nguyên sinh (Protista).

Năm 1969 R. H. Whitaker (1921-1981) đề xuất hệ thống phân loại 5 giới : Khởi sinh (Monera), Nguyên sinh (Protista), Nấm (Fungi), Thực vật (Plantae) và Động vật (Animalia).

Khởi sinh bao gồm Vi khuẩn (Bacteria) và Vi khuẩn lam (Cyanobacteria).

Nguyên sinh bao gồm Động vật nguyên sinh (Protzoa),

Tảo (Algae) và các Nấm sợi sống trong nước (Water molds).

Gần đây hơn có hệ thống phân loại 6 giới- như 5 giới trên nhưng thêm giới Cổ vi khuẩn (Archaebacteria),

giới Khởi sinh đổi thành giới Vi khuẩn thật (Eubacteria) (P. H. Raven, G. B. Johnson, 2002).

Cổ vi khuẩn và Vi khuẩn thật thuộc Còn

T. Cavalier-Smith (1993) thì lại đề xuất hệ thống phân loại 8 giới:

Vi khuẩn thật (Eubacteria),

Cổ vi khuẩn (Archaebacteria),

Cổ trùng (Archezoa),

Sắc khuẩn (Chromista),

Nấm (Fungi),

Thực vật (Plantae) và

Động vật (Animalia).

Theo R. Cavalier-Smith thì

Cổ trùng (như Giardia) bao gồm các cơ thể đơn bào nguyên thuỷ có nhân thật, có ribosom 70S, chưa có bộ máy Golgi, chưa có ty thể (mitochondria) chưa có thể diệp lục (Chloroplast), chưa có peroxisome.

Sắc khuẩn bao gồm phần lớn các cơ thể quang hợp chứa thể diệp lục trong các phiến (lumen) của mạng lưới nội chất nhăn (rough endpplasmic reticulum) chứ không phải trong tế bào chất (cytoplasm), chẳng hạn như Tảo silic , Tảo nâu, Cryptomonas, Nấm noãn.

Năm 1980, Carl R. Woese dựa trên những nghiên cứu sinh học phân tử phát hiện thấy Cổ khuẩn có sự sai khác lớn trong trật tự nucleotid ở ARN của ribosom 16S và 18S. Ông đưa ra hệ thống phân loại ba lĩnh giới (Domain) bao gồm

Cổ khuẩn (Archae),

Vi khuẩn (Bacteria) và

Sinh vật nhân thực (Eucarya).

Cổ khuẩn là nhóm vi sinh vật có nguồn gốc cổ xưa. Chúng bao gồm các nhóm vi khuẩn có thể phát triển được trong các môi trường cực đoan (extra), chẳng hạn như nhóm ưa mặn (Halobacteriales), nhóm ưa nhiệt (Thermococcales, Thermoproteus, Thermoplasmatales), nhóm kỵ khí sinh mêtan (Methanococcales, Methanobacteriales, Methanomicrobiales), nhóm vi khuẩn lưu huỳnh ưa nhiệt (Sulfobales, Desulfurococcales).

Monera trong hệ thống 5 giới tương đương với Vi khuẩn và Cổ khuẩn trong hệ thống 8 giới và trong hệ thống 3 lĩnh giới. Nguyên sinh trong hệ thống 5 giới tương đương với 3 giới Cổ trùng (Archaezoa), Nguyên sinh (Protista-Protozoa) và Sắc khuẩn (Chromista) trong hệ thống 8 giới và tương đương với 5 nhóm sau đây trong hệ thống 3 lĩnh giới (domain): Archaezoa, Euglenozoa, Alveolata, Stramenopila và Rhodophyta.

Theo hệ thống 3 lĩnh giới thì Archaezoa bao gồm Diplomonad, Trichomonad và Microsporidian. Euglenozoa ao gồm Euglenoid và Kinetoplastid. Alveolata bao gồm Dinoflagellate, Apicomplexan, và Ciliate. Strmenopila bao gồm Tảo silic (Diatoms) , Tảo vàng (Golden algae), Tảo nâu (Brown algae) và Nấm sợi sống trong nước (Water mold) . Rhodophyta gồm các Tảo đỏ (Red algae). Riêng Tảo lục (Green algae) thì một phần thuộc Nguyên sinh (Protista) một phần thuộc Thực vật (Plantae)

Hệ thống phân loại 6 giới sinh vật

Hệ thống 3 lĩnh giới (domain)

Monera hay 2 lĩnh giới Vi khuẩn và Cổ khuẩn thuộc nhóm Sinh vật nhân sơ (Prokaryote), còn các sinh vật khác đều thuộc nhóm Sinh vật nhân thật (Eukaryote). Sai khác giữa 3 lĩnh giới Bacteria, Archaea và Eukarya được trình bày trên bảng dưới đây:

***- So sánh ba lĩnh giới Bacteria, Archaea và Eukarya

Đặc điểm Bacteria Archaea Eukarya

Nhân có màng nhân và hạch nhân Không Không Có

Phức hợp bào quan có màng Không Không Có

Thành tế bào Hầu hết có peptidoglycan chứa acid muramic Nhiều loại khác nhau, không chứa acid muramic Không chứa acid muramic

Màng lipid Chứa liên kết este, các acid béo mạch thẳng Chứa liên kết ete, các chuỗi aliphatic phân nhánh Chứa liên kết este, các acid béo mạch thẳng

Túi khí Có Có Không

ARN vận chuyển Thymine có trong phần lớn tARN

tARN mở đầu chứa N-formylmethionine

Không có thymine trong nhánh T hoặc TyC của tARN

tARN mở đầu chứa methionine

Có thymine

tARN mở đầu chứa methionine

mARN đa cistron Có Có Không

Intron trong mARN Không Không Có

Ghép nối, gắn mũ và gắn đuôi polyA vào mARN Không Không Có

Ribosom

Kích thước 70S 70S 80S (ribosom tế bào chất)

Yếu tố kéo dài EF2 Không phản ứng với độc tố bạch hầu Có phản ứng Có phản ứng

Mẫn cảm với cloramphenicol và kanamycin Mẫn cảm Không Không

Mẫn cảm với anisomycin Không Mẫn cảm Mẫn cảm

ARN polymerase phụ thuộc ADN

Số lượng enzym Một Một số Ba

Cấu trúc 4 tiểu đơn vị 8-12 tiểu đơn vị 12-14 tiểu đơn vị

Mẫn cảm với rifampicin Mẫn cảm Không Không

Promoter typ Polymerase II Không Có Có

Trao đổi chất

Tương tự ATPase Không Có Có

Sinh methane Không Có Không

Cố định N2 Có Có Không

Quang hợp với diệp lục Có Không Có

Hoá dưỡng vô cơ Có Có Không

Để hiểu được chi tiết nội dung ghi trong bảng nói trên giáo viên cần giải thích cho sinh viên những kiến thức cơ bản thuộc giáo trình Tế bào học và Di truyền học

Phần lớn vi sinh vật thuộc về ba nhóm Cổ khuẩn, Vi khuẩn và Nguyên sinh. Trong giới Nấm, thì nấm men (yeast), nấm sợi (filamentous Fungi) và dạng sợi (mycelia) của mọi nấm lớn đều được coi là vi sinh vật. Như vậy là vi sinh vật không có mặt trong hai giới Động vật và Thực vật. Người ta ước tính trong số 1,5 triệu loài sinh vật có khoảng 200 000 loài vi sinh vật (100 000 loài động vật nguyên sinh và tảo, 90 000 loài nấm, 2500 loài vi khuẩn lam và 1500 loài vi khuẩn). Tuy nhiên hàng năm, có thêm hàng nghìn loài sinh vật mới được phát hiện, trong đó có không ít loài vi sinh vật.

Virus là một dạng đặc biệt chưa có cấu trúc cơ thể cho nên chưa được kể đến trong số 200 000 loài vi sinh vật nói trên. Số virus đã được đặt tên là khoảng 4000 loài.

Poliovirus Virus cúm gà H5N1 Virus HIV/AIDS

Trong thực tế, số loài vi sinh vật phải tới hàng triệu loài. Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật (VTCC) thuộc TT Công nghệ Sinh học, ĐHQG Hà Nội hợp tác với các nhà khoa học Nhật bản và dựa trên các kỹ thuật sinh học phân tử đã bước đầu phát hiện được khá nhiều loài vi sinh vật mới được thế giới công nhận.

2-Các đặc điểm chung của vi sinh vật :

Vi sinh vật có các đặc điểm chung sau đây :

1)-Kích thước nhỏ bé :

Vi sinh vật thường được đo kích thước bằng đơn vị micromet (1mm= 1/1000mm hay 1/1000 000m). virus được đo kích thước đơn vị bằng nanomet (1nn=1/1000 000mm hay 1/1000 000 000m).

Kích thước càng bé thì diện tích bề mặt của vi sinh vật trong 1 đơn vị thể tích càng lớn. Chẳng hạn đường kính của 1 cầu khuẩn (Coccus) chỉ có 1mm, nhưng nếu xếp đầy chúng thành 1 khối lập nhưng có thể lích là 1cm3 thì chúng có diện tích bề mặt rộng tới ...6 m2 !

2)-Hấp thu nhiều, chuyển hoá nhanh :

Tuy vi sinh vật có kích thước rất nhỏ bé nhưng chúng lại có năng lực hấp thu và chuyển hoá vượt xa các sinh vật khác. Chẳng hạn 1 vi khuẩn lắctic (Lactobacillus) trong 1 giờ có thể phân giải được một lượng đường lactose lớn hơn 100-10 000 lần so với khối lượng của chúng. tốc độ tổng hợp protein của nấm men cao gấp 1000 lần so với đậu tương và gấp 100 000 lần so với trâu bò.

3) Sinh trưởng nhanh, phát triển mạnh :

Chẳng hạn, 1 trực khuẩn đại tràng (Escherichia coli ) trong các điều kiện thích hợp chỉ sau 12-20 phút lại phân cắt một lần. Nếu lấy thời gian thế hệ là 20 phút thì mỗi giờ phân cắt 3 làn, sau 24 giờ phân cắt 72 lần và tạo ra 4 722 366 500 000 000 000 000 000 tế bào (4 722 366. 1017), tương đương với 1 khối lượng ... 4722 tấn. Tất nhiên trong tự nhiên không có được các điều kiện tối ưu như vậy ( vì thiếu thức ăn, thiếu oxy, dư thừa các sản phẩm trao đổi chất có hại...). Trong nòi lên men với các điều kiện nuôi cấy thích hợp từ 1 tế bào có thể tạo ra sau 24 giờ khoảng 100 000 000- 1 000 000 000 tế bào. Thời gian thế hệ của nấm men dài hơn, ví dụ với men rượu (Saccharomyces cerevisiae) là 120 phút. Với nhiều vi sinh vật khác còn dài hơn nữa, ví dụ với tảo Tiểu cầu ( Chlorella ) là 7 giờ, với vi khuẩn lam Nostoc là 23 giờ...Có thể nói không có sinh vật nào có tốc độ sinh sôi nảy nở nhanh như vi sinh vật.

4) Có năng lực thích ứng mạnh và dễ dàng phát sinh biến dị :

Trong quá trình tiến hoá lâu dài vi sinh vật đã tạo cho mình những cơ chế điều hoà trao đổi chất để thích ứng được với những điều kiện sống rất khác nhau, kể cả những điều kiện hết sức bất lợi mà các sinh vật khác tgường không thể tồn tại được. Có vi sinh vật sống được ở môi trường nóng đến 1300C, lạnh đến 0-50C, mặn đến nồng độ 32% muối ăn, ngọt đến nồng độ mật ong, pH thấp đến 0,5 hoặc cao đến 10,7, áp suất cao đến trên 1103 at. hay có độ phóng xạ cao đến 750 000 rad. Nhiều vi sinh vật có thể phát triển tốt trong điều kiện tuyệt đối kỵ khí, có noài nấm sợi có thể phát triển dày đặc trong bể ngâm tử thi với nộng độ Formol rất cao...

Vi sinh vật đa số là đơn bào, đơn bội, sinh sản nhanh, số lượng nhiều, tiếp xúc trực tiếp với môi trường sống ... do đó rất dễ dàng phát sinh biến dị. Tần số biến dị thường ở mức 10-5-10-10. Chỉ sau một thời gian ngắn đã có thể tạo ra một số lượng rất lớn các cá thể biến dị ở các hế hệ sau. Những biến dị có ích sẽ đưa lại hiệu quả rất lớn trong sản xuất. Nếu như khi mới phát hiện ra penicillin hoạt tính chỉ đạt 20 đơn vị/ml dịch lên men (1943) thì nay đã có thể đạt trên 100 000 đơn vị/ml. Khi mới phát hiện ra acid glutamic chỉ đạt 1-2g/l thì nay đã đạt đến 150g/ml dịch lên men (VEDAN-Việt Nam).

5) Phân bố rộng, chủng loại nhiều :

Vi sinh vật có mặt ở khắp mọi nơi trên Trái đất, trong không khí, trong đất, trên núi cao, dưới biển sâu, trên cơ thể, người, động vật, thực vật, trong thực phẩm, trên mọi đồ vật...

Vi sinh vật tham gia tích cực vào việc thực hiện các vòng tuần hoàn sinh-địa-hoá học (biogeochemical cycles) như vòng tuần hoàn C, vòng tuần hoàn n, vòng tuần hoàn P, vòng tuần hoàn S, vòng tuần hoàn Fe...

Trong nước vi sinh vật có nhiều ở vùng duyên hải (littoral zone), vùng nước nông (limnetic zone) và ngay cả ở vùng nước sâu (profundal zone), vùng đáy ao hồ (benthic zone).

Trong không khí thì càng lên cao số lượng vi sinh vật càng ít. Số lượng vi sinh vật trong không khí ở các khu dân cư đông đúc cao hơn rất nhiều so với không khí trên mặt biển và nhất là trong không khí ở Bắc cực, Nam cực...

Hầu như không có hợp chất carbon nào (trừ kim cương, đá graphít...) mà không là thức ăn của những nhóm vi sinh vật nào đó (kể cả dầu mỏ, khí thiên nhiên, formol. dioxin...). Vi sinh vật có rất phong phú các kiểu dinh dưỡng khác nhau : quang tự dưỡng (photoautotrophy), quang dị dưỡng (photoheterotrophy), hoá tự dưỡng (chemoautotrophy), hoá dị dưỡng (chemoheterotrophy).tự dưỡng chất sinh trưởng (auxoautotroph), dị dưỡng chất sinh trưởng (auxoheterotroph)...

6)- Là sinh vật xuất hiện đầu tiên trên trái đất :

Trái đất hình thành cách đây 4,6 tỷ năm nhưng cho đến nay mới chỉ tìm thấy dấu vết của sự sống từ cách đây 3,5 tỷ năm. Đó là các vi sinh vật hoá thạch còn để lại vết tích trong các tầng đá cổ. Vi sinh vật hoá thạch cỗưa nhất đã được phát hiện là nhữngdạng rất giống với Vi khuẩn lam ngày nay. Chúng được J.William Schopf tìm thấy tại các tầng đá cổ ở miền Tây Australia. Chúng có dạng đa bào đơn giản, nối thành sợi dài đến vài chục mm với đường kính khoảng 1-2 mm và có thành tế bào khá dày. Trước đó các nhà khoa học cũng đã tìm thấy vết tích của chi Gloeodiniopsis có niên đại cách đây 1,5 tỷ năm và vết tích của chi Palaeolyngbya có niên đại cách đây 950 triệu năm.

Vết tích vi khuẩn lam cách đây 3,5 tỷ năm Vết tích Gloeodiniopsis cách đây 1,5 tỷ năm Vết tích Palaeolyngbya cách đây 950 triệu năm

Bài 3 Cấu trúc tế bào vi khuẩn

1. Thành tế bào :

Thành tế bào (cell wall) giúp duy trì hình thấi của tế bào, hỗ trợ sự chuyển động của tiên mao (flagellum) , giúp tế bào đề kháng với áp suất thẩm thấu, hỗ trợ quá trình phân cắt tế bào , cản trở sự xâm nhập của một số chất có phân tử lớn, liên quan đến tính kháng nguyên , tính gây bệnh, tính mẫn cảm với Thực khuẩn thể (bacteriophage).

Năm 1884 H.Christian Gram đã nghĩ ra phương pháp nhuộm phân biệt để phân chia vi khuẩn thành 2 nhóm khác nhau : vi khuẩn Gram dương (G+) và vi khuẩn Gram âm (G-). Phương pháp nhuộm Gram về sau được sử dụng rộng rãi khi định loại vi sinh vật. Thành phần hoá học của 2 nhóm này khác nhau chủ yếu như sau :

Gram dương Gram âm

Thành phần Tỷ lệ % đối với khối lượng khô của thành tế bào

Peptidoglycan 30-95 5-20

Acid teicoic (Teichoic acid) Cao 0

Lipid Hầu như không có 20

Protein Không có hoặc có ít Cao

Peptidoglycan là loại polyme xốp, khá bền vững, cấu tạo bởi 3 thành phần:

-N-Acetylglucosamin ( N-Acetylglucosamine, NAG)

-Acid N-Acetylmuramic (N-Acetylmuramic acid, NAM)

-Tetrapeptid chứa cả D- và L- acid amin

2- Màng sinh chất:

Màng sinh chất hay Màng tế bào chất (Cytoplasmic membrane, CM) ở vi khuẩn cũng tương tự như ở các sinh vật khác. Chúng cấu tạo bởi 2 lớp phospholipid (PL), chiếm 30-40% khối lượng của màng, và các protein (nằm trong, ngoài hay xen giữa màng), chiếm 60-70% khối lượng của màng. Đầu phosphat của PL tích điện, phân cực, ưa nước ; đuôi hydrocarbon không tích điện, không phân cực, kỵ nước.

CM có các chức năng chủ yếu sau đây:

- Khống chế sự qua lại của các chất dinh dưỡng, các sản phẩm trao đổi chất

- Duy trì áp suất thẩm thấu bình thường trong tế bào.

- Là nơi sinh tổng hợp các thành phần của thành tế bào và các polyme của bao nhày (capsule).

- Là nơi tiến hành quá trình phosphoryl oxy hoá và quá trình phosphoryl quang hợp (ở vi khuẩn quang tự dưỡng)

- Là nơi tổng hợp nhiều enzym, các protein của chuỗi hô hấp.

- Cung cấp năng lượng cho sự hoạt động của tiên mao

2. Tế bào chất :

Tế bào chất (TBC-Cytoplasm) là phần vật chất dạng keo nằm bên trong màng sinh chất, chứa tới 80% là nước. Trong tế bào chất có protein, acid nucleic, hydrat carbon, lipid, các ion vô cơ và nhiều nhiều chất khác có khối lượng phân tử thấp. Bào quan đáng lưu ý trong TBC là ribosom (ribosome). Ribosom nằm tự do trong tế bào chất và chiếm tới 70% trọng lượng khô của TBC. Ribosom gồm 2 tiểu phần (50S và 30S), hai tiểu phần này kết hợp với nhau tạo thành ribosom 70S. S là đơn vị Svedberg- đại lượng đo tốc độ lắng khi ly tâm cao tốc. Cấu trúc của ribosom vi khuẩn so với ribosom 80S ở các sinh vật nhân thật (nấm, thực vật, động vật) được trình bày trong bảng sau đây (Giáo viên giảng để sinh viên chú thích vào hình bằng tiếng Việt)

Ribosom ở vi khuẩn

Trong tế bào chất của vi khuẩn còn có thể gặp các chất dự trữ như các hạt glycogen, hạt PHB (Poly-ß-hydroxybutyrat), Cyanophycin, Phycocyanin, các hạt dị nhiễm sắc (metachromatic body), các giọt lưu huỳnh...

Ở loài vi khuẩn diệt côn trùng Bacillus thuringiensis và Bacillus sphaericus còn gặp tinh thể độc (parasoral body) hình quả trám, có bản chất protein và chứa những độc tố có thể giết hại trên 100 loài sâu hại (tinh thể độc chỉ giải phóng độc tố trong môi trường kiềm do đó các vi khuẩn này hoàn toàn vô hại với người, gia súc, gia cầm, thuỷ hải sản- có hại đối với tằm). Bacillus sphaericus có thể diệt cung quăng của các loài muỗi.

3. Thể nhân:

Thể nhân ( Nuclear body) ở vi khuẩn là dạng nhân nguyên thuỷ, chưa có màng nhân nên không có hình dạng cố định, và vì vậy còn được gọi là vùng nhân. Khi nhuộm màu tế bào bằng thuốc nhuộm Feulgen có thể thấy thể nhân hiện màu tím. Đó là 1 nhiễm sắc thể (NST, chromosome) duy nhất dạng vòng chứa 1 sợi ADN xoắn kép (ở Xạ khuẩn Streptomyces có thể gặp nhiễm sắc thể dạng thẳng). NST ở vi khuẩn Escherichia coli dài tới 1mm (!), có khối lượng phân tử là 3.109, chứa 4,6.106 cặp base nitơ. Thể nhân là bộ phận chứa đựng thông tin di truyền của vi khuẩn.

*

Ngoài NST, trong tế bào nhiều vi khuẩn còn gặp những ADN ngoài NST. Đó là những ADN xoắn kép có dạng vòng khép kín, có khả năng sao chép độc lập, chúng có tên là Plasmid.

4. Bao nhầy:

Bao nhầy hay Giáp mạc (Capsule) gặp ở một số loài vi khuẩn với các mức độ khác nhau:

-Bao nhầy mỏng ( Vi giáp mạc, Microcapssule)

-Bao nhầy (Giáp mạc, Capsule)

-Khối nhầy ( Zooglea)

Muốn quan sát bao nhầy thường lên tiêu bản với mực tàu, bao nhày có màu trắng hiện lên trên nền tối.

Thành phần chủ yếu của bao nhầy là polysaccarid, ngoài ra cũng có polypeptid và protein. Trong thành phần polysaccarid ngoài glucose còn có glucozamin, ramnose, acid 2-keto-3-deoxygalacturonic, acid uronic, acid pyruvic, acid axetic...

Ý nghĩa sinh học của bao nhầy là:

-Bảo vệ vi khuẩn trong điều kiện khô hạn, bảo vệ vi khuẩn tránh bị thực bào (trường hợp Phế cầu khuẩn-Diplococcus pneumoniae)

-Cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn khi thiếu thức ăn

-Là nơi tích luỹ một số sản phẩm trao đổi chất (dextran, xantan...)

-Giúp vi khuẩn bám vào giá thể ( trường hợp các vi khuẩn gây sâu răng như Streptococcus salivarrius, Streptococcus mutans...)

Vi khuẩn Leuconostoc mesenteroides có bao nhầy dày chứa hợp chất polyme là Dextran có tác dụng thay huyết tương khi cấp cứu mà thiếu huyết tương. Sản phẩm này rất quan trọng khi có chiến tranh. Vi khuẩn này thường gặp ở các nhà máy đường và gây tổn thất đường trong các bể chứa nước ép mía. Nhờ enzym dextransuccrase mà đường saccarose bị chuyển thành dextran và fructose.

Một số bao nhầy của vi khuẩn còn được dùng để sản xuất Xantan (Xanthane) dùng làm chất phụ gia trong công nghiệp dầu mỏ.

5. Tiên mao và khuẩn mao :

Tiên mao (Lông roi, flagella) không phải có mặt ở mọi vi khuẩn, chúng quyết định khả năng và phương thức di động của vi khuẩn. Tiên mao là những sợi lông dài, dưới kính hiển vi quang học chỉ có thể thấy rõ khi nhuộm theo phương pháp riêng. Dưới kính hiển vi điện tử có thể thấy rất rõ cấu trúc của từng sợi tiên mao. Để xác định xem vi khuẩn có tiên mao hay không còn có cách thử gián tiếp nhằm biết khả năng di động của chúng. Cấy bằng que cấy nhọn đầu vào môi trường thạch đứng chứa 0.4% thạch (agar-agar), còn gọi là môi trường thạch mềm. Nếu thấy vết cấy lan nhanh ra xung quanh thì chứng tỏ là vi khuẩn có tiên mao, có khả năng di động.

Tiên mao có thể gốc (basal body), gồm 1 trụ nhỏ được gắn với 4 đĩa tròn (vi khuẩn G - ) có dạng vòng nhẫn (ring), ký hiệu là các vòng L,P,S và M. Vòng L nằm ngoài cùng, tương ứng với lớp liposaccarid của màng ngoài ; vòng P tương ứng với lớp peptidoglycan, vòng S tương ứng với lớp không gian chu chất ; vòng M nằm ở trong cùng. Vi khuẩn G+ chỉ có 2 vòng : 1 vòng nằm ngoài tương ứng với thành tế bào và 1 vòng trong tương ứng với màng sinh chất. Xuyên giữa các vòng là 1 trụ nhỏ (rod) có đường kính 7nm. Bao bọc tiên mao ở phần phía ngoài là một bao ngắn có hình móc (hook). Sợi tiên mao (filament) dài khoảng 10-20m và có đường kính khoảng 13-20nm. Đường kính của bao hình móc là 17nm. Khoảng cách giữa vòng S và vòng M là 3mm, giữa vòng P và vòng L là 9nm, giữa vòng P và vòng S là 12nm. Đường kính của các vòng là 22nm, đường kính các lỗ ở các vòng là 10nm. Khoảng cách từ mặt ngoài của vòng L đến mặt trong của vòng M là 27nm. Sợi tiên mao cấu tạo bởi loại protein có tên là flagellin, có trọng lượng phân tử là 30 000-60 000. Một số vi khuẩn có bao lông (sheath) bao bọc suốt chiều dài sợi, như ở trường hợp chi Bdellovibrio hay vi khuẩn tả Vibrio cholera.

Tiên mao ở VK Gram dương Tiên mao ở VK Gram âm

Tiên mao ở vi khuẩn G +

Các tiểu phần (subunit) của flagellin được tổng hợp từ các hạt ribosom nằm gần màng sinh chấy tổng hợp nên và đi qua lõi mà tạo dần thành sợi tiên mao

Tiên mao của vi khuẩn có các loại khác nhau tuỳ từng loài :

-Không có tiên mao (vô mao, atrichia)

-Có 1 tiên mao mọc ở cực ( đơn mao, monotricha)

-Có 1 chùm tiên mao mọc ở cực ( chùm mao, lophotricha)

-Có 2 chùm tiên mao mọc ở 2 cực ( song chùm mao, amphitricha)

-Có nhiều tiên mao mọc khắp quanh tế bào (chu mao, peritricha)

Có loại tiên mao mọc ở giữa tế bào như trường hợp vi khuẩn Selenomonas ruminantium.

Các loại tiên mao ở vi khuẩn

Kiểu sắp xếp tiên mao liên quan đến hình thức di động của vi khuẩn. Tiên mao mọc ở cực giúp vi khuẩn di động theo kiẻu tiến- lùi. Chúng đảo ngược hướng bằng cách đảo ngược hướng quay của tiên mao. Vi khuẩn chu mao di động theo hướng nào thì các tiên mao chuyển động theo hướng ngược lại. Khi tiên mao không tụ lại về một hướng thì vi khuẩn chuyển động theo kiểu nhào lộn. Tốc độ di chuyển của vi khuẩn có tiên mao thường vào khoảng 20-80µm/giây, nghĩa là trong 1 giây chuyển động được một khoảng cách lớn hơn gấp 20-80 lần so với chiều dài của cơ thể chúng.

Các chi vi khuẩn thường có tiên mao là Vibrio, Spirillum, Pseudomonas, Escherichia, Shigella, Salmonella, Proteus... Ở các chi Clostridium, Bacterium,Bacillus, ...có loài có tiên mao có loài không. Ở cầu khuẩn chỉ có 1 chi (Planococcus) là có tiên mao

Xoắn thể có một dạng tiên mao đặc biệt gọi là tiên mao chu chất (periplasmic flagella), hay còn gọi là sợi trục ( axial fibrils), xuất phát từ cực tế bào và quấn quang cơ thể. Chúng giúp xoắn thể chuyển động được nhờ sự uốn vặn tế bào theo kiểu vặn nút chai.

Xoắn thể (Spirochete) quan sát dưới kính hiển vi nền đen.

Cơ chế chuyển động uốn vặn tế bào ở Xoắn thể ( OS, AF, PC- xem chú thích ở hình trên).

6. Khuẩn mao và Khuẩn mao giới: (lông nhung)

Khuẩn mao (hay Tiêm mao, Nhung mao , Fimbriae) là những sợi lông rất mảnh, rất ngắn mọc quanh bề mặt tế bào nhiều vi khuẩn Gram âm. Chúng có đường kính khoảng 7-9nm, rỗng ruột (đường kính trong là 2-2,5nm), số lượng khoảng 250-300 sợi/ vi khuẩn. Kết cấu của khuẩn mao giản đơn hơn nhiều so với tiên mao. Chúng có tác dụng giúp vi khuẩn bám vào giá thể ( nhiều vi khuẩn gây bệnh dùng khuẩn mao để bám chặt vào màng nhầy của đường hô hấp, đường tiêu hoá, đường tiết niệu của người và động vật).

Có một loại khuẩn mao đặt biệt gọi là Khuẩn mao giới (Sex pili, Sex pilus-số nhiều) có thể gặp ở một số vi khuẩn với số lượng chỉ có 1-10/ vi khuẩn. Nó có cấu tạo giống khuẩn mao , đường kính khoảng 9-10nm nhưng có thể rất dài. Chúng có thể nối liền giữa hai vi khuẩn và làm cầu nối để chuyển vật chất di truyền (ADN) từ thể cho (donor) sang thể nhận (recipient). Quá trình này được gọi là quá trình giao phối (mating) hay tiếp hợp (conjugation). Một số thực khuẩn thể (bacteriophage) bám vào các thụ thể (receptors) ở khuẩn mao giới và bắt đầu chu trình phát triển của chúng.

Bài 5 Cổ khuẩn(Archaea)

Phân loại cổ khuẩn

Mở đầu

Những vi sinh vật có khả năng sinh methane (mêtan), mẫn cảm với oxygen và có cấu trúc màng tế bào đặc biệt đã được biết đến từ lâu nhưng mãi đến cuối những năm 1970 chúng mới được nhìn nhận như đại diện của một dạng sống thứ ba trên trái đất bên cạnh vi khuẩn và sinh vật nhân thật, đó là cổ khuẩn. Carl R. Woese và cộng sự (1977) sau khi xem xét trình tự 16S rARN nhận thấy rằng các sinh vật nhân nguyên thuỷ (Prokaryote) cần được chia thành hai nhóm khác biệt nhau hoàn toàn là Vi khuẩn (Eubacteria hay Bacteria) và Cổ khuẩn (Archaeabacteria hay Archaea), và cùng với các Sinh vật nhân thật (Eukarya) làm thành ba lĩnh giới (Domains) ở sinh vật (Hình 1). Các nghiên cứu sâu hơn về phả hệ và đặc điểm sinh lý sinh hoá cho thấy rằng cổ khuẩn được tách ra từ rất sớm trong quá trình tiến hoá, chúng không gần vi khuẩn nhiều hơn so với sinh vật nhân thật, do vậy tên gọi Archaea được đề xuất thay cho Archaeabacteria. Hiện nay cả hai tên gọi Archaea và Archaeabacteria đều được sử dụng trong các tài liệu vi sinh vật, tuy nhiên thuật ngữ Archaea chính xác hơn vì rõ ràng cổ khuẩn không phải vi khuẩn mà là một nhóm vi sinh vật riêng biệt.

Hình 1. Ba lĩnh giới của sinh vật: Vi khuẩn (Bacteria), Cổ khuẩn (Archaea) và Sinh vật nhân thật (Eukarya).

Cổ khuẩn là một nhóm vi sinh vật đặc biệt

Cổ khuẩn (Archaea) bắt nguồn từ tiếng La tinh Archaios có nghĩa là cổ, là một nhóm vi sinh vật có nhiều đặc điểm rất khác biệt (Bảng 1).

Bảng 1. Những đặc điểm khác biệt của cổ khuẩn so với vi khuẩn và sinh vật nhân thật

Đặc điểm Vi khuẩn (Bacteria) Cổ khuẩn(Archaea) Sinh vật nhân thật (Eukarya)

Thành tế bào Peptidoglycan Pseudo-peptidoglycan, protein, polysaccharid, glycoprotein cellulose, carbonat, silicat, chitin...

Màng tế bào Este-lipid Ete-lipid Este-lipid

ARN polymeraza (trên khuôn ADN) Chỉ có một loại

4 đơn vị 2' Có nhiều loại

7  12 đơn vị Có ba loại

7  12 đơn vị

Ribosom 70 S 70 S 80 S

Phản ứng của ribosom với độc tố bạch hầu Đề kháng Mẫn cảm Mẫn cảm

Cũng như tế bào vi khuẩn, tế bào cổ khuẩn (ngoại trừ chi Thermoplasma) có thành tế bào bên ngoài giữ chức năng bảo vệ. Tuy nhiên, không như ở vi khuẩn, thành tế bào của cổ khuẩn không chứa peptidoglycan và vì thế không bị phá huỷ dưới tác dụng của lysozym. Cổ khuẩn có rất nhiều dạng cấu trúc thành tế bào khác nhau. Một số cổ khuẩn (như các loài sinh methane) có thành tế bào cấu tạo bởi một loại polysaccharid rất giống với peptidoglycan được gọi là pseudo-peptidoglycan (pseudomurein). Chuỗi pseudo-peptidoglycan gồm các đơn nguyên N-acetyl-glucosamin và N-acetyl-alosamin-uronic acid (thay cho N-acetyl-muramic acid trong peptidoglycan). Ngoài ra, ở đây cầu nối glycosid 13 thay thế cho cầu nối glycosid 14 ở peptidoglycan. Một số cổ khuẩn khác lại hoàn toàn không có cả peptidoglycan và pseudo-peptidoglycan trong thành tế bào mà thay vào đó là hỗn hợp gồm polysaccharid, glycoprotein hoặc protein. Ví dụ như các loài Methanosarcina (cổ khuẩn sinh methane) có thành tế bào là một lớp polysaccharid dày cấu tạo từ glucoza, glucuronic acid, galactosamin và acetat. Các loài cổ khuẩn ưa mặn cực đoan (extreme halophiles) như là Halococcus có thành tế bào tương tự như Methanosarcina nhưng chứa nhiều hợp chất có nhóm sulfat giống như chondroitin sulfat ở tổ chức liên kết của động vật. Dạng cấu trúc thành tế bào phổ biến nhất ở cổ khuẩn là lớp paracrystallin bề mặt (S-layer) gồm protein hay glycoprotein. Cấu trúc này được tìm thấy ở các đại diện thuộc tất cả các nhóm cổ khuẩn, từ ưa mặn cực đoan (extremely halophilic), ưa nhiệt cực đoan (extremely thermophilic) và cả các loài sinh methane. Đặc biệt các chi Methanospirillum và Methanothrix (cổ khuẩn sinh methane) có cấu trúc thành tế bào vô cùng phức tạp. Các loài thuộc hai chi này mọc thành chuỗi dài gồm nhiều tế bào, ở giữa mỗi cặp tế bào có một lớp đệm dày và toàn bộ cấu trúc chuỗi đó lại được bọc kín trong một lớp paracrystallin bề mặt.

Thành phần và cấu trúc lipid của màng tế bào là một trong những đặc điểm nổi bật phân biệt cổ khuẩn và hai nhóm còn lại. Trong khi ở vi khuẩn và sinh vật nhân thật cầu nối acid béoglycerol trong lipid màng tế bào là liên kết este (ester) thì ở cổ khuẩn lại là liên kết ete (ether) (Hình 2). Acid béo trong este-lipid thường là các phân tử ngắn, mạch thẳng. Trái lại, acid béo trong ete-lipid là các phân tử mạch dài, phân nhánh, thuộc cả hai dạng phytanyl (C20cacbuahydro tổng hợp từ isopren) và biphytanyl (C40). Do chỉ có ở cổ khuẩn và không bị biến đổi dưới nhiệt độ cao nên isopren-lipid được lấy làm chất chỉ thị của cổ khuẩn hoá thạch.

Enzyme polymeraza thực hiện quá trình sao mã trên khuôn ADN (DNA-dependent RNA polymerase) ở ba lĩnh giới sinh vật cũng có nhiều điểm khác nhau. Vi khuẩn chỉ có một loại ARN-polymeraza có cấu trúc không gian đơn giản, gồm bốn chuỗi polypeptid 2, 1, 1' và một nhân tố  không cố định. Cổ khuẩn có nhiều loại ARN-polymeraza, cấu trúc mỗi loại lại phức tạp hơn nhiều so với ARN-polymeraza vi khuẩn. ARN-polymeraza của cổ khuẩn sinh methane và các loài ưa mặn (halophilic) gồm tám chuỗi polypeptid (5 chuỗi dài và 3 chuỗi ngắn). ARN-polymeraza ở cổ khuẩn ưa nhiệt cao (hyper-thermophilic) lại phức tạp hơn, gồm ít nhất 10 chuỗi peptid. Polymeraza thực hiện quá trình tổng hợp ARN thông tin (mARN) ở sinh vật nhân thật gồm 10-12 chuỗi polypeptid có kích thước tương tự như ở ARN-polymeraza của cổ khuẩn ưa nhiệt cao. Ngoài ra, sinh vật nhân thật còn có hai loại ARN-polymeraza khác nữa đặc hiệu cho quá trình tổng hợp ARN của ribosom (rARN) và ARN vận chuyển (tARN). Như vậy chất kháng sinh rifampicin có tác dụng ức chế đơn vị  của polymeraza chỉ có hiệu quả đối với vi khuẩn vì cổ khuẩn và sinh vật nhân thật không có loại polymeraza này.

Với những điểm khác biệt trong trình tự 16S rARN cũng như cấu trúc ARN-polymeraza, hiển nhiên bộ máy sinh tổng hợp protein của ba lĩnh giới sinh vật cũng sẽ không đồng nhất. Tuy có kích thước của ribosom giống với vi khuẩn (70S) nhưng cổ khuẩn lại có nhiều bước trong quá trình sinh tổng hợp protein rất giống với sinh vật nhân thật (80S ribosom). Nhiều chất kháng sinh ức chế quá trình sinh tổng hợp protein ở vi khuẩn lại không có hiệu lực đối với cổ khuẩn và sinh vật nhân thật (Bảng 2). Ngoài ra, tương tự như ở sinh vật nhân thật, nhân tố kéo dài EF-2 trong ribosom ở cổ khuẩn có phản ứng với độc tố bạch hầu, một loại độc tố vô hại đối với vi khuẩn. Tuy nhiên nhân tố EF-2 ở cổ khuẩn mang tính đặc hiệu cao, nhân tố này hoàn toàn không hoạt động trong môi trường ribosom của vi khuẩn hoặc sinh vật nhân thật. Các thí nghiệm lai ribosom in vitro cho thấy ribosom ghép giữa đơn vị lớn (50S) của cổ khuẩn và đơn vị nhỏ (40S) của sinh vật nhân thật vẫn thức hiện chức năng giải mã một cách bình thường, trong khi đó việc ghép tương tự giữa vi khuẩn và sinh vật nhân thật lại hoàn toàn không tương thích. Như vậy cấu trúc bộ máy sinh tổng hợp protein của cổ khuẩn có nhiều điểm tương đồng với sinh vật nhân thật hơn là với vi khuẩn.

Giống như vi khuẩn, cổ khuẩn có một nhiễm sắc thể dạng vòng, tuy nhiên genom của cổ khuẩn thường nhỏ hơn nhiều so với genom của vi khuẩn. Chẳng hạn ADN của Escherichia coli là 2,5 x 109 Da, trong khi đó ADN của Thermoplasma acidophilum là 0,8 x 109 Da, hay của Methanobacterium là 1,1 x 109 Da. Ngoài ra thành phần GC (mol%) của ADN ở cổ khuẩn dao động trong phạm vi rất lớn, từ 21 đến 68 %, chứng tỏ tính đa dạng của cổ khuẩn. So sánh trình tự đầy đủ của genom ở cổ khuẩn Methanococcus jannaschi với genom của vi khuẩn và sinh vật nhân thật cho thấy 56% trong 1738 gen không tương đồng.

Bảng 2. Tính mẫn cảm của đại diện ba lĩnh giới sinh vật đối với các chất ức chế quá trình sinh tổng hợp protein

Chất kháng sinh Tác dụng ức chế Cổ khuẩn Vi khuẩn Sinh vật nhân thật

Methano-bacterium Sulfo-lobus Escheri-chia coli Saccharomyces cerevisae

Cycloheximid Ức chế bước khởi đầu    +

Virginiamycin, pulvomycin Ức chế bước kéo dài +  + 

Neomycin, puromycin Dừng tổng hợp sớm + + + +

Rifamycin Ức chế enzyme ARN polymeraza   + 

Erythromycin, streptomycin, chloramfenicol Tăng tần số mắc lỗi và một số hiệu ứng khác   + 

Các hình thức dinh dưỡng ở cổ khuẩn

Cổ khuẩn có nhiều hình thức dinh dưỡng: hoá dưỡng hữu cơ (chemoorganotrophy), hoá dưỡng vô cơ (chemolithotrophy), tự dưỡng (autotrophy), hay quang hợp (phototrophy). Hoá dưỡng hữu cơ là hình thức dinh dưỡng của nhiều loài cổ khuẩn, tuy nhiên các chu trình phân giải chất hữu cơ thường có một số điểm khác biệt so với vi khuẩn. Cổ khuẩn ưa mặn (halophiles) và ưa nhiệt cực đoan (extreme thermophiles) phân giải glucoza theo một dạng cải biên của con đường Entner-Doudoroff (E-D). Nhiều loài cổ khuẩn lại có khả năng sản sinh ra glucoza từ các chất ban đầu không phải là hydratcarbo (gluconeogenesis) thông qua các bước đảo ngược của quá trình glycolysis (con đường Embden-Meyerhof). Oxygen hoá acetat thành CO2 được thực hiện qua chu trình TCA (đôi khi với một số thay đổi trong các bước phản ứng), hoặc qua con đường acetyl-CoA (Ljungdahl-Wood). Các thành phần của chuỗi vận chuyển điện tử như ở vi khuẩn đều được tìm thấy ở cổ khuẩn, trong đó cytochroma, b và c có ở các loài ưa mặn cực đại, cytochroma có ở một số loài ưa nhiệt cao. Mô phỏng dựa trên chuỗi chuyển điện tử ở phần lớn cổ khuẩn cho thấy chúng thu nạp điện tử từ chất cho vào chuỗi ở nấc thang NADH, oxygen hoá chất nhận điện tử cuối cùng là O2, S0 hay một số chất khác, đồng thời tạo ra lực đẩy proton (proton motiv force) để tổng hợp ATP nhờ bộ máy ATPaza khư trú trong màng tế bào. Hoá dưỡng vô cơ khá phổ biến ở cổ khuẩn, trong đó hydro thường được sử dụng làm chất cho điện tử.

Tự dưỡng đặc biệt phổ biến ở cổ khuẩn và diễn ra dưới nhiều hình thức khác nhau. Ở cổ khuẩn sinh methane và cổ khuẩn hoá dưỡng vô cơ ưa nhiệt cao CO2 được chuyển hoá thành các hợp chất hữu cơ qua con đường acetyl-CoA, trong đó một số loài có cải biên ở các bước phản ứng khác nhau. Một số loài cổ khuẩn khác (như Thermoproteus) cố định CO2 theo chu trình citric acid đảo ngược, tương tự như ở vi khuẩn lam lưu huỳnh. Mặc dù các loài cổ khuẩn ưa nhiệt cực đoan đều thực hiện hình thức dinh dưỡng hữu cơ nhưng nhiều loài vẫn có khả năng cố định CO2 và thực hiện quá trình này theo chu trình Calvin, tương tự như ở vi khuẩn và sinh vật nhân thật.

Khả năng quang hợp có ở một số loài cổ khuẩn ưa mặn cực đoan, tuy nhiên khác với vi khuẩn, quá trình này được thực hiện hoàn toàn không có sự tham gia của chlorophill hay bacteriochlorophill mà nhờ một loại protein ở màng tế bào là bacteriorhodopsin kết gắn với phân tử tương tự như carotenoid có khả năng hấp phụ ánh sáng, xúc tác cho quá trình chuyển proton qua màng nguyên sinh chất và sử dụng để tổng hợp ATP. Tuy nhiên, bằng hình thức quang hợp này cổ khuẩn ưa mặn cực đoan chỉ có thể sinh trưởng với tốc độ thấp trong điều kiện kỵ khí, khi môi trường thiếu chất dinh dưỡng hữu cơ.

Môi trường sống của cổ khuẩn và giả thuyết về hình thành sự sống trên trái đất

Cổ khuẩn được biết đến như những vi sinh vật thích nghi với các môi trường có điều kiện cực đoan (extreme) như nhiệt độ cao (thermophilic), nơi lạnh giá (psychrophilic), nồng độ muối cao (halophilic) hay độ acid cao (acidophilic) v.v. Đó cũng là một lý do giải thích tại sao cổ khuẩn lại khó được phân lập và nuôi cấy trong điều kiện phòng thí nghiệm. Trong giới sinh vật, cổ khuẩn có các đại diện cư trú ở các điều kiện nhiệt độ cao hơn cả (Bảng 3, Hình 3), nhiều loài có thể sống ở nhiệt độ trên 100 C dưới áp suất cao như ở các miệng núi lửa dưới đáy đại dương. Cơ chế thích nghi của tế bào vi sinh vật với nhiệt độ cao như vậy còn đang được nghiên cứu. Ở cổ khuẩn, một số phương thức thích nghi với nhiệt độ cao được biết đến như tác dụng của enzyme gyraza trong việc bảo vệ cấu trúc xoắn của ADN dưới tác động của nhiệt, hay ete-lipid, nhất là C40-lipid trong màng tế bào của cổ khuẩn, giúp làm tăng đô bền vững của màng. Tuy nhiên cổ khuẩn không chỉ sống ở các môi trường cực đoan. Ngoài đại dương cổ khuẩn tồn tại với một số lượng lớn. Trên đất liền các loài cổ khuẩn sinh methane ưa ấm có mặt ở nhiều môi trường khác nhau, như các bể lên men chất thải hữu cơ, các chân ruộng lúa ngập nước, đường tiêu hoá của động vật v.v.

Bảng 3. Nhiệt độ phát triển cao nhất của các đại diện sinh vật trên trái đất

Cá 38 C

Côn trùng 50

Động vật đơn bào 50

Tảo 56

Nấm 60

Vi khuẩn thường 90

Cổ khuẩn 113

Khả năng thích nghi đối với các điều kiện sống cực đoan của cổ khuẩn là cơ sở để giả thuyết rằng chúng là những sinh vật sống đầu tiên xuất hiện trên trái đất. Trái đất của chúng ta trong thời kỳ đầu có nhiệt độ rất cao, khoảng 100 C trở lên, chứa nhiều ammon và khí methane trong khí quyển, do vậy những dạng sống đầu tiên phải là các sinh vật yếm khí và ưa nhiệt cao (hyper-thermophiles). Với các đặc điểm sinh lý như tính ưa nhiệt, sống kỵ khí, sử dụng các chất hữu cơ và vô cơ là nguồn năng lượng, các loài cổ khuẩn ưa nhiệt cao có lẽ phù hợp với dạng sống nguyên thuỷ mô phỏng theo điều kiện của trái đất trong thời kỳ đầu. Trong thực tế, chất chỉ thị mạch isoprene-lipid thành phần màng tế bào của cổ khuẩn được tìm thấy trong các lớp trầm tích có tuổi là 3,8 tỷ năm. Các nghiên cứu dựa trên trình tự 16S rARN cho thấy cổ khuẩn, đặc biệt là nhóm cổ khuẩn ưa nhiệt cao, tiến hoá chậm hơn đáng kể so với vi khuẩn và sinh vật nhân thật. Tuy nhiên tốc độ tiến hoá chậm của cổ khuẩn so với hai lĩnh giới còn lại có thể do môi trường sống khắc nghiệt của chúng tạo ra. Cho đến nay câu hỏi về nguồn gốc sự sống và vai trò của cổ khuẩn trong đó vẫn còn đang tiếp tục được tranh luận.

Bài 7 Virus

1. Vài nét lịch sử nghiên cứu của virus học

Ngay từ năm 1883 nhà khoa học người Đức Adolf Mayer khi nghiên cứu bệnh khảm cây thuốc lá đã nhận thấy bệnh này có thể lây nếu phun dịch ép lá cây bị bệnh sang cây lành, tuy nhiên ông không phát hiện được tác nhân gây bệnh.

Năm 1884 Charles Chamberland đã sáng chế ra màng lọc bằng sứ để tách các vi khuẩn nhỏ nhất và

vào năm 1892 nhà thực vật học người Nga Dimitri Ivanovski đã dùng màng lọc này để nghiên cứu bệnh khảm thuốc lá. Ông nhận thấy dịch ép lá cây bị bệnh đã cho qua màng lọc vẫn có khả năng nhiễm bệnh cho cây lành và cho rằng tác nhân gây bệnh có lẽ là vi khuẩn có kích thước nhỏ bé đến mức có thể đi qua màng lọc, hoặc có thể là độc tố do vi khuẩn tiết ra. Giả thuyết về độc tố qua màng lọc đã bị bác bỏ

vào năm 1898 khi nhà khoa học người Hà Lan Martinus Beijerinck chứng minh được rằng tác nhân lây nhiễm là chất độc sống (Contagium vivum fluidum) và có thể nhân lên được. Ông tiến hành phun dịch ép lá cây bệnh cho qua lọc rồi phun lên cây và khi cây bị bệnh lại lấy dịch ép cho qua lọc để phun vào các cây khác. Qua nhiều lần phun đều gây được bệnh cho cây. Điều đó chứng tỏ tác nhân gây bệnh phải nhân lên được vì nếu là độc tố thì năng lực gây bệnh sẽ phải dần mất đi.

Năm 1901 Walter Reed và cộng sự ở Cuba đã phát hiện tác nhân gây bệnh sốt vàng, cũng qua lọc. Tiếp sau đó các nhà khoa học khác phát hiện ra tác nhân gây bệnh dại và đậu mùa. Tác nhân gây bênh đậu mùa có kích thước lớn, không dễ qua màng lọc, do đó các tác nhân gây bệnh chỉ đơn giản gọi là virus.

Năm 1915 nhà vi khuẩn học người Anh Frederick Twort và năm 1917 nhà khoa học người Pháp Felix d'Hérelle đã phát hiện ra virus của vi khuẩn và đặt tên là Bacteriophage gọi tắt là phage.

Năm 1935 nhà khoa học người Mỹ Wendell Stanley đã kết tinh được các hạt virus gây bệnh đốm thuốc lá (TMV). Rồi sau đó TMV và nhiều loại virus khác đều có thể quan sát được dưới kính hiển vi điện tử.

Như vậy nhờ có kỹ thuật màng lọc đã đem lại khái niệm ban đầu về virus và sau đó nhờ có kính hiển vi điện tử đã có thể quan sát được hình dạng của virus, tìm hiểu được bản chất và chức năng của chúng.

Ngày nay virus được coi là thực thể chưa có cấu tạo tế bào, có kích thước siêu nhỏ và có cấu tạo rất đơn giản, chỉ gồm một loại acid nucleic, được bao bởi vỏ protein. Muốn nhân lên virus phải nhờ bộ máy tổng hợp của tế bào, vì thế chúng là ký sinh nội bào bắt buộc.

Virus có khả năng gây bệnh ở mọi cơ thể sống từ vi khuẩn đến con người, là thủ phạm gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi, gây thất bát mùa màng và cản trở đối với ngành công nghiệp vi sinh vật.

Từ những thập kỷ cuối của thế kỷ XX trở lại đây ngày càng xuất hiện các dạng virus mới lạ ở người, động vật mà trước đó y học chưa hề biết tới, đe doạ mạng sống của con người. Sau HIV, SARS, Ebola, cúm A H5N1 sẽ còn bao nhiêu loại nữa sẽ xuất hiện để gây tai hoạ cho con người.

Mặt khác, do có cấu tạo đơn giản và có genom nhiều kiểu với cơ chế sao chép khác hẳn ở các cơ thể khác nên virus được chọn là mô hình lý tưởng để nghiên cứu nhiều cơ chế sinh học ở mức phân tử dẫn đến cuộc cách mạng sinh học cận đại: Sinh học phân tử, di truyền học phân tử. Vì những lý do trên việc nghiên cứu virus đã được đẩy mạnh và trở thành một ngành khoa học độc lập rất phát triển.

2. Hình thái và cấu trúc của virus

2.1. Cấu tạo cơ bản:

Tất cả các virus đều có cấu tạo gồm hai thành phần cơ bản: lõi là acid nucleic (tức genom) và vỏ là protein gọi là capsid, bao bọc bên ngoài để bảo vệ acid nucleic. Phức hợp bao gồm acid nucleic và vỏ capsid gọi là nucleocapsid hay xét về thành phần hoá học thì gọi là nucleoprotein. Đối với virus ARN thì còn gọi là ribonucleoprotein

Genom của virus có thể là ADN hoặc ARN, chuỗi đơn hoặc chuỗi kép, trong khi genom của tế bào luôn là ADN chuỗi kép, và trong tế bào luôn chứa hai loại acid nucleic, ADN và ARN.

2.2. Vỏ capsid:

Capsid là vỏ protein được cấu tạo bởi các đơn vị hình thái gọi là capsome. Capsome lại được cấu tạo từ 5 hoặc 6 đơn vị cấu trúc gọi là protome. Protome có thể là monome (chỉ có một phân tử protein) hoặc polyme (có nhiều phân tử protein)

- Pentame (penton) có 5 protome nằm trên các đỉnh của khối đa diện, còn hexame (hexon) tạo thành các cạnh và bề mặt hình tam giác.

- Capsid có khả năng chịu nhiệt, pH và các yếu tố ngoại cảnh nên có chức năng bảo vệ lõi acid nucleic

- Trên mặt capsid chứa các thụ thể đặc hiệu, hay là các gai glicoprotein, giúp cho virus bám vào các thụ thể trên bề mặt tế bào. Đây cũng chính là các kháng nguyên (KN) kích thích cơ thể tạo đáp ứng miễn dịch (ĐƯMD).

- Vỏ capsid có kích thước và cách sắp xếp khác nhau khiến cho virus có hình dạng khác nhau. Có thể chia ra ba loại cấu trúc: đối xứng xoắn, đối xứng hình khối và cấu trúc phức tạp (Hình 1).

2.2.1 Cấu trúc đối xứng xoắn:

Sở dĩ các virus có cấu trúc này là do capsome sắp xếp theo chiều xoắn của acid nucleic. Tuỳ loại mà có chiều dài, đường kính và chu kỳ lặp lại của các nucleocapsid khác nhau. Cấu trúc xoắn thường làm cho virus có dạng hình que hay hình sợi ví dụ virus đốm thuốc lá (MTV), dại (rhabdo), quai bị, sởi (paramyxo), cúm (orthomyxo). ở virus cúm các nucleocapsid được bao bởi vỏ ngoài nên khi quan sát dưới kính hiển virus điện tử thấy chúng có dạng cầu.

2.2.2 Cấu trúc đối xứng dạng khối đa diện 20 mặt

Hình của phòng thí nghiệm Robert M Bock Đại học University of Wisconsin-Madison.

Ở các virus loại này, capsome sắp xếp tạo vỏ capsid hình khối đa diện với 20 mặt tam giác đều, có 30 cạnh và 12 đỉnh. Đỉnh là nơi gặp nhau của 5 cạnh thuộc loại này gồm các virus adeno, reo, herpes và picorna. Gọi là đối xứng vì khi so sánh sự sắp xếp của capsome theo trục. Ví dụ đối xứng bậc 2, bậc 3, bậc 5, vì khi ta xoay với 1 góc 1800 (bậc 2), 1200 (bậc 3) và 720 (bậc 5) thì thấy vẫn như cũ.

Các virus khác nhau có số lượng capsome khác nhau. Virus càng lớn, số lượng capsome càng nhiều. Dựa vào số lượng capsome trên mỗi cạnh có thể tính được tổng số capsome của vỏ capsid theo công thức sau:

N= 10(n-1)2+2

Trong đó N- tổng số capsome của vỏ capsid, n-số capsome trên mỗi cạnh.

2.2.3 Virus có cấu tạo phức tạp

Một số virus có cấu tạo phức tạp, điển hình là phage và virus đậu mùa. Phage có cấu tạo gồm đầu hình khối đa diện, gắn với đuôi có cấu tạo đối xứng xoắn. Phage T chẵn (T2, T4, T6) có đuôi dài trông giống như tinh trùng, còn phage T lẻ (T3,T7) có đuôi ngắn, thậm chí có loại không có đuôi (?6, ?X174).

Virus đậu mùa có kích thước rất lớn, hình viên gạch. ở giữa là lõi lõm hai phía trông như quả tạ. Đối diện với hai mặt lõm là hai cấu trúc dạng thấu kính gọi là thể bên. Bao bọc lõi và hai thể bên là vỏ ngoài.

2.3 Vỏ ngoài:

Một số virus có vỏ ngoài (envelope) bao bọc vỏ capsid. Vỏ ngoài có nguồn gốc từ màng sinh chất của tế bào được virus cuốn theo khi nảy chồi. Vỏ ngoài có cấu tạo gồm 2 lớp lipid và protein.

Lipid gồm phospholipid và glycolipid, hầu hết bắt nguồn từ màng sinh chất (trừ virus pox từ màng Golgi) với chức năng chính là ổn định cấu trúc của virus.

Protein vỏ ngoài thường là glycoprotein cũng có nguồn gốc từ màng sinh chất, tuy nhiên trên mặt vỏ ngoài cũng có các glycoprotein do virus mã hóa được gắn trước vào các vị trí chuyên biệt trên màng sinh chất của tế bào, rồi về sau trở thành cấu trúc bề mặt của virus. Ví dụ các gai gp 120 của HIV hay hemaglutinin của virus cúm, chúng tương tác với receptor của tế bào để mở đầu sự xâm nhập của virus vào tế bào.

Vỏ ngoài cũng có nguồn gốc từ màng nhân do virus lắp ráp và nẩy chồi qua màng nhân (virus herpes)

Dưới tác động của một số yếu tố như dung môi hoà tan lipid, enzym, vỏ ngoài có thể bị biến tính và khi đó virus không còn khả năng gây nhiễm nữa.

2.4 Protein của virus :

2.3.1 Các phương pháp nghiên cứu protein virus

Trước hết cần phải tách chúng khỏi tế bào. Điều này có thể thực hiện được nhờ hàng loạt các bước ly tâm tách, tiếp đó là ly tâm theo gradient nồng độ saccaroza.

Ly tâm gradient nồng độ saccaroza thường cho kết quả thể hiện ở các băng (band) rất rõ nét tại các vị trí đặc thù trên gradient. Các băng này được dùng cho các nghiên cứu tiếp theo. Thông thường để nghiên cứu các virion đánh dấu đồng vị phóng xạ, người ta dùng hàng loạt kỹ thuật như điện di trên gel polyacrylamit, western Blotting (phản ứng với kháng thể).

Vị trí protein của virus trong tế bào có thể xác định được nhờ kỹ thuật nhuộm phân biệt và miễn dịch huỳnh quang, cho kháng thể đơn dòng tương tác với epitop đặc hiệu của protein sau dịch mã thì dùng các chất ức chế proteaza và ức chế quá trình glycosyl hoá.

Việc xác định trình tự gen và việc dự đoán acid amin sẽ giúp hiểu được cấu trúc và chức năng của chúng.

2.4.2 Các loại protein virus

Protein virus được tổng hợp nhờ mARN của virus trên riboxom của tế bào. Tuỳ theo thời điểm tổng hợp mà được chia thành protein sớm và protein muộn. Protein sớm do gen sớm mã hoá, thường là enzym (protein không cấu trúc) còn protein muộn do gen muộn mã hoá, thường là protein cấu trúc tạo, nên vỏ capsid và vỏ ngoài.

Protein không cấu trúc

Protein không cấu trúc có thể được gói vào trong virion, nhưng không phải là thành phần cấu tạo virion. Đây là các enzym tham gia vào quá trình nhân lên của virus, ví dụ enzym phiên mã ngược, proteaza và integraza của virus retro, timidinkinaza và ADN polymeraza của HSV.

Protein không cấu trúc khác chỉ có mặt trong tế bào nhiễm mà không được đưa vào virion, bao gồm các protein tham gia vào quá trình điều hoà sao chép, phiên mã, dịch mã (ví dụ Tat của HIV, Protein màng trong của HSV, helicaza, protein gắn ADN...); protein ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic và protein của tế bào chủ. Ngoài ra thuộc loại này còn có các protein gây ung thư do các oncogen mã hóa; các protein gây chuyển dạng tế bào, như kháng nguyên T lớn của SV-40 hoặc protein EBNA của virus Epstein.Barr. ở một số virus có protein không cấu trúc liên quan đến hoạt tính anti-apoptosis và anti-cytokin...

Hình của phòng thí nghiệm Robert M Bock Đại học University of Wisconsin-Madison.

Protein cấu trúc tham gia vào cấu tạo hạt virus, làm cho chúng có hình dạng, kích thước nhất định và bảo vệ genom của virus khỏi các điều kiện bất lợi. Protein cấu trúc bao gồm protein của nucleocapsid, protein nền (matrix), protein vỏ ngoài (Hình 3). Protein nucleocapsid có thể tự lắp ráp (ví dụ ở TMV, polio) hay lắp ráp với sự trợ giúp của một khung protein tạm thời, làm nhiệm vụ dàn giáo để tạo đầu phage hoặc cấu trúc khối đa diện, protein này chỉ tồn tại khi lắp ráp nucleocapsid và sẽ bị mất đi ở virus trưởng thành. Ví dụ capsid của virus polio có cấu tạo tương đối đơn giản, gồm 4 protein là VP1, VP2, VP3 và VP4. Các protein này tham gia lắp ráp tạo capsid thông qua một cấu trúc tiền chất (procapsid), bao gồm VPO (một protein tiền chất) và VP1, VP3. Protein VPO lại được cắt thành VP2 và VP4 khi vỏ capsid tiến hành lắp ráp với acid nucleic của nó. Capsid của virus reo phức tạp hơn nhiều. Đây là capsid trần có hai lớp vỏ. Protein capsid ngoài chức năng bảo vệ acid nucleic genom và lắp ráp để hình thành virion còn phải tương tác với acid nucleic genom trong suốt quá trình lắp ráp. Sự bao gói phân tử acid nucleic vào trong vùng xác định, cần phải có sự sắp xếp và nén genom lại và báo hiệu sự kết hợp với protein capsid đã lựa chọn, thông qua liên kết hóa học. Ví dụ protein N của virus rhabdo và protein NP của virus cúm là các protein có acid amin mang điện tích dương sẽ tương tác với acid nucleic mang điện tích âm, nên chúng sẽ hút nhau, tạo thuận lợi cho việc lắp ráp. Việc bọc gói sẽ trở nên phức tạp hơn khi virus có genom nhiều đoạn, ví dụ ở virus cúm có 8 đoạn ARN cần phải bọc gói trong cùng một vỏ capsid.

Vỏ ngoài bao quanh nucleocapsid được hình thành từ màng nhân, màng sinh chất hoặc màng lưới nội chất khi virus nảy chồi. Phía trong của vỏ ngoài là protein glycolipid.

Protein nền là protein nằm phía trong, giữa vỏ capsid và vỏ ngoài, giữ mối liên kết giữa hai vỏ này. Chúng thường không được glycosyl hóa và có thể chứa các protein xuyên màng để làm neo, hoặc có thể liên kết với màng nhờ các vùng kỵ nước nằm trên bề mặt hoặc nhờ mối tương tác giữa protein của chúng với glycoprotein vỏ ngoài. ở HSV, khoảng không giữa vỏ ngoài và capsid là lớp vô định hình được xem như một lớp màng (tegument).

Glycoprotein ngoài của virus được neo vào vỏ nhờ các protein xuyên màng. Phần lớn chúng nằm nhô ra phía ngoài vỏ với một cái đuôi ngắn ở phía trong. Nhiều glycoprotein là monome, chúng ghép lại với nhau tạo thành những chiếc gai có thể quan sát được dưới kính hiển vi điện tử. ở các virus có vỏ ngoài, các gai này có chức năng kháng nguyên, ví dụ gai G ở virus dại, gai gp 120 ở HIV và gai HA ở virus cúm.

Ở cả virus trần (ví dụ polio) và virus có vỏ ngoài các protien cấu trúc này sẽ tương tác với receptor trên bề mặt tế bào chủ để mở đầu cho quá trình gây nhiễm. Cơ thể chống trả lại thông qua đáp ứng miễn dịch. Dựa vào mối tương tác này để thiết kế vacxin chống virus.

Tất cả các protein của virus đều được dịch mã từ mARN của virus. Các mARN này có thể

a)- được phiên mã từ genom ADN của virus (ví dụ HSV), hoặc

b)- từ mạch bổ sung với genom ARN âm (ví dụ virus cúm) hoặc

c)-chính là genom của virus ARN dương (ví dụ virus bại liệt) Protein của virus có thể được xử lý sau dịch mã. Lúc đầu tổng hợp một protein lớn (polyprotein) sau đó nhờ proteaza phân cắt để tạo các phân tử nhỏ (ví dụ polyprotein của virus polio, phức hợp gag-polymeraza của virus HIV). Chúng có thể được phosphoryl hóa. Mức độ phosphoryl hóa thường xác định mức độ chức năng của protein (ví dụ protein N và NS của virus rhabdo). Sự gắn gốc đường vào protien (glycosyl hoá) là gắn cả với N và O. Đối với nhiều protein virus (thường là glycoprotein vỏ ngoài) gốc đường có thể chiếm 70% trọng lượng protein. Các biến đổi sau dịch mã khác như myristyl hóa, acyl hoá và palmitoyl hóa cùng được tiến hành.

2.4 Acid nucleic của virus

2.5.1 Các loại genom của virus

Như trên đã nói, genom của virus rất đa dạng về cấu trúc, kích thước và thành phần nucleotid. Chúng có thể là ADN hoặc ARN, chuỗi đơn hoặc kép, thẳng hoặc khép vòng. Kích thước genom có thể từ 3500 nucleotid (ở phage nhỏ) đến 560.000 nucleotid (ở virus herpes). Các trình tự genom virus phải được đọc mã bởi tế bào chủ, cho nên các tín hiệu điều khiển phải được các yếu tố của tế bào chủ nhận biết. Các yếu tố này thường liên kết với protein virus. Do có kích thước nhỏ nên genom virus đã tiến hoá để sử dụng tối đa tiềm năng mã hóa của mình. Vì thế hiện tượng gen chồng lớp và hiện tượng cắt nối (splicing) mARN ở virus là rất phổ biến.

thiếu quá trình xâm nhập

Một số đặc điểm của genom virus cần lưu ý:

* Genom ADN kép (ví dụ ở virus pox, herpes và adeno) thường có kích thước lớn nhất.

* Genom ADN kép khép vòng (siêu xoắn hoặc không siêu xoắn) thường thấy ở phage

* Genom ADN kép ở virus vaccinia có hai đầu khép kín

ADN đơn dạng thẳng (ví dụ virus parvo) có kích thước rất nhỏ.

Các ADN dạng thẳng thường có trình tự lặp lại ở đầu.

* Tất cả genom ARN kép đều phân đoạn (chứa một số đoạn không giống nhau, mang thông tin di truyền tách biệt).

* Genom ARN đơn được phân thành ARN dương (genom +) và ARN âm (genom -) dựa vào trình tự nucleotid của mARN.

Phần lớn genom ARN đơn đều không phân đoạn trừ virus orthomyxo (virus cúm).

* Virus retro có genom là hai phân tử ARN đơn giống nhau, nối với nhau ở đầu 5 nhờ cầu nối hydro.

* Virus đốm câyAlfalfa (AMV) có genom gồm 4 đoạn ARN đơn, dương, dạng thẳng, được gói vào 4 vỏ capsid khác nhau nên còn gọi là virus dị capsid (hetero-capsidic) để phân biệt với virus mà tất cả các đoạn đều được gói trong một hạt-virus đồng capsid (isocapsidic).

2.5.2 Phương pháp nghiên cứu

Những tiến bộ về sinh học phân tử trong vài thập niên gần đây đã giúp cho việc nghiên cứu acid nucleic trở nên dễ dàng và nhanh chóng hơn. Hệ gen của các đại diện của hầu hết các họ virus đều được giải trình tự, các khung đọc mở của chúng đã được biết rõ, các sản phẩm của hệ gen đã được xác định tính chất. Điều đó cho phép có thể so sánh các trình tự đã biết trong ngân hàng gen với các trình tự đang nghiên cứu và so sánh với các trình tự của các sinh vật khác, nhân sơ và nhân thật, qua đó có thể thấy sự tương đồng cũng như sự tiến hoá trong sinh giới.

Gen virus cũng có thể được tách dòng vào các vectơ khác nhau và được phân tích nhờ kỹ thuật phát sinh đột biến điểm định hướng (site-directed mutagenesis) và kỹ thuật phát sinh đột biến điểm đặc hiệu (site-specific mutagenesis) để nghiên cứu vai trò của các acid amin riêng biệt trong việc xác định cấu trúc và chức năng của protein.

Virus ADN thường được biểu hiện trên sơ đồ là một phân tử dạng thẳng với các vị trí enzym giới hạn nằm rải rác khắp genom. Có hàng chục enzym giới hạn đã được dùng để phân cắt ADN thành các đoạn nhỏ với trình tự nucleotid đặc thù. Mỗi genom ADN có một bản đồ enzym cắt giới hạn đặc trưng cho chúng. Điều này không thể có với genom ARN, trừ phi nhờ enzym phiên mã ngược tiến hành tổng hợp cADN từ ARN khuôn. Lúc đó cADN sẽ bị enzym giới hạn cắt.

Acid nucleic của virus có thể được đặc trưng bởi nhiệt độ nóng chảy (Tm), mật độ nổi trong gradient nồng độ xesi clorua (CsCl), giá trị S trong gradient nồng độ saccaroza, có hoặc không có khả năng gây nhiễm, sự mẫn cảm với nucleaza và sự xuất hiện dưới kính hiển vi điện tử

Loại acid nucleic Cấu trúc Ví dụ

ADN đơn Chuỗi đơn, dạng thẳng

Chuỗi đơn, khép vòng Virus parvo

Phage jX174, M13, fd

Herpes, adeno, coliphage T, phage l.

ADN kép Chuỗi kép, dạng thẳng

Chuỗi kép, dạng thẳng, trên một mạch có những chỗ đứt ở cầu nối phosphodieste.

Chuỗi kép với hai đầu khép kín

Chuỗi kép khép vòng kín Coliphage T5

Vaccinia, Smallpox

Polioma (SV40), papiloma, phage PM2, virus đốm hoa lơ

ARN đơn

Chuỗi đơn, dương dạng thẳng

Chuỗi đơn, âm, dạng thẳng

Chuỗi đơn, dương, dạng thẳng, nhiều đoạn.

Chuỗi đơn, dương dạng thẳng gồm hai đoạn gắn với nhau.

Chuỗi đơn, âm dạng thẳng, phân đoạn

Picorna (polio, rhino), toga, phage ARN, MTV và hầu hết virus thực vật.

Rhabdo, paramyxo, (sởi, quai bị)

Virus đốm cây tước mạch (Bromus) (các đoạn được bao gói trong các virion tách biệt).

Retro (HIV, Sarcoma Rous)

ARN kép Chuỗi kép, dạng thẳng, phân đoạn Orthomyxo (cúm)

Reo (rota), một số virus gây u ở thực vật, NPV ở côn trùng, phage j6 và nhiều virus ở nấm (mycovirus).

Bảng các loại acid nucleic của virus

Kích thước genom thay đổi rất nhiều ở các virus khác nhau. Các genom nhỏ nhất (ví dụ Bactariophage MS2, Q) có kích thước 1x106 Da đủ để mã hóa cho 3-4 protein. Một số virus khác tận dụng tối đa không gian của genom bằng cách sử dụng các gen chồng lớp, tức là các gen gối lên nhau trên cùng khung đọc, chỉ khác nhau ở diểm khởi đầu hoặc kết thúc.

Các genom của coliphage T chẵn, herpes, vaccinia có kích thước 1,6x108 Da có thể mã hóa cho 100 protein.

Genom ADN

* Các virus ADN có kích thước rất nhỏ (như x 174, M13 hay parvo) thường có genom là ADN chuỗi đơn. Một số là ADN đơn, dạng thẳng, song một số khác lại khép vòng.

* Hầu hết virus ADN sử dụng ADN kép làm vật liệu di truyền. Một số chứa genom ADN kép dạng thẳng nhưng số khác lại chứa ADN kép dạng vòng. Phage lamda chứa ADN kép dạng thẳng nhưng có hai đầu dính là đoạn đơn bổ sung dài 12 nucleotid nên có thể bắt cặp để khép vòng.

* Ngoài các nucleotid thông thường, ở nhiều virus còn có các base đặc biệt, ví dụ phage T chẵn ký sinh ở E.coli mang 5 hydroxymetyl cytosin thay vì cytosin. Glucoza thường gắn vào nhóm hydroxymetyl.

* Ở virus ADN kép có kích thước lớn (ví dụ virus họ herpes) genom có cấu tạo khá phức tạp. Kích thước genom thay đổi, từ virus herpes simplex và varicella zoster (120 180kbp) đến virus cytomegalo và HHV-6 (180 230 kbp). ADN mã cho hơn 40 protein cấu trúc và hơn 40 protein không cấu trúc. Cấu trúc genom ít thay đổi giữa các thành viên trong họ nhưng chúng là nhóm duy nhất chứa các đồng phân (isomer) của cùng một phân tử ADN. Mỗi hạt chứa một đồng phân gồm hai đoạn nối với nhau bằng liên kết cộng hóa trị, đoạn dài duy nhất (UL) và đoạn ngắn duy nhất (US). Ở hai đầu mỗi đoạn lại có các đoạn ngắn lạp lại trái chiều. Các đoạn này khác nhau ở các hạt virus khác nhau, do đó làm cho genom thay đổi ít nhiều (lớn hoặc nhỏ hơn kích thước trung bình).

* Genom của virus adeno là dạng thẳng có kích thước 30 - 38 kbp nhỏ hơn genom của virus herpes. Mỗi virus chứa 30 40 gen. Genom có hai đầu lập lại trái chiều dài 100-180 kbp. Đoạn 50 base đầu tiên khá giống nhau ở các virus khác nhau và thường chứa nhiều cặp A-T. Điểm nổi bật của đoạn đầu phân tử ADN ở virus adeno là khi genom tách khỏi virion một mạch sẽ tạo vòng "panhandle" và oligome. Điều này liên tưởng đến phage , nhưng khác ở chỗ ADN của adeno không có đầu đơn. Ở mỗi đầu 5 của genom có gắn một protein 55 kDa. Protein này đóng vai trò quan trọng trong sao chép.

Genom ARN

Virus ARN thường có genom nhỏ hơn genom của virus ADN

* Các phân tử ARN được chia làm hai loại: ARN (+) và ARN (-)

ARN (+) có trình tự nucleotid trùng với trình tự nucleotid của mARN, nên có thể dùng thay cho mARN trong quá trình dịch mã.

ARN (-) có trình tự bổ sung với mARN

* Cơ chế tổng hợp mARN là đặc điểm quan trọng để phân biệt các virus ARN

* Hầu hết các phân tử mARN ở eukaryota là đơn gen (monocistronic), chỉ mã hóa cho một protein, trong khi tất cả các virus ARN đã biết đều là đa gen (Polycistronic), mã hóa cho nhiều protein

* Genom ARN không dùng làm khuôn để trực tiếp tổng hợp ARN của virion mà phải qua mạch trung gian

* Đa số ARN (+) đều có mũ ở đầu 5 để bảo vệ khỏi tác động của phosphataza và nucleaza. ở virus picorna mũ được thay thế bởi protein VPg (protein gắn với genom).

* Đầu 3 của đa số genom ARN (+) được gắn đuôi poly (A) giống như mARN của eukaryota

* Virus ARN (-) thường có genom lớn hơn virus ARN (+)

Một số virus ARN có genom phân đoạn. Ví dụ virus cúm có 8 đoạn ARN (-), virus reo có 10 12 đoạn ARN kép. Các đoạn này không giống nhau và mã hóa cho các protein khác nhau, trong khi 2 phân tử ARN (+) ở virus retro thì giống hệt nhau.

Bài 14 Dinh dưỡng của vi sinh vật

13.1. YÊU CẦU DINH DƯỠNG CỦA VI SINH VẬT

13.1.1. Thành phần hoá học của tế bào vi sinh vật

Cơ sở vật chất cấu tạo nên tế bào vi sinh vật là các nguyên tố hoá học. Căn cứ vào mức độ yêu cầu của vi sinh vật đối với các nguyên tố này mà người ta chia ra thành các nguyên tố đa lượng và các nguyên tố vi lượng. Các nguyên tố chủ yếu bao gồm: C, H, O, N, P, S, K, Mg, Ca và Fe. Trong số này có 6 loại chủ yếu (chiếm đến 97% trọng lượng khô của tế bào vi sinh vật), đó là C, H, O, N, P và S. Các nguyên tố vi lượng thường là Zn, Mn, Na, Cl, Mo, Se, Co, Cu, W, Br và B. Tỷ lệ các nguyên tố hoá học tham gia cấu tạo tế bào vi sinh vật là không giống nhau ở các nhóm vi sinh vật khác nhau. Ví dụ nấm men, nấm sợi và vi khuẩn có lượng chứa trung bình của 6 nguyên tố chủ yếu là không giống nhau (bảng 13.1):

Bảng 13.1: Lượng chứa trung bình các loại nguyên tố chủ yếu trong tế bào một số nhóm vi sinh vật (% trọng lượng khô)

Nguyên tố Vi khuẩn Nấm men Nấm sợi

C

H

O

N

P

S ~50

~8

~20

~15

~3

~1 ~50

~7

~31

~12

-

- ~48

~7

~40

~5

-

-

Theo các tài liệu của Tempest (1969), Pirt (1975) và Herbert (1976) thì thành phần trung bình của các nguyên tố tạo nên tế bào vi sinh vật nói chung là như sau:

Bảng 13.2: Thành phần các nguyên tố cấu tạo nên sinh khối tế bào

Nguyên tố % trọng lượng khô*

Các nguồn dinh dưỡng điển hình được sử dụng cho sinh trưởng VSV trong môi trường

Trung bình Biên độ

C

O

N

H

P

S

K

Mg

Ca

Cl

Fe

Na

Những nguyên tố khác,Mo, Ni, Co, Mn, Zn, .. 50

21

12

8

3

1

1

0.5

1

0.5

0.5

1

0.5 45-58

18-31

5-17

6-8

1.2-10

0.3-1.3

0.2-5

0.1-1.1

0.02-2.0

0.01-5.0 CO2, hợp chất hữu cơ

H20, 02, các hợp chất hữu cơ

NH3, NO3-, các hợp chất hữu cơ chứa N

Nước, các hợp chất hữu cơ.

Phosphate và các hợp chất chứa P.

SO4-2, H2S, và các hợp chất chứa S.

K+ (có thể thay thế bằng Rb+)

Mg2+

Ca2+

Cl-

Fe3+, Fe2+ và phức chất của Fe

Na+

Lấy từ các ion vô cơ khác

*Các tế bào bao gồm 70% trọng lượng là nước và 30% là các nguyên liệu khô khác. Mức trung bình này được tính theo sinh trưởng của vi khuẩn Gr(-) trong điều kiện dư thừa chất dinh dưỡng ở nuôi cấy theo mẻ.

Vi khuẩn lưu huỳnh (sulfur bacteria), vi khuẩn sắt (iron bacteria) và vi khuẩn đại dương (marine bacteria) có lượng chứa các nguyên tố S, Fe, Na, Cl nhiều hơn so với các nhóm vi khuẩn khác. Tảo Silic (diatom) có chứa lượng SiO2 khá cao trong thành tế bào. Thành phần các nguyên tố hoá học còn thay đổi trong một phạm vi nhất định tuỳ thuộc vào tuổi nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy. Khi nuôi cấy trên các môi trường có nguồn N phong phú thì lượng chứa N trong tế bào sẽ cao hơn so với khi nuôi cấy trên các môi trường nghèo nguồn N.

Các nguyên tố hoá học chủ yếu tồn tại trong tế bào vi sinh vật dưới dạng chất hữu cơ, chất vô cơ và nước. Chất hữu cơ thường bao gồm protein, carbon hydrat, lipid, acid nucleic, vitamin và các sản phẩm phân giải của chúng cũng như các chất trao đổi chất. Để phân tích các thành phần hữu cơ trong tế bào thường sử dụng hai phương pháp: một là, dùng phương pháp hoá học để trực tiếp chiết rút từng thành phần hữu cơ trong tế bào, sau đó tiến hành phân tích định tính và định lượng. Hai là, phá thành tế bào, thu nhận các thành phần kết cấu hiển vi rồi phân tích thành phần hoá học của từng kết cấu đó. Chất vô cơ thường đứng riêng rẽ dưới dạng muối vô cơ hoặc kết hợp với chất hữu cơ. Khi phân tích thành phần vô cơ trong tế bào người ta thường phân tích tro sau khi đã nung tế bào ở nhiệt độ 5500 C, chất vô cơ thu được dưới dạng các oxit vô cơ được gọi là thành phần tro. Dùng phương pháp phân tích vô cơ có thể định tính hay định lượng từng nguyên tố vô cơ.

Bảng 13.3:Thành phần hóa học của tế bào vi khuẩn (theo F.C.Neidhardt et al.,1996)

Phân tử khô (1) / tế bào % khối lượng Số phân tử Số loại phân tử

- Nước

- Các đại phân tử

+Protein

+Polysaccharide

+Lipid

+ADN

+ARN

- Các đơn phân tử

+Aminoacid và tiền thể

+Đường và tiền thể

+Nucleotid và tiền thể

- Các ion vô cơ

Tổng cộng -

96

55

5

9,1

3,1

20,5

3,0

0,5

2

0,5

1

100 24 609 802

2 350 000

4 300

22 000 000

2,1

255 500

1

khoảng 2500

khoảng 1850

2 (2)

4 (3)

1

khoảng 660

khoảng 350

khoảng 100

khoảng 50

khoảng 200

khoảng 18

Chú thích:

(1) -Khối lượng khô của tế bào vi khuần Escherichia coli đang sinh trưởng là khoảng 2.8 x 10-13g.

(2) - Giả thiết Peptidoglycan và Glycogen là 2 thành phần chủ yếu.

(3) - Tế bào chứa vài loại phospholipid, do tính đa dạng của thành phần acid béo giữa các chi vi khuẩn khác nhau và do ảnh hưởng của điều kiện sinh trưởng mà có nhiều hình thức tồn tại của mỗi loại phospholipid.

Nước là thành phần không thể thiếu để duy trì hoạt động sống bình thường của tế bào. Nước thường chiếm đến 70-90% trọng lượng tế bào. Độ chênh lệch giữa trọng lượng tươi và trọng lượng khô chính là lượng nước trong tế bào, thường biểu thị bằng tỷ lệ % tính theo công thức sau đây:

(Trọng lượng tươi - Trọng lượng khô) / Trọng lượng tươi x 100%.

Đơn vị trọng lượng tế bào trong dịch nuôi cấy thường được biểu thị bằng đơn vị g/l hay mg/ml. Phương pháp nung khô tế bào ở nhiệt độ 5500C thường làm phân giải một số hợp chất của tế bào vì vậy khi tính trọng lượng khô của tế bào nên dùng phương pháp sấy khô ở 1050C hay làm khô ở nhiệt độ không cao trong chân không, hoặc làm khô nhanh nhờ tia hồng ngoại...

13.1.2. Các chất dinh dưỡng và chức năng sinh lý

Vi sinh vật chủ yếu thu nhận được chất dinh dưỡng từ môi trường bên ngoài. Căn cứ vào chức năng sinh lý khác nhau trong tế bào mà người ta thường chia các chất dinh dưỡng thành 5 nhóm lớn:

1) Nguồn carbon (source of carbon)

Là nguồn vật chất cung cấp C trong quá trình sinh trưởng của vi sinh vật. Trong tế bào nguồn C trải qua một loạt quá trình biến hoá hoá học phức tạp sẽ biến thành vật chất của bản thân tế bào và các sản phẩm trao đổi chất. C có thể chiếm đến khoảng một nửa trọng lượng khô của tế bào. Đồng thời hầu hết các nguồn C trong các quá trình phản ứng sinh hoá còn sinh ra trong tế bào nguồn năng lượng cần thiết cho hoạt động sống của vi sinh vật. Một số vi sinh vật dùng CO2 làm nguồn C duy nhất hay chủ yếu để sinh trưởng, khi đó nguồn C không phải là nguồn sinh năng lượng.

Vi sinh vật sử dụng một cách chọn lọc các nguồn C. Đường nói chung là nguồn C và nguồn năng lượng tốt cho vi sinh vật. Nhưng tuỳ từng loại đường mà vi sinh vật có những khả năng sử dụng khác nhau. Ví dụ trong môi trường chứa glucose và galactose thì vi khuẩn Escherichia coli sử dụng trước glucose (gọi là nguồn C tốc hiệu) còn galactose được sử dụng sau (gọi là nguồn C trì hiệu). Hiện nay trong các cơ sở lên men công nghiệp người ta sử dụng nguồn C chủ yếu là glucose, saccharose, rỉ đường (phụ phẩm của nhà máy đường) tinh bột (bột ngô, bột khoai sắn...), cám gạo, các nguồn cellulose tự nhiên hay dịch thuỷ phân cellulose.

Năng lực đồng hoá các nguồn C ở các vi sinh vật khác nhau là không giống nhau. Có loài có khả năng sử dụng rộng rãi nhiều nguồn C khác nhau, nhưng có loài khả năng này rất chọn lọc. Chẳng hạn vi khuẩn Pseudomonas có thể đồng hoá được tới trên 90 loại hợp chất C, nhưng các vi khuẩn thuộc nhóm dinh dưỡng methyl (methylotrophs) thì chỉ đồng hoá được các hợp chất 1C như methanol, methane...

Nguồn C chủ yếu được vi sinh vật sử dụng gồm có đường, acid hữu cơ, rượu, lipid, hydrocarbon, CO2, carbonat... (Bảng 13.4)

Bảng 13.4: Nguồn C được vi sinh vật sử dụng

Nguồn C Các dạng hợp chất

Đường glucose, fructose, maltose, saccharose, tinh bột, galactose, lactose, mannite, cellobiose, cellulose, hemicellulose, chitin...

Acid hữu cơ acid lactic, acid citric, acid fumaric, acid béo bậc cao, acid béo bậc thấp, aminoacid...

Rượu ethanol

Lipid lipid, phospholipid

Hydrocarbon khí thiên nhiên, dầu thô, dầu paraffin

Carbonate NaHCO3, CaCO3, đá phấn

Các nguồn C khác Hợp chất nhóm thơm, cyanide, protein, pepton, acid nucleic...

Hình 13.1: Sản lượng sinh trưởng tối ưu khi vi sinh vật dị dưỡng

sử dụng các nguồn C khác nhau

Nguồn carbon thường được sử dụng trong công nghiệp lên men là rỉ đường (molasses). Sự khác nhau giữa rỉ đường mía và rỉ đường củ cải được thấy rõ trong bảng 13.5

Bảng 13.5: Thành phần hóa học của rỉ đường củ cải và rỉ đường mía

Thành phần Tỷ lệ Rỉ đường củ cải Rỉ đường mía

Đường tổng số % 48-52 48-56

Chất hữu cơ khá đường % 2-17 9-12

Protein (N x 6,25) % 6-10 2-4

K % 2-7 1,5-5,0

Ca % 0,1-0,5 0,4-0,8

Mg % khoảng 0,09 khoảng 0,06

P % 0,02-0,07 0,6-2,0

Biotin mg/kg 0,02-0,15 1,0-3,0

Acid pantoteic mg/kg 50-110 15-55

Inositol mg/kg 5000-8000 2500-6000

Tiamin mg/kg khoảng 1,3 khoảng 1,8

Tỷ lệ các nguyên tố trong các hợp chất cao phân tử ở vi sinh vật có thể thấy rõ trong bảng sau đây:

Bảng 13.6: Tỷ lệ các nguyên tố trong các cao phân tử ở tế bào vi sinh vật

Thành phần % trọng lượng khô %C %H %O %N %S %P

Trung bình Biên độ dao động

Protein 55 15c-75 53 7 23 16 1 -

RNAd 21 5c -30e 36 4 34 17 - 10

DNAd 3 1c -5f 36 4 34 17 - 10

peptidoglycan 3 0g -20h 47 6 40 7 - -

Phospholipit 9 0i-15 67 7 19 2 - 5

Lipopolysaccharide 3 0h-4j 55 10 30 2 - 3

Lipit trung tính - 0-45k 77 12 11 - - -

Acid Teichoic - 0l-5d 28 5 52 - - 15

Glycogen 3 0-50k 28 6 49 - - -

PHB - 0-80k 45 7 37 - - -

PHA (C8)m - 0-60k 56 9 23 - - -

Polyphosphatd - 0-20n 68 - 61 - - 39

Cyanophycino - 0-10 - 15 25 27 - -

a. Theo Herbert (1976). Các thông số được thu nhận từ các vi sinh vật khác nhau, không điển hình cho một nhóm nào.

b. Ở E. coli (trong pha sinh trưởng log). Theo Neidhardt et al. (1990).

c. Các tế bào có nguồn dự trữ C.

d. Bao gồm các cao phân tử như ARN, ADN, polyphosphate hoặc một số thành phần của thành tế bào.

e. Tại mức độ có tỷ lệ sinh trưởng cao.

f. Các tế bào sinh trưởng chậm.

g. Các loài ký sinh không có thành tế bào.

h. Vi khuẩn Gram(+).

i. Các chủng thay thế nguồn phospholipid bằng các chất tương tự chứa P tự do, trong điều kiện hạn chế nguồn P

j. Vi khuẩn Gram(-)

k. Các tế bào trong điều kiện hạn chế nguồn N.

l. Hạn chế nguồn P.

m. PHA (polyhydroxyaldehyde) chứa 3-hydroxyoctanoic acid.

n. Một số nấm men và vi khuẩn.

o. Một số vi khuẩn lam có nguồn dự trữ N cyanophycin [(asp-arg)].n

*PHB= Poly- β- hydroxy butyrate

2) Nguồn N (source of nitrogen)

Nguồn N là nguồn cung cấp N cho vi sinh vật để tổng hợp nên các hợp chất chứa N trong tế bào. Thường không là nguồn năng lượng, chỉ một số ít vi sinh vật tự dưỡng (thuộc nhóm ammon hoá-ammonification, nhóm nitrate hoá- nitrification) dùng muối ammone, muối nitrate làm nguồn năng lượng. Trong điều kiện thiếu nguồn C một số vi sinh vật kỵ khí trong điều kiện không có oxy có thể sử dụng một số aminoacid làm nguồn năng lượng. Nguồn N thường được vi sinh vật sử dụng là protein và các sản phẩm phân huỷ của protein ( peptone, peptide, aminoacid...), muối ammone, nitrate, N phân tử (N2), purine, pyrimidine, urea, amine, amide, cyanide...(bảng 13.7)

Bảng 13.7: Nguồn N được vi sinh vật sử dụng

Nguồn N

Các dạng hợp chất

Protein và các sản phẩm phân giải của protein peptone, peptide, aminoacid... (một số vi sinh vật tiết men proteinase phân giải protein thành các hợp chất phân tử nhỏ hơn rồi mới hấp thu được vào tế bào)

Ammone và muối ammone NH3, (NH4)2SO4,... (dễ được hấp thu)

Nitrate KNO3 (dễ được hấp thu)

N phân tử N2 (với vi sinh vật cố định N)

Các nguồn N khác purine, pyrimidine, urea, amine, amide, cyanide (chỉ một số nhóm vi sinh vật mới có thể đồng hoá được)

Nguồn N thường được sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật gồm có pepton, bột cá, bột nhộng tằm, bột đậu tương, bột khô lạc, cao ngô, cao thịt, cao nấm men... Vi sinh vật sử dụng chọn lọc đối với nguồn N. Chẳng hạn xạ khuẩn sản sinh terramycin sử dụng cao ngô với tốc độ nhanh hơn so với sử dụng khô đậu tương hay khô lạc, bởi vì nguồn N trong cao ngô là các sản phẩm phân giải dễ hấp thu của protein. Cao ngô được coi là nguồn N tốc hiệu, còn khô dầu được coi là nguồn N trì hiệu. Loại N tốc hiệu là có lợi cho sự sinh trưởng của vi sinh vật, còn loại trì hiệu lại có lợi cho sự hình thành các sản phẩm trao đổi chất. Khi sản xuất terramycin chẳng hạn, người ta phối hợp sử dụng cao ngô và khô dầu theo một tỷ lệ nhất định để phối hợp giữa giai đoạn sinh trưởng tạo sinh khối và giai đoạn sinh tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất, nhằm mục tiêu là nâng cao sản lượng terramycin.

Năng lực hấp thu muối ammone và nitrate ở vi sinh vật là khá mạnh. Ion NH4+ sau khi được tế bào hấp thu có thể được trực tiếp sử dụng, do đó các nguồn muối ammone được coi là nguồn N tốc hiệu. Còn nitrate sau khi được hấp thụ cần khử thành NH4+ rồi mới được vi sinh vật sử dụng. Đa số các vi khuẩn hoại sinh (saprophyte), vi khuẩn đường ruột, vi sinh vật gây bệnh ở người, động vật, thực vật...đều có thể dùng muối ammone, muối nitrate làm nguồn N. Chẳng hạn các vi khuẩn Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa...đều có thể sử dụng nguồn (NH4)2SO4 và NH4NO3 làm nguồn N; xạ khuẩn có thể sử dụng KNO3 làm nguồn N; nấm sợi có thể sử dụng KNO3 làm nguồn N. Lúc dùng các muối như (NH4)2SO4 để làm nguồn N nuôi cấy vi sinh vật cần chú ý là sau khi vi sinh vật hấp thu NH4+ thì sẽ làm hạ thấp pH của môi trường. Người ta gọi đó là những muối có tính sinh lý acid. Ngược lại khi dùng các muối nitrate (như KNO3) sau khi vi sinh vật hấp thu NO3- thì sẽ làm nâng cao pH của môi trường. Người ta gọi đó là các muối có tính sinh lý kiềm. Để làm cho pH trong các môi trường nuôi cấy vi sinh vật ít bị biến động người ta bổ sung thêm các chất có tính đệm (buffer substance).

3) Nguồn muối vô cơ (source of inorganic salt)

Các muối vô cơ là nguồn chất dinh dưỡng không thể thiếu đối với sự sinh trưởng của vi sinh vật. Chúng có các chức năng sinh lý chủ yếu là: tham gia vào thành phần của các trung tâm hoạt tính ở các enzyme của vi sinh vật, duy trì tính ổn định của kết cấu cá đại phân tử và tế bào, điều tiết và duy trì cân bằng áp suất thẩm thấu của tế bào, khống chế điện thế oxy hoá khử của tế bào và là nguồn vật chất sinh năng lượng đối với một số loài vi sinh vật (bảng 13.8).

Bảng 13.8: Muối vô cơ và chức năng sinh lý của chúng

Nguyên tố Hợp chất sử dụng Chức năng sinh lý

P

KH2PO4, K2HPO4 Là thành phần của acid nucleic, nucleoprotein, phospholipid, coenzyme, ATP... Làm nên hệ thống đệm giúp điều chỉnh pH môi trường.

S

(NH4)2SO4, MgSO4 Là thành phần của các aminoacid chứa S, một số vitamin; glutathione có tác dụng điều chỉnh điện thế oxy hoá khử trong tế bào.

Mg

MgSO4 Là thành phần trung tâm hoạt tính của enzyme phosphoryl hoá hexose, dehydrogenase của acid isocitric, polymerase của acid nucleic, thành phần của chlorophyll và bacterio-chlorophyll.

Ca

CaCl2, Ca(NO3)2 Tạo tính ổn định của một số cofactor, enzyme duy trì, cần cho sự dựng trạng thái cảm thụ của tế bào.

Na

NaCl Thành phần của hệ thống chuyển vận của tế bào, duy trì áp suất thẩm thấu, duy trì tính ổn định của một số enzyme.

K

KH2PO4, KH2PO4 Là cofactor của một số enzyme, duy trì áp suất thẩm thấu của tế bào, là nhân tố ổn định của ribosome ở một số vi khuẩn ưa mặn.

Fe

FeS04 Thành phần của sắc tố vi khuẩn và một số enzyme, là vật chất nguồn năng lượng của một số vi khuẩn sắt, cần thiết để tổng hợp chlorophyll và độc tố vi khuẩn bạch hầu.

Trong quá trình sinh trưởng vi sinh vật còn cần tới một số nguyên tố vi lượng. Những nguyên tố này cũng có vai trò quan trọng mặc dầu chỉ cần với số lượng rất nhỏ, khoảng 10-8-10-6 mol/ L môi trường nuôi cấy. Nguyên tố vi lượng tham gia vào thành phần enzyme và làm hoạt hoá enzyme. (Bảng 13.9)

Bảng 13.9: Tác dụng sinh lý của nguyên tố vi lượng

Nguyên tố Tác dụng sinh lý

Zn Có mặt trong alcohol dehydrogenase, lactodehydrogenase, phosphatase kiềm, ARNpolymerase, ADNpolymerase...

Mn Có mặt trong peroxyd dismutase, carboxylase ciitric synthetase

Mo Có mặt trong reductase nitrate, nitrogenase, dehydrogenase formic.

Se Có mặt trong reductase glycin, reductase formic.

Co Có mặt trong mutase glutamic.

Cu Có mặt trong cytochrome oxydase.

W Có mặt trong dehydrogenase formic.

Br Có mặt trong urease, cần cho sự sinh trưởng của vi khuẩn hydrogen.

Nếu thiếu nguyên tố vi lượng trong quá trình sinh trưởng thì hoạt tính sinh lý của vi sinh vật bị giảm sút, thậm chí ngừng sinh trưởng. Do nhu cầu dinh dưỡng của vi sinh vật là không giống nhau cho nên khái niệm về nguyên tố vi lượng chi có ý nghĩa tương đối. Vi sinh vật thường tiếp nhận nguyên tố vi lượng từ các chất dinh dưỡng hữu cơ thiên nhiên, các hoá chất vô cơ, nước máy hay ngay từ trong các dụng cụ nuôi cấy bằng thuỷ tinh. Chỉ trong những trường hợp đặc biệt mới cần bổ sung nguyên tố vi lượng vào môi trường nuôi cáy vi sinh vật.

Vì nhiều nguyên tố vi lượng là kim loại nặng cho nên nếu dư thừa sẽ gây hại cho vi sinh vật. Khi cần bổ sung thêm nguyên tô vi lượng vào môi trường cần lưu ý khống chế chính xác liều lượng.

4) Nhân tố sinh trưởng

Nhân tố sinh trưởng (growth factor) là những hợp chất hữu cơ mà có những vi sinh vật cần thiết để sinh trưởng tuy với số lượng rất nhỏ và không tự tổng hợp đủ so với nhu cầu.

Các vi sinh vật khác nhau có những yêu cầu không giống nhau về chủng loại và liều lượng của các nhân tố sinh trưởng. Sau đây là một số ví dụ (bảng 13.10).

Bảng 13.10: Các nhân tố sinh trưởng cần thiết dối với một số loài vi sinh vật

Vi sinh vật Chất sinh trưởng Nhu cầu / ml

Acetobacter suboxydans

Clostridium acetobutylicum

Streptococcus pneumonia

Leuconostoc mesenteroides

Staphylococcus aureus

Corynebacterium diphtheria

Clostridium tetani

Lactobacillus arabinosus

Streptococcus faecalis

Lactobacillus delbruckii

Lactobacillus casei APAB, Acid nicotinic

APAB

choline

pyridoxal

thiamin

b-alanin

uracil

acid nicotinic

acid pantothenic

methionine

acid folic

arginine

tyrosine

thymonucleoside

ephedrin 0-10 ng

3 mg

0,15 ng

6 mg

0,025 mg

0,5ng

1,5 mg

0~4 mg

0,1 mg

0,02 mg

1,0 mg

0,02 mg

50 mg

8 mg

0-2 mg

1 ng

Chú thích: 1 mg= 10-6g; 1ng= 10-9g

Vi sinh vật tự dưỡng và một số vi sinh vật dị dưỡng (như Escherichia coli) thậm chí có thể sinh trưởng mà không cần bất kỳ nhân tố sinh trưởng nào. Mặt khác, cùng một loài vi sinh vật nhưng nhu cầu đối với nhân tố sinh trưởng cũng thay đổi tuỳ theo điều kiện môi trường. Ví dụ Mucor rouxii khi sinh trưởng trong điều kiện kỵ khí thì cần thiamin (B1) và biotin (H), nhưng trong điều kiện hiếu khí thì lại tự tổng hợp được các vitamin này. Có trường hợp chưa giải thích được bản chất của nhu cầu về nhân tố sinh trưởng ở một số loài vi sinh vật. Thông thường bổ sung vào môi trường các chất hữu cơ như cao nấm men, cao thịt, dịch đun động thực vật (nhộng, giá đỗ...) là có thể đáp ứng được nhu cầu về nhân tố sinh trưởng.

Căn cứ vào sự khác nhau về cấu trúc hoá học và chức năng sinh lý của các nhân tố sinh trưởng người ta chia nhân tố sinh trưởng thành các nhóm vitamin, aminoacid, purine và pyrimidine. Vitamin là nhân tố sinh trưởng được tìm thấy bản chất hoá học sớm nhất. Hiện nay người ta đã phát hiện được nhiều loại vitamin có tác dụng là nhân tố sinh trưởng. Một số vi sinh vật có thể tự tổng hợp được vitamin, nhưng nhiều loại khác lại cần được cung cấp vitamin trong môi trường dinh dưỡng thì mới sinh trưởng được. Vitamin chủ yếu là coenzyme hay cofactor của các enzyme tham gia vào quá trình trao đổi chất. Một số vi sinh vật không tự tổng hợp được những aminoacid nào đó, cần bổ sung vào môi trường các aminoacid đó hay bổ sung peptide chuỗi ngắn. Chẳng hạn vi khuẩn Leuconostoc mesenteroides cần tới 17 loại aminoacid mới sinh trưởng đươc. Một số vi khuẩn cần cung cấp D-alanin để tổng hợp thành tế bào. Purine và pyrimidine chủ yếu được dùng làm coenzyme hay cofactor của các enzyme cần thiết cho quá trình tổng hợp nucleoside, nucleotide và acid nucleic.

Bảng 13.11: Chức năng của một số vitamin thông thường đối với vi sinh vật

Vitamin Chức năng Ví dụ về các vi sinh vật cần cung cấp

Biotin (H) -Carboxyl hóa (cố định CO2)

-Trao đổi chất một carbon Leuconostoc mesenteroides (B)

Saccharomyces cerevisiae (F)

Ochromonas malhamensis (A)

Acanthammoeba castellanii (P)

Vitamin B12 -Sắp xếp lại phân tử

-Nhóm mang methyl trong trao đổi chất một carbon Lactobacillus spp. (B)

Euglena gracilis (A)

Tảo silic và nhiều vi tảo khác (A)

Acanthammoeba castellanii (P)

Acid folic -Trao đổi chất một carbon Enterococcus faecalis (B)

Tetrahymena pyriformis (P)

Acid lipoic -Chuyển nhóm acyl Lactobacillus casei (B)

Tetrahymena spp. (P)

Acid pantotenic -Tiền thể của CoA (oxy hóa pyruvat, trao đổi axit béo) Proteus morganii (B)

Hanseniaspora spp. (F)

Paramecium spp. (P)

Pyridoxin (B6) -Trao đổi acid amin Lactobacillus spp. (B)

Tetrahymena pyriformis (P)

Niacin -Tiền thể của NAD, NADP Brucella abortus (B)

Haemophilus influenza (B)

Blastocladia pringsheimii (F)

Crithidia fasciculata (P)

Riboflavin (B2) -Tiền thể của FAD, FMN Caulobacter vibrioides (B)

Dictyostelium spp. (F)

Tetrahymena pyriformis (P)

Bacillus anthracis (B)

Thiamin (B1) -Chuyển nhóm aldehyd (khử carboxyl pyruvat, oxy hóa acid α-keto) Phycomyces blakesleeanus (F)

Ochromonas malhamensis (A)

Colpidium campylum (P)

Chú thích: B-Vi khuẩn; F-Vi nấm; A-Vi tảo; P-Động vật nguyên sinh

5) Nước

Nước là thành phần không thể thiếu để vi sinh vật có thể sinh trưởng. Chức năng sinh lý của nước trong tế bào là:

- Hoà tan và chuyển vận các chất, hỗ trợ cho việc hấp thu chất dinh dưỡng, giải phóng các sản phẩm trao đổi chất.

- Tham gia vào hàng loạt các phản ứng hóa học trong tế bào.

- Duy trì cấu hình thiên nhiên ổn định của các đại phân tử như protein, acid nucleic...

- Là thể dẫn nhiệt tốt, hấp thu tốt nhiệt lượng sinh ra trong quá trình trao đổi chất và khuếch tán kịp thời ra bên ngoài để duy trì sự ổn định của nhiệt độ bên trong tế bào.

- Duy trì hình thái bình thường của tế bào.

- Thông qua quá trình thuỷ phân hay khử nước để khống chế kết cấu của tế bào (enzyme, vi ống, tiên mao...) và sự tháo lắp ở virút.

Tính hữu hiệu của nước đối với sự sinh trưởng của vi sinh vật thường được biểu thị bằng độ hoạt động (hoạt độ) của nước (water activity, aw). Đó là tỷ lệ giữa áp lực hơi nước của dung dịch trong những điều kiện nhiệt độ và áp lực nhất định với áp lực của hơi nước thuần khiết trong cùng những điều kiện như vậy:

aw = p w / pw0

Ở đây Pw là áp lực hơi nước của dung dịch, còn aw0 là áp lực của hơi nước thuần khiết. Pw0 của nước thuần khiết là 1.0. Dung dịch càng chứa nhiều dung chất (chất hoà tan) thì aw càng nhỏ. Vi sinh vật thường sinh trưởng trong điều kiện có aw trong khoảng 0,6-0,99. Đối với một số loài vi sinh vật khi aw quá thấp thì tốc độ sinh trưởng và tổng sinh khối giảm. Các vi sinh vật khác nhau có aw thích hợp không giống nhau (bảng 13.12)

Bảng 13.12: aw thích hợp nhất cho sinh trưởng ở một số nhóm vi sinh vật

Vi sinh vật aw

Vi khuẩn nói chung

Nấm men

Nấm sợi

Vi khuẩn ưa mặn

Vi nấm ưa mặn

Nấm men ưa áp suất thẩm thấu cao 0,91

0,88

0,80

0,76

0,65

0,60

Nhìn chung aw thích hợp nhất cho sự sinh trưởng của vi khuẩn cao hơn của nấm men và nấm sợi. Vi sinh vật ưa mặn có aw thích hợp nhất cho sự sinh trưởng là khá thấp.

Phần nước có thể tham gia vào các quá trình trao đổi chất của vi sinh vật được gọi là nước tự do. Phần lớn nước tồn tại trong tế bào vi sinh vật là nước tự do. Phần nước liên kết với các hợp chất hữu cơ cao phân tử trong tế bào được gọi là nước liên kết. Nước liên kết mất đi khả năng hoà tan và lưu động.

13.1.4. Khái niệm về sự sinh trưởng trong điều kiện hạn chế các chất dinh dưỡng

Ở môi trường nuôi cấy lắc trong phòng thí nghiệm, khi tất cả các chất dinh dưỡng được cung cấp cho sự sinh trưởng của vi sinh vật đã được thiết kế tối ưu thì sự dư thừa xảy ra vào lúc đầu và các tế bào sinh trưởng theo logarit với tốc độ sinh trưởng là lớn nhất. Tuy nhiên, trong mỗi hệ thống môi trường và kỹ thuật nuôi cấy, sự sinh trưởng của vi sinh vật không thể tiếp diễn mãi mà không bị giới hạn trong một khoảng thời gian dài. Một tính toán đơn giản để chứng minh nhận định này là: sau 2 ngày sinh trưởng theo logarit, một tế bào vi sinh vật cứ 20 phút lại nhân đôi một lần sẽ tạo ra xấp xỉ 2 x 1043 tế bào. Giả sử khối lượng trung bình của mỗi tế bào là 10-12 g thì toàn sinh khối tế bào trên sẽ có khối lượng gấp gần 400 lần khối lượng của quả đất. Vì vậy, trong mỗi một thể tích nuôi cấy, sự sinh trưởng luôn luôn sớm bị giới hạn do sự cạn kiệt của một hoặc vài chất dinh dưỡng.

Thuật ngữ "các chất dinh dưỡng hạn chế" được sử dụng với rất nhiều ý nghĩa, và thường vẫn bị nhầm lẫn. Các chất dinh dưỡng hạn chế có khả năng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng trong các môi trường nuôi cấy vi sinh vật theo hai cách riêng biệt: hóa học và và động học. Sự hạn chế hóa học được định nghĩa là khối lượng lớn nhất sinh khối có thể được tạo ra trong điều kiện giới hạn các chất dinh dưỡng. "Nguyên lý Liebig" bắt nguồn từ các nghiên cứu về sự màu mỡ trong nông nghiệp của Justus von Liebig vào năm 1840. Trong nghiên cứu này ông tìm ra rằng hàm lượng của một chất dinh dưỡng nào đó sẽ quyết định đến năng suất mùa màng, miễn là tất cả các chất dinh dưỡng khác đã có mặt một cách dư thừa (phương trình 1). Giới hạn động học xuất hiện khi nồng độ các chất dinh dưỡng là thấp (trong phạm vi từ miligram tới microgram trong mỗi lit), sự hạn chế các chất dinh dưỡng sẽ điều khiển tốc độ sinh trưởng riêng của tế bào (μ). Điều khiển động học về tốc độ sinh trưởng thường kéo theo các động lực bão hòa và phương trình Monod (phương trình 2) được sử dụng để mô tả mối quan hệ giữa nồng độ của các chất dinh dưỡng đối với tốc độ sinh trưởng riêng của tế bào (μ).

X = X0 + ( S0 - S) x YX/S (1)

μ = μmax x x s / (KS + S) (2)

Trong đó S0 là nồng độ ban đầu và s là nồng độ cuối cùng của các chất dinh dưỡng bị hạn chế S; X(X0) là nồng độ sinh khối (ban đầu); là sản lượng sinh khối thu được đối với chất dinh dưỡng S, μmax là tốc độ sinh trưởng riêng lớn nhất, và KS là hằng số ái lực cơ chất Monod.

Điều này thể hiện rõ trong hình 13.2 đối với sự sinh trưởng trong hệ thống nuôi cấy kín. Các tế bào ban đầu sinh trưởng không giới hạn cho đến khi sự tiêu thụ các chất dinh dưỡng hạn chế bị hết dần, dẫn đến tốc độ sinh trưởng suy giảm dần, sau đó tốc độ sinh trưởng ngừng hẳn. Đó là lúc đạt đến nồng độ cuối cùng của sinh khối. Trong nuôi cấy liên tục, người bổ sung môi trường một cách liên tục và một lượng môi trường dư thừa được loại bỏ. Tốc độ bổ sung thêm vào của các chất dinh dưỡng bị hạn chế sẽ điều khiển đồng thời cả μ và nồng độ sinh khối trong môi trường nuôi cấy (Pirt, 1975; Kovarova và Egli, 1998).

Trong thực nghiệm, người ta có thể nuôi cấy các tế bào trong các điều kiện đã được biết rõ, nhờ đó các chất dinh dưỡng hạn chế sẽ được xác định. Đối với việc nuôi cấy các vi sinh vật dị dưỡng để nghiên cứu và tạo ra các sản phẩm sinh khối, môi trường được thiết kế phổ biến với nguồn carbon và năng lượng giới hạn, tất cả các chất dinh dưỡng khác được cung cấp dư thừa. Tuy nhiên, trong quá trình công nghệ sinh học, sự giới hạn bởi các chất dinh dưỡng chứ không phải nguồn carbon giữ chức năng điều khiển các trạng thái sinh lý và quá trình trao đổi chất của vi sinh vật. Sự hạn chế các chất dinh dưỡng nào đó thường kích thích hoặc tăng cường sự tạo thành rất nhiều các sản phẩm trao đổi chất và các enzyme của vi sinh vật. Ví dụ, năng suất sẽ được tăng lên trong quá trình lên men tạo chất kháng sinh do sinh trưởng trong môi trường hạn chế photphat, sự sản xuất acid citric trong môi trường có sự hạn chế Fe-, Mn-, hoặc Zn. Còn sự sinh tổng hợp của NAD là được thực hiện trong điều kiện hạn chế Zn-Mn. Việc tích lũy các nguyên liệu dự trữ nội bào PHB hoặc PHA (chất dẻo sinh học-bioplastic) sẽ bị giới hạn bởi nguồn cung cấp hợp chất giàu nitrogen.

Rõ ràng là sự sinh trưởng của vi sinh vật được điều khiển thường xuyên không phải chỉ bởi một chất dinh dưỡng mà bởi sự kết hợp của hai hay nhiều chất dinh dưỡng đồng thời (Kovarova và Egli, 1998).

13.1.5. Thiết kế và phân tích môi trường sinh trưởng tối thiểu

Để sinh trưởng và tổng hợp các nguyên liệu tế bào cho bản thân mình, vi sinh vật phải thu nhận các thành phần cấu trúc (hay các tiền chất của chúng) và năng lượng cần thiết từ môi trường sống. Do đó, để nuôi cấy vi sinh vật trong phòng thí nghiệm thì các chất dinh dưỡng phải được cung cấp đầy đủ vào môi trường và các chất dinh dưỡng phải ở dạng mà các vi sinh vật này có thể sử dụng được.

Do có sự đa dạng sinh lý của thế giới vi sinh vật mà có vô số các môi trường với thành phần dinh dưỡng khác nhau đã được đưa ra, với mục đích hoặc là làm giàu một cách chọn lọc hoặc là để nuôi cấy một nhóm ví sinh vật đặc thù nào đó (LaPage và cs, 1970; Balows và cs 1992; Atlas, 1997). Tất cả các môi trường này đều chứa các thành phần với các chức năng dinh dưỡng rõ ràng, đặc biệt là cân nhắc về chức năng cấu trúc hoặc sinh năng lượng. Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu về chất dinh dưỡng được tiến hành định tính chứ không phải định lượng và các chất dinh dưỡng khác nhau được thêm vào nhiều hơn hay ít hơn một cách tùy ý. Ngoài ra, rất nhiều các môi trường nuôi cấy có chứa các thành phần không được biết rõ ràng bởi vì sử dụng các nguyên liệu hữu cơ như ngô, khoai tây,...

Trong cùng những điều kiện như: nhiệt độ hoặc pH, tốc độ sinh trưởng riêng lớn nhất của vi sinh vật bị ảnh hưởng bởi sự đa dạng của các chất dinh dưỡng trong môi trường. Điều này được minh họa một cách cụ thể đối với sự sinh trưởng của Salmonella typhimurium (thí nghiệm bởi Schaechter và cs, 1958). Họ đã sử dụng 22 môi trường có thành phần khác nhau và nhận thấy các tốc độ sinh trưởng khác nhau ở các môi trường trong các điều kiện dư thừa các chất dinh dưỡng. Kết quả cho thấy chất lượng các tiền chất đưa vào môi trường khoáng cho phép điều chỉnh tốc độ sinh trưởng một cách rõ ràng nhất.

A. Thiết kế môi trường và kiểm tra các chất dinh dưỡng giới hạn

1. Thiết kế môi trường sinh trưởng

Trong thiết kế môi trường sinh trưởng, quyết định đầu tiên được đưa ra là chọn lựa nồng độ cao nhất cho phép tạo ra sinh khối (Xmax), và xác định các chất dinh dưỡng giới hạn (theo nguyên lý Liebig). Điển hình, môi trường sinh trưởng cho các vi sinh vật dị dưỡng được thiết kế với nguồn năng lượng - carbon riêng biệt sẽ giới hạn lượng sinh khối được tạo ra, nhưng ngược lại tất cả các chất dinh dưỡng khác (được thêm vào dưới dạng các hợp chất đơn) được cung cấp dư thừa. Dựa vào giá trị X max, có thể tính toán được nồng độ tối thiểu của các nguyên tố khác nhau cần thiết trong môi trường nuôi cấy. Để đảm bảo sự dư thừa của tất cả chất dinh dưỡng không giới hạn trong môi trường thì nồng độ của chúng được nhân với nhân tố dư (FE). Bằng cách này, nồng độ của chất dinh dưỡng đòi hỏi trong môi trường tăng trưởng (Ereq) gấp x lần theo lý thuyết đối với nguồn carbon.

Ereq = X max / YX/E x FE (3)

YX/E (the individual average elemental growth yield) là sản lượng tăng trưởng trung bình dựa trên từng nguyên tố.

Một ví dụ cho việc thiết kế môi trường khi giới hạn nguồn carbon, cho phép tạo sản lượng sinh khối khô đạt 10g/l sinh (bảng 13.13). Cần chú ý rằng, trong môi trường này các thành phần được lựa chọn sao cho có thể thay đổi nồng độ của mỗi nguyên tố (ví dụ có thể thay thể MgCl2 và NaHSO4 bằng MgSO4). Hơn nữa, môi trường này chỉ có tính chất đệm yếu (weakly buffered), do đó cần thiết phải khống chế pH trong suốt quá trình sinh trưởng.

Cách thức này được sử dụng cho việc thiết kế môi trường nuôi cấy các vi sinh vật hiếu khí với mật độ sinh khối thấp và trung bình. Phức tạp hơn là thiết kế của môi trường cho nuôi cấy vi sinh vật kỵ khí, trong đó rất nhiều thành phần của môi trường dễ dàng kết tủa tại thế oxy hóa khử cần thiết, hoặc mật độ tế bào cao trong đó có chứa các chất hòa tan hoặc vấn đề độc tính của một số môi trường.

Bảng 13.13: Thiết kế môi trường tối thiểu bị giới hạn bời nguồn C cho phép sản lưởng sinh khối khô đạt 10g/l a,b

Thành phần môi trường Nguồn Năng suất sinh trưởng

(g sinh khối khô/g nguyên tố) Các nhân tố dự thừa với nguồn carbon tương ứng Khối lượng các nguyên tố (g/l) Khối lượng các thành phần cấu tạo (g/l)

Glucose C, năng lượng 1 1 10 25.0

NH4Cl N 8 3 3.75 14.33

NaH2 PO4 P 33 5 1.52 5.88

KCl K 100 5 0.5 0.95

NaH2SO4 Na 100 5 0.5 1.87

MgCl2 Mg 200 5 0.25 0.98

CaCl2 Ca 100 10 1.0 2.77

FeCl2 Fe 200 10 0.5 1.13

MnCl2 Mn 104 20 0.02 0.046

ZnCl2 Zn 104 20 0.02 0.042

CuCl2 Cu 105 20 0.002 0.0042

CoCl2 Co 105 20 0.002 0.0044

a. Dựa vào sản lượng tăng trưởng của các nguyên tố trong sinh khối khô.

b. Theo Pirt (1975), Egli và Fiechter (1981). Sản lượng tăng trưởng của C và các nguyên tố vết Zn, Cu, Mo, Mn

Nhân tố YX/E được phân tích từ sinh khối khô khi nuôi cấy trong điều kiện không giới hạn tăng trưởng của hệ thống đóng. Đối với carbon, oxy, và hydro, YX/E không thể được tính toán chính xác trực tiếp từ các thành phần cơ bản của tế bào do những thành phần này không chỉ tạo nên sinh khối, mà còn có các chức năng trao đổi chất khác.Ngoài ra, trong bảng không nói đến một số lượng lớn các chất nhận điện tử cần thiết phải được đảm bảo cho quá trình sinh trưởng.

Tính chất hóa học của các thành phần trong môi trường sinh trưởng phải được tính đến khi chọn FE. Ví dụ, phần lớn các nguyên tố vi lượng dễ dàng kết tủa trong môi trường sinh trưởng ở pH trung tính hoặc kiềm và do đó giảm bớt khả năng hấp thụ sinh học (khó khăn để xác định). Do đó, chúng được thêm vào nhiều gấp 10 tới 20 lần (Bridson và Brecker, 1970).

Trong công nghệ sinh học, quá trình nuôi cấy theo mẻ (batch) và nuôi cấy theo mẻ có bổ sung (fed-batch) được nghiên cứu từ lâu vì rất có lợi khi thiết kế các môi trường chứa tất cả nguyên tố với lượng chính xác lượng cần thiết, sao cho tất cả các nguyên tố phải được tiêu thụ hết tại cuối kì tăng trưởng. Tuy nhiên, rất khó khăn có thể đạt được điều này do tính đa dạng của các nguyên tố và sự phụ thuộc của chúng vào điều kiện nuôi cấy.Tất nhiên, trong công nghệ sinh học, việc tối ưu hóa môi trường là rất quan trọng để tính toán sự tiêu thụ chất dinh dưỡng và để hạn chế tối đa sự hao phí nguyên liệu, hóa chất.

Bảng 13.14: Các nhân tố tăng trưởng sản lượng của các chất cho và nhận điện tử

Các chất cho điện tử

H2 YX/H2 = 12g/mol

S2O3 YX/S2O3 = 4g/mol

Fe2+ YX/Fe2+ = 0.35g/mol

NH4+ - NO3- YX/NH4 = 1.3-2.6/mol

NO2_ - NO3 YX/NO2 = 0.9-1.8g/mol

Chất nhận điện tử

O2 YX/O2 = 10a-42bg/mol

NO3- - N2 YX/NO3 = 27g/molc

NO2- - N2 YX/NO2 = 17g/molc

N2O- - N2 YX/N2O = 9g/molc

a. Đối với các cơ chất khử là methane hoặc n-alkanes.

b. Đối với các chất oxy hóa là glucose.

c. Đối với Paracoccus denitrificans với nguồn carbon là glutamate

13.2. CÁC LOẠI HÌNH DINH DƯỠNG CỦA VI SINH VẬT

Vi sinh vật có tính đa dạng rất cao cho nên các loại hình dinh dưỡng (nutritional types) là khá phức tạp. Căn cứ vào nguồn C, nguồn năng lượng, nguồn điện tử, có thể chia thành các loại sau đây (bảng 13.15)

Bảng 13.15: Các loại hình dinh dưỡng của vi sinh vật (I)

-Nguồn C (Carbon sources)

+Tự dưỡng (autotroph) +Dị dưỡng (heterotroph)

CO2 là nguồn C duy nhất hay chủ yếu

Nguồn C là chất hữu cơ

-Nguồn năng lượng (Energy sources)

+Dinh dưỡng quang năng

(phototroph)

+Dinh dưỡng hoá năng

(chemotroph)

Nguồn năng lượng là ánh sáng

Nguồn năng lượng là năng lượng hóa

học giải phỏng ra từ sự oxy hoá hợp

Nguồn điện tử (Electron sources)

+ Dinh dưỡng vô cơ

(lithotroph)

+ Dinh dưỡng hữu cơ

(organotroph)

Dùng các phân tử vô cơ dạng khử để cung cấp điện tử

Dùng các phân tử hữu cơ để cung cấp

điện tử

Có thể mô hình hóa chức năng sinh lý của các chất dinh dưỡng đối với sự sinh trưởng của vi sinh vật qua hình 13.3 sau đây:

Hình 13.3: Mô hình sơ lược về chức năng sinh lý của các chất dinh dưỡng đối với

sự sinh trưởng của vi sinh vật.

Có thể đem phần lớn vi sinh vật phân thành bốn nhóm chính (bảng 13.16)

Bảng 13.16: Các loại hình dinh dưỡng của vi sinh vật (II)

Loại hình dinh dưỡng Nguồn năng lượng; Hydrogen; điện tử; Carbon Đại diện

-Tự dưỡng quang năng vô cơ (photolithoautotrophy) Quang năng; H2, H2S,

S hoặc H2O; CO2 Vi khuẩn lưu huỳnh, màu tía,màu lục; Vi khuẩn lam.

-Dị dưỡng quang năng

hữu cơ (photoorganohetero-

trophy) Quang năng; Chất hữu cơ Vi khuẩn phi lưu huỳmh màu tía, màu lục.

-Tự dưỡng hoá năng

vô cơ (chemolithoauto-

trophy) Hoá năng (vô cơ); H2, H2S, Fe2+, NH3, hoặc NO2-, CO2 Vi khuẩn oxy hoá S, vi khuẩn hydrogen, vi khuẩn nitrát hoá, vi khuẩn oxy hoá sắt.

-Dị dưỡng hoá năng

hữu cơ (chemoorganohetero-

trophy) Hoá năng (hữu cơ);

Chất hữu cơ Động vật nguyên sinh, nấm, phần lớn các vi khuẩn không quang hợp (bao gồm cả các vi khuẩn gây bệnh).

Loại Tự dưỡng quang năng vô cơ còn được gọi là Photolithotrophic autotrophy; loại Dị dưỡng quang năng hữu cơ còn được gọi là Photoorganotrophic heterotrophy; loại Tự dưỡng hóa năng vô cơ còn được gọi là Chemolithotrophic autotrophy; loại Dị dưỡng hóa năng hữu cơ còn được gọi là Chemoorganotrophic heterotrophy.

Chúng ta sẽ xem xét kỹ hơn các quá trình trao đổi chất của từng nhóm vi sinh vật này trong chương Trao đổi chất.

Các vi sinh vật thuộc loại hình Tự dưỡng quang năng vô cơ và Dị dưỡng quang năng vô cơ có thể lợi dụng ánh sáng để sinh trưởng. Chúng có vai trò quan trọng trong quá trình diễn biến của môi trường sinh thái trong giai đoạn cổ xưa của Trái đất. Vi sinh vật Tự dưỡng hoá năng vô cơ phân bố rộng rãi trong đất và trong nước, chúng tham gia tích cực vào các vòng tuần hoàn vật chất trên Trái đất. Vi sinh vật Dị dưỡng hoá năng hữu cơ dùng chất hữu cơ vừa làm nguồn carbon vừa làm nguồn năng lượng. Hầu hết các loài vi khuẩn, nấm, động vật nguyên sinh đã biết đều thuộc loại hình Dị dưỡng hoá năng hữu cơ. Tất cả các vi sinh vật gây bệnh đã biết đều thuộc loại này. Trong loại hình dị dưỡng hoá năng hữu cơ lại chia thành hai nhóm: Nhóm Hoại sinh (metatrophy) dùng chất hữu cơ chết (xác động thực vật) để làm nguồn carbon. Nhóm Ký sinh (paratrophy) ký sinh trên cơ thể thực vật, người và động vật để hấp thu chất dinh dưỡng. Chúng không thể sống được khi tách rời khỏi vật chủ. Tuy nhiên giữa hai nhóm này còn có những loại hình trung gian là Hoại sinh không bắt buộc (facultive metatrophy) và Ký sinh không bắt buộc (facultive paratrophy).

Một số chủng vi sinh vật phát sinh đột biến (đột biến tự nhiên hay đột biến nhân tạo) mất đi năng lực tổng hợp một (hoặc một số) chất cần thiết cho sinh trưởng (thường là nhân tố sinh trưởng như aminoacid, vitamin), chúng chỉ sinh trưởng được khi bổ sung vào môi trường các chất này. Người ta gọi chúng là loại hình Khuyết dưỡng (auxotroph). Các chủng hoang dại tương ứng được gọi là loại hình Nguyên dưỡng (prototroph). Người ta thường sử dụng các chủng vi sinh vật khuyết dưỡng trong nghiên cứu Di truyền học vi sinh vật.

Không có ranh giới tuyệt đối giữa các loại hình dinh dưỡng của vi sinh vật. Vi sinh vật dị dưỡng không phải tuyệt đối không sử dụng được CO2 mà chỉ là không thể dùng CO2 làm nguồn carbon duy nhất hay chủ yếu để sinh trưởng. Trong điều kiện tồn tại chất hữu cơ, chúng vẫn có thể đồng hóa CO2 để tạo ra tế bào chất. Tương tự như vậy, vi sinh vật tự dưỡng không phải là không có thể sử dụng chất hữu cơ để sinh trưởng. Ngoài ra, một số vi sinh vật có thể thay đổi loại hình dinh dưỡng khi sinh trưởng trong những điều kiện khác nhau. Ví dụ vi khuẩn phi lưu huỳnh màu tía (purple nonsulfur bacteria) khi không có chất hữu cơ có thể đồng hóa CO2 và thuộc loại vi sinh vật tự dưỡng; nhưng khi có chất hữu cơ tồn tại thì chúng lại có thể sử dụng chất hữu cơ để sinh trưởng và lúc đó chúng là các vi sinh vật dị dưỡng. Hơn nữa, vi khuẩn phi lưu huỳnh màu tía trong điều kiện kỵ khí và có chiếu sáng có thể sinh trưởng nhờ năng lượng của ánh sáng và thuộc loại dinh dưỡng quang năng; nhưng trong điều kiện hiếu khí và không chiếu sáng thì chúng lậi sinh trưởng nhờ năng lượng sinh ra từ quá trình oxy hóa chất hữu cơ và thuộc loại dinh dưỡng hóa năng. Tính biến đổi loại hình dinh dưỡng ở vi sinh vật rõ ràng là có lợi cho việc nâng cao năng lực thích ứng của chúng đối với sự biến đổi của điều kiện môi trường.

13.3. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY (Culture medium)

Môi trường nuôi cấy là các cơ chất dinh dưỡng được pha chế nhân tạo nhằm đáp ứng cho yêu cầu sinh trưởng, phát triển và sản sinh các sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật. Môi trường dinh dưỡng dùng trong nghiên cứu vi sinh vật và trong quá trình sản xuất các sản phẩm của vi sinh vật. Môi trường dinh dưỡng là yếu tố quan trọng trong công nghiệp lên men, công nghiệp sinh tổng hợp nhờ vi sinh vật.

13.3.1. Nguyên tắc pha chế môi trường nuôi cấy

1) Chọn các chất dinh dưỡng thích hợp: Nói chung môi trường dinh dưỡng cần đáp ứng các nhu cầu của vi sinh vật về nguồn C, nguồn N, nguồn muối khoáng, nguồn nhân tố sinh trưởng và nước. Vì loại hình dinh dưỡng của vi sinh vật là phức tạp, các vi sinh vật khác nhau có những yêu cầu không giống nhau về các chất dinh dưỡng cho nên có rất nhiều công thức pha chế môi trường nuôi cấy. "Sách Danh lục môi trường nuôi cấy" (A Compilation of Culture Media) xuất bản từ năm 1930 cũng đã ghi tới trên 2500 loại môi trường nuôi cấy khác nhau.

Môi trường nuôi cấy vi sinh vật tự dưỡng hoàn toàn pha chế từ các hợp chất vô cơ. Ví dụ để nuôi cấy vi khuẩn Thiobacillus thiooxidans gồm có các thành phần như sau (g/l): (NH4)2SO4 -0.4; MgSO4.7H2O - 0,5; FeSO4 - 0,01; KH2PO4 - 4; CaCl2 - 0,25; S- 10; pH: 7,0, khử trùng ở 121° C trong 20 phút. Các vi khuẩn này sử dụng CO2 trong không khí (hay hòa tan trong nước) để cung cấp nguồn carbon. Với các vi sinh vật tự dưỡng quang năng ngoài việc cung cấp các chất dinh dưỡng cần tiết còn cần chiếu sáng để cung cấp năng lượng cho chúng. Đối với vi sinh vật dị dưỡng cần cung cấp chất hữu cơ và nhu cầu dinh dưỡng của các nhóm khác nhau là rất khác nhau. Để nuôi cấy vi khuẩn Escherichia coli có thể dùng môi trường khá đơn giản sau đây (g/l): Glucose - 5; NH4H2PO4- 1; MgSO4.7H2O - 0,2; K2HPO4 - 1; NaCl - 5; pH: 7,0-7,2, khử trùng ở 112° C trong 30 phút. Nhưng cũngcó những vi khuẩn dị dưỡng yêu cầu những môi trường nuôi cấy rất phức tạp. Ví dụ vi khuẩn Lactobacillus bifidus cần môi trường sau đây (trong 1 lít môi trường đậm đặc gấp đôi) : K2HPO4 - 5g; Na-Acetat - 50g; NZ Case Peptone- 10g; Lactose- 70g; Alanin, Cystin, Tryptophan- mỗi loại 0,4g; Asparagin- 0,2g; Xanthin, Adenin, Guanin, Uracin - mỗi loại 0,02g; Dung dịch Muối B- 10ml; Pyridoxin-HCl - 2,4mg ; Tiamin-HCl - 0,4mg; Riboflavin- 0,4mg; Acid nicotinic- 1,2mg; Ca-Pentotenat - 0,8mg ; Biotin- 8,0 mcg (microgram); Acid folic- 20 mcg; Acid p-aminobenzoic- 20 mcg; Tween 80 - 1g. Điều chỉnh pH đến 6,8. Thêm bằng thao tác vô trùng 100ml dung dịch Acid ascorbic 1% đã lọc qua nến lọc vi khuẩn. Điều chỉnh đến pH 6,5. Lại thêm bằng thao tác vô trùng Sữa người đã loại kem sao cho nồng độ đạt được là 2%. Dung dịch Muối B có thành phần như sau (g/l): MgSO4.7H2O-10; FeSO4.7H2O-0,5; NaCl-0,5; MnSO4.2H2O- 0,337.

Thông thường để thay cho các nhân tố sinh trưởng người ta thường dùng Peptone (thay cho từng aminoacid) và cao nấm men (thay cho các nhân tố sinh trưởng). Môi trường thường dùng để nuôi cấy các vi khuẩn dị dưỡng là Môi trường Cao thịt-Pepton với thành phần như sau (g/l): Cao thịt (Beef extract) - 5; Peptone- 10; NaCl- 5; pH: 7,0-7,2; khử trùng ở 121° C trong 20 phút. Môi trường để nuôi cấy vi khuẩn Brevibacterium spp. có thành phần như sau (g/l): Cao nấm men (Yeast extract)-10; Glucose- 20; CaCO3 - 20.

Người ta chia môi trường nuôi cấy thành nhiều loại khác nhau.

• Căn cứ vào thành phần môi trường ta có: môi trường thiên nhiên, môi trường tổng hơp.

Môi trường thiên nhiên (complex medium): đây là loại môi trường chứa các chất hữu cơ thiên nhiên không biết rõ thành phần hóa học hoặc thành phần hóa học không ổn định, vì vậy còn được gọi là môi trường không xác định về hóa học (chemically undefined medium). Các môi trường Cao thịt-Pepton, môi trường Mạch nha, môi trường LB (Luria-Bertani) là các ví dụ của loại môi trường này. Thành phần của môi trường LB là như sau (g/l): Peptone - 10; Cao nấm men - 5; NaCl -10; pH: 7,0; khử trùng ở 1210C trong 21 phút. Cao thịt là nước chiết thịt được cô đặc lại. Cao thịt chứa các chất đạm hữu cơ, đường, vitamin, muối khoáng- tất cả đều dễ tan trong nước. Peptone là dạng thủy phân bằng protease hay bằng acid đối với thịt, casein, gelatin sau đó làm khô lại thành dạng bột. Peptone chứa phong phú các chất đạm hữu cơ, cũng có một số vitamin và đường. Cao nấm men là dịch tự phân (autolysate) tế bào nấm men được cô đặc lại. Cao nấm men chứa phong phú vitamin nhóm B, cũng có chứa các chất đạm hữu cơ và đường.

Ngoài các loại nói trên môi trường thiên nhiên còn được chế tạo từ các nguyên liệu khác như nước chiết khoai tây, nước chiết giá đậu, nước chiết đất, nước chiết rơm rạ, nước chiết lông vũ bột ngô, cám gạo, sữa, huyết thanh, nước ép cà rốt, nước dừa. Vi sinh vật ưa phân (coprophilous microorganisms) có thể dùng nước phân làm chất dinh dưỡng. Giá thành của môi trường thiên nhiên thường thấp, cho nên không chỉ được sử dụng trong phòng thí nghiệm mà còn có thể được sử dụng trong các xí nghiệp lên men công nghiệp.

Bảng 13.17: Thành phần một số loại peptone và dịch thủy phân protein

Chế phẩm(CP) Phản ứng Biure Các thành phần (% trong protein)

(1) (2) (3)

Peptone Pharmacon + 63.5 9.7 27.8

Peptone Vitte + 44.1 26.7 29.2

Peptone Canbaum + 40.2 27.4 32.4

Peptone Gee + 44.5 23.2 32.3

Peptone Roche + 25.3 11.7 63.0

CP thủy phân nhờ pepsin + 42.1 25.2 32.7

CP thủy phân nhờ trypsin + 2.0 14.9 82.1

Dịch thủy phân gluten - 0 0 100

Dịch thủy phân gelatin - 0 0 100

Chú thích:

(1)- Các polypeptid cao phân tử được kết tủa bằng tannin khi có mặt 2% H2SO4.

(2)- Các polypeptid được kết tủa bằng tannin khi môi trường có phản ứng trung tính.

(3)- Các aminoacid tự do và các peptid không bị ết tủa bởi tannin.

Môi trường tổng hợp (synthetic medium): đây là loại môi trường có thành phần hóa học được biết rõ cho nên còn được gọi là môi trường xác định về hóa học (chemically defined medium). Ví dụ môi trường Gause thích hợp cho Xạ khuẩn với thành phần như sau (g/l): Tinh bột tan - 20; KNO3 - 1; NaCl - 0,5; K2HPO4 .3H2O - 0,5; K2HPO4 .3H2O - 0,5; FeSO4 .7H2O- 0,01, pH: 7,2-7,4; khử trùng ở 1210C trong 21 phút. Môi trường tổng hợp có giá thành cao và trên loại môi trường này vi sinh vật phát triển tương đối chậm, nói chung thích hợp sử dụng trong phạm vi phòng thí nghiệm.

Có những vi khuẩn đòi hỏi các môi trường tổng hợp khá đơn giản, chẳng hạn như vi khuẩn Escherichia coli với môi trường sau đây: K2HPO4-7,0g; KH2PO4-2,0g; (NH4)2SO4-1,0g; MgSO4-0,1g; CaCl2-0,02g; Glucose-4-10g; Nguyên tố vi lượng (Fe,Co,Mn,Zn,Cu,Ni,Mo)-mỗi loại 2-10μg; Nước cất- 1000ml.

Escherichia coli

Có những vi sinh vật đòi hỏi các môi trường tổng hợp rất phức tạp (và đắt tiền). Sau đây là ví dụ về môi trường tổng hợp dùng để nuôi cấy vi tảo Euglena: acid glutamic-6g; acid aspartic-4g; Glycine-5g; Sacchaose-30g; Acid malic-1,04g; Acid boric-1,14mg; Thiamine HCl-12mg; KH2PO4- 0,6g; MgSO4-0,8g; CaCO3-0,16g; (NH4)2CO3- 0,72g; FeCl3-60mg; ZnSO4- 40mg; MnSO4-6mg; CuSO4- 0,62mg; CoSO4- 5mg ; (NH4)2MoO4- 1,34mg; Nước 1000ml.

Một ví dụ khác về môi trường tổng hợp để nuôi cấy vi khuẩn Leuconostoc mesenteroides: K2HPO4- 0,6g; KH2PO4- 0,6g; NH4Cl- 3g; MgSO4- 0,1g; Glucose- 25g; Na acetate- 20g; Các amino acid- mỗi loại 100-200μg (gồm có alanine, arginine, asparagine, aspartate, cysteine, glutamate, glutamine, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophane, tyrosine, valine); Purinevaf Pyrimidine - mỗi loại 10mg (gồm có adenine, guanine, uracil,xanthine); Vitamin- mỗi loại 0,01-1mg (gồm có biotin, folate, nicotinic acid, pyridoxal, pyridoxamine, pyridoxine, ribolavine, thiamine, pantothenate, para-aminobenzoic acid). Nguyên tố vi lượng - mỗi loại 2-10μg; Nước cất- 1000ml.

• Căn cứ vào trạng thái của môi trường người ta chia ra thành môi trường đăc, môi trường bán đặc và môi trường dịch thể.

Môi trường đặc (solid medium): đây là loại môi trường được làm đông đặc lại nhờ có bổ sung thêm thạch (agar-agar), gelatin hay silica gel. Môi trường đặc phải đảm bảo được các yêu cầu sau đây:

- Không bị vi sinh vật nuôi cấy sử dụng.

Rau câu chỉ vàng

-Giữ được trạng thái đặc trong nhiệt độ nuôi cấy vi sinh vật. Dễ hòa tan khi đun nóng (thường được điều chỉnh bằng lượng chứa chất làm đặc trong môi trường)

-Nhiệt độ để làm đặc môi trường không quá thấp.

-Chất làm đặc môi trường không có hại đôi với vi sinh vật

-Chất làm đặc không bị phá hủy khi khử trùng môi trường

-Giữ được trạng thái trong suốt của môi trường.

-Giá thành không quá cao, pha chế môi trường dễ dàng.

Thạch là sản phẩm chế tạo từ Rau câu chỉ vàng (Gracilaria verucosa) hay các tảo biển khác thuộc chi Gracilaria hay Gelidium. Thạch có chứa khoảng 70% agarose và khoảng 30% agaropectin. Để làm tan thạch cần đun môi trường đến 1000 C và để làm giữ môi trường thạch ở trạng thái lỏng cần giữ ở nhiệt độ khoảng 50-600C (trong nồi cách thủy). Để làm cho môi trường đặc lại cần hạ nhiệt độ xuống 40-450C. Tùy chất lượng của thạch mà khi làm môi trường người ta cho vào với tỷ lệ 15-20g/l. Khi cần nuôi cấy vi sinh vật trên các môi trường thạch có pH từ 6 trở xuống thì cần điều chỉnh môi trường tới pH trung tính trước khi khử trùng, sau đó mới điều chỉnh lại đến pH thích hợp (nếu không thạch có bị thủy phân trong điều kiện pH thấp và ở nhiệt độ cao).

Hình 13.4: Robert Koch (1843-1910)

Hình 13.5: Fannie Eilshemius (1850-1934) và Walther Hesse (1846-1911)

Người đầu tiên nghĩ đến sử dụng môi trường đặc trong nghiên cứu vi sinh vật là Robert Koch khi tình cờ thấy các khuẩn lạc của vi khuẩn trên củ khoai tây và ông đã dùng các lát khoai tây để làm môi trường phân lập vi khuẩn vào năm 1881. Người đầu tiên dùng gelatin để chế tạo môi trường đặc cũng vào năm này là một trợ lý của Koch, ông Frederick Loeffler. Việc dùng thạch để làm chất đông đặc là do cô Minora Tarazaemon phát hiện; khi nấu thức ăn với tảo biển và khi để nguội cô thấy thức ăn đông đặc lại (1882). Người đầu tiên dùng thạch thay thế gelatin trong môi trường nuôi cấy là vợ của Walther Hess (một trợ lý khác của Koch) - bà Fannie Eilshemius Hess.

Sau đây là vài đặc điểm chủ yếu của Thạch và Gelatin:

Đặc điểm Thạch Gelatin

Nồng độ thường dùng (%) 1,5-2,0 5-12

Nhiệt độ hòa tan (0C) 96 25

Nhiệt độ đông (0C) 40 20

pH Hơi acid Acid

Chất khoáng (%) 16 14-15

CaO (%) 1,15 0

MgO (%) 0,77 0

N (%) 0,4 18,3

Vi sinh vật có thể sử

dụng làm chất dinh dưỡng Tuyệt đại đa số không sử dụng Nhiều vi sinh vật có thể sử dụng

Môi trường bán đặc (semisolid medium):

Môi trường bán đặc là môi trường chỉ chứa 0,2-0,7% thạch và thường được sử dụng để quan sát khả năng di động của vi sinh vật, quan sát hiệu giá thực khuẩn thể (phage)...

Môi trường dịch thể (liquid medium):

Môi trường dịch thể hay môi trường lỏng là các môi trường không bổ sung các chấy làm đông đặc môi trường. Để thông khí phải dùng tới máy lắc hay các nồi lên men có hệ thống thổi khí vô trùng (vô khuẩn) và hệ thống khuấy đảo làm tan đều bọt khí. Môi trường dịch thể ngoài việc sử dụng trong nghiên cứu tại phòng thí nghiệm còn được sử dụng rộng rãi trong sản xuất lớn tại các nhà máy lên men công nghiệp.

- Căn cứ vào mục đích sử dụng người ta chia môi trường nuôi cấy thành nhiều loại khác nhau

Môi trường cơ sở (minimum medium): Các vi sinh vật tuy có yêu cầu dinh dưỡng không giống nhau nhưng nói chung về cơ bản thì các chất dinh dưỡng là giống nhau. Môi trường cơ sở là môi trường có chứa các chất dinh dưỡng cơ bản cần thiết cho sự sinh trưởng, phát triển của đa số vi sinh vật. Môi trường cơ sở thông dụng là Môi trường cao thịt - peptone. Môi trường cơ sở được dùng làm thành phần cơ bản cho những môi trường đặc biệt, tùy theo yêu cầu của từng nhóm vi sinh vật mà bổ sung thêm các chất dinh dưỡng cần thiết.

Môi trường làm giàu hay còn gọi là môi trường gia phú (enrichment medium): Trên môi trường cơ sở cho thêm một số chất dinh dưỡng đặc biệt để thích hợp với việc nuôi cấy một số nhóm vi sinh vật. Các chất bổ sung thêm có thể là máu, huyết thanh, cao nấm men, mô động vật hay thực vật. Ví dụ để nuôi cấy vi khuẩn Bordetella pertussis người ta dùng môi trường cơ sở Difco 0048 nhưng bổ sung bằng thao tác vô trùng máu thỏ (đã lọc qua nến lọc) sau khi đã khử trùng môi trường 15 phút ở 1210C, sao cho nồng độ cuối là 15%.

Bordetella pertussis

Môi trường giám biệt (differential medium)

Môi trường giám biệt dùng trong việc giám định các loài vi sinh vật khác nhau để xác định vị trí phân loại của chúng. Các môi trường giám biệt và phương pháp sử dụng đã được trình bày trong Tập I (Thế giới vi sinh vật). Chẳng hạn khi xác định khả năng sinh protease thì bổ sung casein hay gelatin, khả năng sinh amylase thì thêm tinh bột tan, khả năng sinh lipase thì thêm dầu ăn và chỉ thị màu, khả năng sinh H2S thì thêm Pb acetat, ..Người ta thường dùng môi trường EMB (Eosin Methylene Blue) để giám biệt vi khuẩn đường ruột. Môi trường này có thành phần như sau: Peptone-10g; Lactose-5g; Saccharose-5g K2HPO4- 2g; EosinY-0,4g; Methylene Blue-0,065g; Nước cất-1000ml; pH=7,2. Môi trường này ức chế vi khuẩn Gram (+) và một số vi khuẩn Gram (-). Từ môi trường này kiểm tra thêm một vài thí nghiệm với các khuẩn lạc xuất hiện có thể phân lập được nhiều loại vi khuẩn đường ruột Gram (-) theo sơ đồ sau đây:

a- Lên men lactic, sinh acid.

b- Sinh acid mạnh,khuẩn lạc chiếu sáng thấy có màu tía, phản quang có màu lục ánh kim ...Escherichia coli

bb-Sinh acid yếu, khuẩn lạc có màu nâu gụ ...Enterobacter,Serratia, Klebsiella, Hafnia

aa- Không lên men lactic, không sinh acid, khuẩn lạc trong vô màu... Proteus, Salmonella, Shigella.

Môi trường chọn lọc (Selective medium)

Dùng môi trường chọn lọc để phân lập từng nhóm vi sinh vật riêng biệt từ một quần thể vi sinh vật trong tự nhiên. Dựa vào yêu cầu dinh dưỡng đặc biệt của từng nhóm vi sinh vật hoặc tính mẫn cảm khác nhau đối với hóa chất, với chất kháng sinh mà đưa thêm vào môi trường những chất tương thích, nhằm ức chế sự sinh trưởng của các nhóm vi sinh vật khác và giúp cho phân lập được nhóm vi sinh vật cần nghiên cứu. Có những môi trường chọn lọc được thiết kế dựa trên nhu cầu dinh đưỡng đặc biệt của từng nhóm vi sinh vật nhất định. Ví dụ dùng cellulose hay dầu parafin làm nguồn carbon duy nhất khi phân lập nhóm vi sinh vật phân hủy celluose hay phân hủy parafin, dùng protein làm nguồn nitrogen duy nhất để phân lập vi sinh vật sản sinh proteinase, dùng môi trường không chứa nitrogen để phân lập vi sinh vật cố định nitrogen. Ví dụ môi trường vô đạm Ashby dùng để phân lập vi khuẩn Azotobacter có thành phần như sau: Mannit-1%; KH2PO4-0,025%, MgSO4.7H2O-0,02%; NaCl-0,02%; CaSO4.2H2O-0,01%; CaCO3-0,5%.

Cũng có loại môi trường chọn lọc thêm 10% phenol sẽ làm ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn và vi nấm nhưng lại có thể phân lập được xạ khuẩn. Nếu thêm vào môi trường Bi sulphat thì có thể ức chế được các vi khuẩn Gram (+)và phần lớn các vi khuẩn Gram (-), nhưng lại phân lập được vi khuần thương hàn (Salmonella typhi). Thêm vào môi trường Brilliant green hay Crystal violet thì ức chế được vi khuẩn Gram (+) nhưng lại phân lập được vi khuẩn Gram (-). Trêm vào môi trường Streptomycin thì có thể ức chế được nhiều loại vi khuẩn nhưng lại phân lập được vi nấm. Thêm vào môi trường Na propionat có thể ức chế được nấm sợi nhưng lại phân lập được nấm men. Trong Kỹ thuật di truyền (Genetic engineering) người ta thường xuyên sử dụng các môi trường chọn lọc chứa các kháng sinh xác định để tách ra các chủng mang gen tái tổ hợp.

Trong thực tế có những môi trường vừa là môi trường chọn lọc, vừa là môi trường giám biệt. Ví dụ để phân lập tụ cầu khuẩn vàng (Staphylococcus aureus) người ta thêm vào môi trường 7,5% NaCl, Mannit và chỉ thị màu acid-kiềm. Vi khuẩn này vừa chịu được nồng độ NaCl cao , vừa chuyển hóa mannit thành acid.

Staphylococcus aureus

Sau đây là một số chất được bổ sung vào môi trường (MT) chọn lọc khi cần thiết để phân lập một số nhóm vi sinh vật nhất định: Potassium tellurite (MT Mueller tellurite) để phân lập Corynebacterium diphtheriae; Tellurite và Crystal violet (MT Mitis-salivarius) để phân lập Streptococcus; Na azide (MTAzide glucose) để phân lập Streptococcus; Phenylethanol (MT Phenylethanol) để phân lập Staphylococcus và Streptococcus; Nước ép cà chua (MT nước ép cà chua) để phân lập vi khuẩn lactic từ nước bọt; Desoxycholate, citrate (MT Desoxycholate citrate) để phân lập vi khuẩn đường ruột Gram(-); Mật(bile),citrate, brilliant green (MT SS) để phân lập Salmonella và Shigella; Malachite green dye (MT Lowenstein-Jensen) để phân lập Mycobacterium; Chloramphenicol (MT Emmon) để phân lập nấm; Rose Bengal và Streptomycin (MT Martin) để phân lập nấm...

Corynebacterium diphtheriae

Ngoài các loại môi trường kể trên còn có các loại môi trường đặc biệt khác. Đó là Môi trường phân tích (assay medium) dùng để định lượng vitamin, chất kháng sinh... Đó là Môi trường khử (reduced medium) dùng để nuôi cấy các vi sinh vật kỵ khí. Đó là Môi trường nuôi cấy mô (Tissue-culture medium) chuyên phục vụ cho việc nuôi cấy tế bào và mô động, thực vật, hoặc dùng để nuôi cấy trên tế bào các nhóm vi sinh vật chuyên ký sinh như virút, Chlamydia, Rickettsia, Spirochete. Một số virút và Rickettsia không phát triển được trên các môi trường nhân tạo mà phải nuôi cấy trên phôi gà, trên tế bào thận khỉ, trên cơ thể động vật thực nghiệm.

Dưới đây là một vài gợi ý quan trọng khi chuẩn bị môi trường nuôi cấy.

Rất nhiều đường dễ bị phân giải trong quá trình khử trùng ở pH kiềm (đặc biệt với sự có mặt của photsphate và peptone), làm cho màu môi trường chuyển thành màu nâu và các sản phẩm tạo thành có thể ức chế sự sinh trưởng của vi sinh vật. Để tránh tình trạng đó, người ta khử trùng ở môi trường pH acid nhẹ hoặc khử trùng riêng biệt đối với đường.

Tất cả các kim loại vi lượng dễ dàng tạo nên muối photphat không tan và kết tủa trong môi trường nuôi cấy. Điều này có thể được tránh bằng cách bổ sung thêm các nhân tố có ái lực với kim loại (metal-chelating agents) như là EDTA (Ethylene Diamine Tetraacetic Acid) hay NTA (Nitrilotriacetic acid) hay đôi khi là các axit cacboxylic như citrate hay tartrate. Việc thêm các nhân tố này có hiệu quả hai mặt. Một mặt, nó ngăn chặn sự kết tủa của các kim loại vi lượng, mặt khác nó hoạt động giống như một bể chứa các kim loại đó, bằng cách này có thể làm giảm tính độc nhờ giảm nồng độ tự do của chúng (tới mức mà các vi sinh vật có thể sử dụng được).

Ở môi trường pH >7, các kim loại kiềm thổ Ca và Mg (dưới dạng vi lượng) dễ dàng kết tủa với sự hiện diện của photphate (hay sự có mặt của ion carbonate khi sử dụng môi trường đệm là bicarbonat, hay có sẵn trong nước cứng) tạo nên hàm lượng muối không tan cao. Những kết tủa này đôi khi khó thấy bằng mắt thường, đặc biệt trong các bình nuôi cấy lắc do thể tích nhỏ của môi trường. Để tránh điều này, môi trường có thế được khử trùng ở pH hơi axit (pH được điều chỉnh sau), hay muối photphat được khử trùng riêng rẽ với môi trường và kết hợp sau khi đã làm nguội.

Cần chú ý rằng đa số các môi trường cổ điển sử dụng trước những năm 60 của thế kỷ trước thường không bao gồm các nguyên tố vi lượng. Sự thêm vào thường là không cần thiết bởi vì các nguyên tố vi lượng đã có chứa sẵn trong các muối không tinh sạch được sử dụng để chuẩn bị cho môi trường. Môi trường hiện nay được chuẩn bị với các muối tinh sạch cao nên không đáng ngạc nhiên là sẽ thất bại trong việc tạo ra nhiều sinh khối sản phẩm nếu không được bổ sung các nguyên tố vi lượng vào trong môi trường. Một ví dụ điển hình là môi trường cổ điển M9 được sử dụng rất rộng rãi cho sự sinh trưởng của E.coli trong các nghiên cứu di truyền. Môi trường này không cung cấp thuận lợi các nguyên tố vi lượng cho sự phát triển của E.coli trong một vài thế hệ, sau đó chúng sinh truởng chậm lại và cuối cùng là ngừng lại.

4. SỰ HẤP THU CÁC CHẤT DINH DƯỠNG Ở VI SINH VẬT

Để tồn tại, sinh trưởng và phát triển, tế bào vi sinh vật phải thường xuyên trao đổi vật chất và năng lượng với môi trường bên ngoài. Một mặt chúng tiếp nhận các chất dinh dưỡng từ môi trường, mặt khác chúng thải ra môi trường một số sản phẩm trao đổi chất. Tế bào vi sinh vật sử dụng các chất dinh dưỡng bắt đầu từ việc hấp thu chúng. Cơ chế của sự hấp thu này có tính chuyên hóa, nói cách khác chúng chỉ hấp thu các chất cần thiết, việc hấp thu các chất không sử dụng được là bất lợi đối với tế bào. Vi sinh vật thường sống trong các môi trường nghèo chất dinh dưỡng, do đó chúng phải có năng lực vận chuyển chất dinh dưỡng từ môi trường có nồng độ thấp vào môi trường có nồng độ cao bên trong tế bào, tức là ngược lại với gradient nồng độ. Như thế là giữa trong và ngoài tế bào có một hàng rào thẩm thấu, đó là màng sinh chất có tính thẩm thấu chọn lọc. Chúng cho phép các chất dinh dưỡng xâm nhập vào tế bào và cản trở các chất khác. Do tính đa dạng và phức tạp của các chất dinh dưỡng nên vi sinh vật có nhiều phương thức khác nhau để vận chuyển các chất dinh dưỡng. Quan trọng nhất là cách Khuếch tán xúc tiến (Facilitated diffusion), cách Vận chuyển chủ động (Active transport) và cách Chuyển vị nhóm (Group translocation). Ở các vi sinh vật có nhân thật không thấy có cách Chuyển vị nhóm nhưng có cách sử dụng quá trình Nhập bào (Endocytosis).Cấu tạo của màng sinh chất được biểu thị qua hình 13.6 sau đây:

Hình 13.6: Cấu trúc của màng sinh chất (Theo sách của Prescott, Harley và Klein).

13.4.1. Sự khuếch tán xúc tiến (Facilitated Diffusion)

Một số ít các chất, như glycerol, có thể đi qua màng tế bào chất theo phương thức Khuyếch tán bị động (Passive diffusion). Khuyếch tán bị động còn được gọi tắt là Khuyếch tán, đó là việc các chất dinh đưỡng chuyển từ chỗ có nồng độ cao đến chỗ có nồng độ thấp. Khuyếch tán bị động muốn làm cho tế bào hấp thụ có hiệu quả một số chất dinh dưỡng cần có nồng độ chất này bên ngoài tế bào cao hơn bên trong. Tốc độ hấp thu tùy theo lúc tế bào tăng lượng hấp thu chất này mà giảm xuống. Trừ phi loại chất dinh dưỡng này sau khi xâm nhập tế bào lập tức được sử dụng và không làm nâng cao nồng độ chất đó trong tế bào. Chỉ có nước (H2O), O2 và CO2, là những phân tử rất nhỏ mới thường được vận chuyển qua màng bằng phương thức khuếch tấn bị động. Các phân tử tương đối lớn hơn, các ion và các chất có tính cực (polar substances) khó có thể đi qua màng sinh chất băng phương thức khuếch tán bị động.

Hình 13.7: Khuếch tán bị động (đường thẳng) và khuếch tán xúc tiến (đường cong)

(Theo sách của Prescott, Harley và Klein).

Protein mang (carrier protein) còn gọi là enzim permease là một loại protein gắn trên màng. Với sự hỗ trợ của permease có thể nâng cao rất nhiều tốc độ khuếch tán qua màng có tính thẩm thấu chọn lọc. Phương thức vận chuyển qua màng với sự hỗ trợ của permease được gọi là sự khuếch tán xúc tiến (facilitated diffusion). Tốc độ của quá trình khuếch tán xúc tiến tăng lên khi sự chênh lệch nồng độ chất dinh dưỡng giữa trong và ngoài tế bào tăng lên. Khi nồng độ các chất dinh dưỡng tương đối thấp thì khuôn khổ tăng lên cao hơn so với phương thức khuếch tán bị động. Lúc gradient nồng độ đạt tới một trị số nhất định thì dẫn đến hiệu ứng bão hòa. Sự tham gia của Permease đã làm dẫn đến hiệu ứng bão hòa (hình 13.7)

Đáng chú ý là, lúc permease bị bão hòa, sự khuếch tán xúc tiến không tăng lên do sự tăng mức chênh lệch chất dinh dưỡng trong và ngoài tế bào. Quan hệ giữa tốc độ khuếch tán xúc tiến và gradient nồng độ chất dinh dưỡng tưong tự như mối quan hệ giữa enzyme và cơ chất, và khác hẳn với đường biểu diễn thẳng phản ánh sự khuếch tán bị động. Ngoài ra sự giống nhau giữa permease và enzyme còn ở chỗ có tính chuyên nhất đối với chất vận chuyển, mỗi loại permease chỉ có thể vận chuyển một cách chọn lọc đối với một số chất tương thích. Dù có sự tham gia của permease nhưng khuếch tán xúc tiến vẫn đúng là phương thức vận chuyển khuếch tán. Việc vận chuyển vẫn phải dựa vào sự chênh lệch nồng độ chất dinh dưỡng giữa trong và ngoài màng. Khi mất đi sự chênh lệch nồng độ sự vận chuyển sẽ dừng lại. Quá trình này không cần tới năng lượng trao đổi chất (metabolic energy) của tế bào. Gradient nồng độ có thể duy trì khi tế bào chuyển biến chất dinh dưỡng được vận chuyển thành một hợp chất khác hoặc chuyển chất dinh dưỡng đó tới một vị trí khác của màng (ở sinh vật có nhân thật). Thật thú vị khi thấy một số permease này liên quan đến protein chủ chốt của thấu kính mắt ở động vật có vú, đó là các protein thuộc họ MIP. Trong vi khuẩn 2 loại kênh MIP phân bố rộng rãi nhất là aquaporins vận chuyển nước và glycerol facilitators (các nhân tố xúc tiến glycerol) vận chuyển glycerol.

Mặc dầu đã có rất nhiều nghiên cứu đối với cơ chế khuếch tán xúc tiến nhưng quá trình này vẫn chưa được hiểu biết một cách đầy đủ. Hình như phức hợp permease xuyên ngang qua màng tế bào. Sau khi chất dinh dưỡng được kết gắn bên ngoài màng, cấu hình của permease phát sinh biến hóa để phóng thích được chất dinh dưỡng vào bên trong màng. Permease sau đó lại hồi phục lại cấu hình ban đầu và sẵn sàng để đón nhận phân tử dinh dưỡng khác bên ngoài màng. Kết quả của quá trình này là một phân tử không tan trong lipid có thể đi vào tế bào đáp lại gradient nồng độ của nó. Nên nhớ rằng, cơ chế này có thể đảo ngược bởi gradient nồng độ, nếu nồng độ một số vật chất trong tế bào cao hơn bên ngoài thì cũng có thể thông qua phương thức này mà chuyển vận ra ngoài tế bào. Vì thông qua hoạt động trao đổi chất mà tế bào tiêu hao rất nhanh các chất dinh dưỡng đưa vào tế bào nên không có chuyện chất dinh dưỡng bị đưa ngược ra ngoài (hình 13.8).

Ở các sinh vật nhân nguyên thủy quá trình khuếch tán xúc tiến không phải là phương thức vận chuyển chủ yếu vì nồng độ chất dinh dưỡng bên ngoài tế bào thường rất thấp cho nên không thể thực hiện được quá trình khuếch tán xúc tiến để hấp thụ chất dinh dưỡng. Glycerol được vận chuyển bởi quá trình khuếch tán xúc tiến ở E.coli, Salmonella typhimurum, Pseudomonas, Bacillus và nhiều vi khuẩn khác. Sự khuếch tán xúc tiến thường gặp ở tế bào sinh vật nhân thực, chúng dùng phương thức vận chuyển này để chuyển vận các loại đường và amino acid vào tế bào.

Hình 13.8. Một kiểu Khuếch tán xúc tiến (Theo sách của Prescott, Harley và Klein)

13.4.2. Sự vận chuyển chủ động (Active Transport)

Mặc dầu sự khuếch tán xúc tiến giúp chuyển vận có hiệu quả chất dinh dưỡng vào bên trong tế bào khi nồng độ chất hòa tan bên ngoài cao hơn bên trong tế bào, nhưng không thể vận chuyển được chất dinh dưỡng khi nồng độ chất hòa tan trong tế bào cao hơn bên ngoài. Vi sinh vật thường sống trong các môi trường có nồng độ chất dinh dưỡng rất thấp, để có thể sinh trưởng và phát triển chúng phải có thể vận chuyển và hấp thu được từ môi trường các chất dinh dưỡng có nồng độ thấp. Khi đó khuếch tán xúc tiến không còn là phương thức vận chuyển hữu hiệu nữa mà phải có những phương thức vận chuyển khác, trong đó quan trọng nhất là phương thức vận chuyển chủ động (active transpore) và phương thức chuyển vị nhóm (group translocation); cả hai phương thức này đều cần tới năng lượng.

Sự vận chuyển chủ động là loại phương thức vận chuyển các phân tử chất hòa tan tới nơi có nồng độ cao hơn, tức là ngược lại với gradient nồng độ và cần phải tiêu hao năng lượng. Vì sự vận chuyển chủ động cần tới các protein mang (permease) nên tương tự với sự khuếch tán xúc tiến trong một số phương diện. Permease có tính chuyên nhất cao đối với các phân tử được vận chuyển. Các phân tử chất hòa tan có tính chất tương tự có thể lên kết với permease trong cả hai trường hợp - khuếch tán xúc tiến và vận chuyển chủ động. Trong trường hợp nồng độ các chất dinh dưỡng khá cao sự vận chuyển chủ động cũng có hiệu ứng bão hòa (hình 13.9). Tuy nhiên, sự khác nhau lớn nhất giữa hai loại này là vận chuyển chủ động có thể vận chuyển ngược nồng độ nhưng cần tiêu hao năng lượng trao đổi chất. Các chất ức chế trao đổi chất có thể làm trở ngại việc sản sinh năng lượng do đó làm ức chế sự vận chuyển chủ động, nhưng không làm ảnh hưởng đến quá trình khuếch tán xúc tiến (ngay cả trong thời gian ngắn).

Vi khuẩn, cổ khuẩn và các vi sinh vật nhân thật có các hệ thống vận chuyển protein kết hợp (Binding protein transport systems) hoặc protein vận chuyển hình hộp kết hợp với ATP (ATP-binding cassette transporters) hay còn gọi là protein vận chuyển ABC (ABC transporter). Loại protein vận chuyển này thường được tạo thành một phức thể nhờ sự kết hợp giữa hai vùng xuyên màng ưa nước (hydrophobic membrane - spanning domain) trên bề mặt tế bào chất và hai vùng gắn với nucleotide (hình 13.9).

Hình 13.9: Công năng của protein vận chuyển hình hộp có khả năng kết hợp với ATP (Theo sách của Prescott, Harley và Klein)

(1)=Protein mang chất hòa tan được gắn với cơ chất vận chuyển và hướng đến phức chất protein vận chuyển ABC

(2)=Protein mang chất hòa tan gắn vào protein vận chuyển và phóng thích cơ chất, chuyển qua màng nhờ năng lượng của sự thủy phân ATP

Vùng xuyên màng hình thành một lỗ nhỏ trong màng và vùng kết hợp nucleotide sẽ gắn với ATP rồi thủy phân ATP để hấp thụ chất hòa tan. Protein vận chuyển ABC tận dụng protein liên kết cơ chất chuyên biệt nằm trên khe chu chất của vi khuẩn Gram âm hoặc bám trên màng lipid tại mặt ngoài của màng sinh chất ở vi khuẩn Gram dương. Các protein liên kết này (cũng tham gia vào quá trình hóa hướng động-chemotaxis) sẽ gắn với phân tử được vận chuyển, rồi tương tác với protein vận chuyển màng để chuyển phân tử hòa tan vào trong tế bào. Vi khuẩn E.coli đã dùng cơ chế này để vận chuyển nhiều loại đường (arabinose, maltose, galactose, ribose) và aminoacid (glutamate, histidine, leucine).

Các chất đưa vào vi khuẩn Gram (+) phải đi qua màng ngoài trước khi phát huy tác dụng của protein vận chuyển ABC và các hệ thống vận chuyển chủ động khác. Các phân tử ngỏ có thể sử dụng một protein lỗ phổ biến như OmpF. Các phân tử lớn hơn phải dùng tới các protein lỗ màng chuyên biệt. Trong một số trường hợp, ví dụ việc hấp thu sắt và vitamin B12 phải dùng tới các protein vận chuyển và protein tiếp nhận màng ngoài có ái lực cao chuyên biệt.

Đáng chú ý là protein vận chuyển ABC ở sinh vật nhân thật nhiều khi có tầm quan trọng lớn trong y học. Một số tế bào ung thư sử dụng các protein vận chuyển này để bơm thuốc ra. Việc xơ hóa nang là kết quả của một đột biến làm bất hoạt một protein vận chuyển ABC đối với chuỗi chuyển ion chloride trong phổi.

Vi khuẩn cũng dùng gradient proton phát sinh ra khi chuyển vận điện tử để thúc đẩy sự vận chuyển chủ động. Các protein vận chuyển màng chịu trách nhiệmđối với quá trình này thiếu hụt các protein liên kết chu chất chuyên biệt để kết hợp với các chất dinh dưỡng. Lactose permease ở vi khuẩn E.coli là một ví dụ điển hình. Permease này là một protein đơn có phân tử lượng khoảng 30 000. Nó vận chuyển phân tử lactose khi có một proton xâm nhập tế bào (nồng độ proton cao bên ngoài tế bào là do hoạt động của chuỗi chuyển vận điện tử). Sự vận chuyển liên kết của hai cơ chất theo cùng một hướng được gọi là vận chuyển đồng hướng (symport). Trong quá trình này năng lượng tích tụ trong gradient proton được huy động để vận chuyển vật chất. Mặc dầu cơ chế của phương thức vận chuyển này còn chưa được hiểu biết đầy đủ nhưng nói chung được cho rằng proton và permease sau khi kết hợp sẽ cải biến hình dạng và ái lực hấp thụ chất dinh dưỡng. Vi khuẩn E.coli cũng dùng sự vận chuyển đồng hướng với proton để vận chuyển aminoacid và các acid hữu cơ như succinate và malate.

Một gradient proton cũng có thể thông qua việc hình thành một gradient ion natri để gián tiếp tác động lên sự vận chuyển chủ động (hình 13.10).

Các chất vận chuyển được chuyển xuyên màng theo phương hướng tương phản như vậy được gọi là vận chuyển ngược hướng (antiport). Gradient natri sinh ra trong ngoài tế bào do hệ thống vận chuyển proton ngược hướng này sẽ có thể dẫn đến việc hấp thu đường và acid amin vào tế bào. Một ion natri có thể liên kết với một protein mang và gây ra sự biến đổi hình dạng. Protein mang sẽ kết hợp mật thiết với đường hay acid amin và định hướng chúng chuyển vào bên trong tế bào. Do nồng độ natri trong tế bào thấp, ion natri có thể tách rời ra khỏi protein mang và chất dinh dưỡng được vận chuyển cũng được tách ra theo. Cùng với việc ion natri di động vào tế bào vi khuẩn E.coli thì protein mang cũng sẽ chuyển đường melibiose và acid amin glutamate vào tế bào này.

Hình 13.10: Tác dụng của gradient proton và natri trong vận chuyển chủ động (Theo sách của Prescott, Harley và Klein).

1- Proton bơm ra ngoài màng sinh chất khi vận chuyển điện tử

2-Gradient proton thông qua cơ chế vận chuyển ngược hướng (antiport mechanism) đẻ đẩy ion natri ra ngoài

3- Ion natri liên kết với phức hợp protein mang (carrier protein complex)

4-Điểm kết hợp với chất hòa tan (dung chất) biến đổi hình dạng và gắn với dung chất (đường hoặc aminoacid)

5-Cấu hình của protein mang (carrier) thay đổi, ion natri được chuyển vào trong tế bào và sau đó dung chất cũng rời khỏi protein mang

Sự vận chuyển đồng hướng (symport) hay vận chuyển hiệp đồng (cotransport) natri cũng là một quá trình quan trọng ở các tế bào nhân thật (eucaryotic) khi hấp thu đường và acid amin. Nhưng gradient ion natri thường sinh ra do việc thủy phân ATP chứ không phải do lực chuyển động của proton.

Vi sinh vật thường thông qua nhiều hệ thống vận chuyển để hấp thu một chất dinh dưỡng. Ví dụ như ở vi khuẩn E.coli, ít nhất cũng có tới 5 hệ thống vận chuyển để hấp thu đường galactose, 3 hệ thống vận chuyển để hấp thu glutamate và leucin, 2 hệ thống vận chuyển để hấp thu ion kali. Khi có nhiều hệ thống vận chuyển như vậy đối với cùng một cơ chất, các hệ thống có sự khác nhau về nguồn năng lượng tiêu hao, về ái lực đối với chất dinh dưỡng và về phương thức điều tiết hệ thống vận chuyển. Tính đa dạng về các phương thức vận chuyển như vậy đã giúp cho vi sinh vật càng có ưu thế cạnh tranh mạnh mẽ trong điều kiện môi trường dễ biến đổi.

13.4.3. Sự chuyển vị nhóm (Group Translocation)

Trong việc vận chuyển chủ động, các phân tử hòa tan vận chuyển qua màng mà không cần cải biến. Nhiều vi sinh vật nhân sơ còn có thê thông qua việc chuyển vị nhóm để hấp thu chất dinh dưỡng. Trong quá trình này vật chất được vận chuyển sẽ có phát sinh biến hóa hóa học. Nhóm này có thể xếp vào loại vận chuyển phụ thuộc năng lượng vì cần sử dụng năng lượng trao đổi chất. Hệ thống chuyển vị nhóm quen biết nhất là Phosphoenolpyruvate: hệ thống phosphotransferase đường (PTS). Nhiều loại đường thông qua phương thức vận chuyển này để chuyển vào tế bào vi sinh vật nhân sơ khi bị phosphoryl hóa và sử dụng phosphoenolpyruvate (PEP) làm thể cho phosphate:

PEP + Đường (ngoại bào) → Pyruvate + Đường + P (nội bào)

PET rất phức tạp, ở vi khuẩn E.coli và Salmonella typhimurium PTS tạo thành bởi 2 enzym (EI và EII) và 1 protein ổn định nhiệt có phân tử lượng thấp (HPr). HPr và Enzym EI là tồn tại trong tế bào chất. Enzym EII có nhiều biến hóa trong cấu trúc, thường do hợp thành bởi 3 tiểu đơn vị (subunits) hay vùng kết cấu (domains), trong đó EIIA (trước đây gọi là EIII) là protein tế bào chất có thể hòa tan, EIIB cũng là một protein ưa nước (hydrophilic), EIIC là protein kỵ nước nằm trên màng tế bào, hai loại sau thường kết hợp lại với nhau. Trong quá trình vận chuyển, dưới tác dụng của EI và HPr một phosphate cao năng từ PEP chuyển đến enzym EII với sự giúp đỡ của Enzym I và HPr. Sau đó EII đưa 1 phân tử đường qua màng vào tế bào và được phosphoryl hóa. EII chỉ vận chuyển chuyên hóa từng loại đường và trong các hệ thống PTS khác nhau có các EII khác nhau, còn EI và HPr là giống nhau trong mọi hệ thống PTS.

Hình 13.11: Chuyển vị nhóm (Theo sách Microbiology của Prescott, Harley và Klein)

Hệ thống PTS phân bố rộng rãi ở các vi sinh vật nhân sơ. Các chi vi khuẩn Escherichia, Salmonella, Staphylococcus và các vi khuẩn kỵ khí không bắt buộc (facultatively anaerobic) khác đều có hệ thống PTS. Một số vi khuẩn kỵ khí bắt buộc, như thuộc chi Clostridium, cũng có hệ thống PTS. Một số vi khuẩn thuộc chi Bacillus có cả hai hệ thống Đường phân (Glycolyse) và PTS. Nhưng các vi khuẩn hiếu khí hầu như không có hệ thống PTS. Nhiều carbohydrate được vận chuyển bởi hệ thống này. Vi khuẩn E.coli hấp thu glucose, fructose, mannitol, saccharose, N-acetylglucosamine, cellobiose và nhiều carbohydrate nằng phương thức chuyển vị nhóm. Ngoài vai trò dùng để vận chuyển, protein PTS còn là cơ quan cảm thụ hóa học - cảm thụ khí trong quá trình hóa hướng động.

13.4.4. Sự hấp thụ Sắt (Iron Uptake)

Hình 13.12. Siderophore

Hầu như tất cả vi sinh vật đều cần sử dụng sắt (Fe) để cấu tạo nên các Cytochrome và nhiều enzym. Sắt rất khó hấp thụ vì ion sắt (Fe3+) và các dẫn xuất của chúng rất khó hòa tan, trong môi trường thường có rất ít các hợp chất sắt dễ hòa tan để có thể vcận chuyển vào tế bào. Việc hấp thu sắt của vi sinh vật là hết sức khó khăn. Nhiều vi khuẩn và nấm phải khắc phục khó khăn này bằng cách thông qua thể mang sắt (siderophore). Đó là những phân tử có phân tử lượng thấp lại liên kết với sắt và chuyển vận được vào tế bào, thường đó là các muối hydroxamates hoặc phenolates-catecholates. Ferrichrome là một loại hydroxamate được sinh ra bởi nhiều nấm; enterobactin là loại catecholate được sinh ra bởi E.coli... Trong hình bên ta thấy 3 loại thể mang sắt dưới các dạng khác nhau.

Khi môi trường có chứa với hàm lượng thấp các sắt có thể sử dụng vi sinh vật sẽ tiết ra các thể mang sắt (siderophones) để kết hợp với sắt và chuyển đến màng tế bào. Lúc đó sẽ kết hợp tiếp với protein thụ thể (receptor-protein) để chuyển sắt vào trong tế bào, hoặc toàn bộ phức thể Sắt-siderophone được chuyển vào trong nhờ một protein vận chuyển ABC (ATP-binding cassette transporter). Ở vi khuẩn E.coli thụ thể siderophone nằm màng ngoài (outer membrane), sau khi Fe3+ được chuyển đến khe chu chất (periplasmic space) thì với sự hỗ trợ của protein vận chuyển sắt sẽ được chuyển qua màng sinh chất (plasma membrane), sau đó Fe3+ sẽ được khử thành Fe2+. Vì sắt rất cần cho quá trình sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật cho nên vi sinh vật cần sử dụng nhiều phương thức hấp thu khác nhau để đáp ứng nhu cầu này.

Bài 15 Sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật

Sinh trưởng là biểu thị sự tăng trưởng các thành phần của tế bào. Đối với các vi sinh vật có hình thức sinh sản bằng nẩy chồi hay phân đôi thì sinh trưởng dẫn tới sự gia tăng số lượng tế bào. Tế bào tăng trưởng đến một mức độ nhất định thì sẽ phân cắt thành hai tế bào thế hệ con có kích thước hầu như bằng nhau. Đối với các vi sinh vật đa nhân thì sự phân cách nhân không đồng hành với sự phân cắt tế bào - sự sinh trưởng làm tăng kích thước tế bào mà không làm tăng số lượng tế bào. Vì vi sinh vật rất nhỏ bé cho nên là đối tượng rất không thuận tiện để nghiên cứu về sinh trưởng và phát triển. Chính vì vậy mà khi nghiên cứu về sinh trưởng, người ta thường xét đến sự biến đổi về số lượng của cả quần thể vi sinh vật.

14.1. ĐƯỜNG CONG SINH TRƯỞNG

Sự sinh trưởng quần thể vi sinh vật được nghiên cứu bằng cách phân tích đường cong sinh trưởng trong một môi trường nuôi cấy vi sinh vật theo phương pháp nuôi cấy theo mẻ (batch culture) hoặc trong một hệ thống kín. Có nghĩa là vi sinh vật được nuôi cấy trong một thiết bị kín, trong quá trình nuôi cấy không thay đổi môi trường và thời gian nuôi cấy càng kéo dài thì nồng độ chất dinh dưỡng càng giảm sút, các chất phế thải của trao đổi chất càng tăng lên. Nếu lấy thời gian nuôi cấy là trục hoành và lấy số logarit của số lượng tế bào sống làm trục tung sẽ có thể vẽ được đường cong sinh trưởng của các vi sinh vật sinh sản bằng cách phân đôi. Đường cong này có 4 giai đoạn (phases) khác nhau.

Hình 14.1: Đường cong sinh trưởng trong hệ thống kín

(Theo sách của Prescott, Harley và Klein)

14.1.1. Giai đoạn Tiềm phát (Lag phase)

Khi cấy vi sinh vật vào một môi trường mới số lượng thường không tăng lên ngay, đó là giai đoạn Tiềm phát hay pha Lag. Trong giai đoạn này tế bào chưa phân cắt nhưng thể tích và khối lượng tăng lên rõ rệt do có sự tăng các thành phần mới của tế bào. Nguyên nhân là do tế bào ở trạng thái già, thiếu hụt ATP, các cofactor cần thiết và ribosome. Thành phần môi trường mới không giống môi trường cũ cho nên tế bào cần một thời gian nhất định để tổng hợp các enzyme mới nhằm sử dụng được các chất dinh dưỡng mới. Các tế bào cũng có thể bị thương tổn và cần một thời gian để hồi phục. Bất kỳ vì nguyên nhân gì thì kết quả vẫn là tế bào phải tự trang bị lại các thành phần của mình, tái tạo ADN và bắt đầu tăng khối lượng. Giai đoạn tiềm phát dài hay ngắn liên quan đến bản thân từng loại vi sinh vật và tính chất của môi trường. Nếu tính chất hóa học của môi trường mới sai khác nhiều với môi trường cũ thì giai đoạn tiềm phát sẽ kéo dài. Ngược lại, nếu cấy từ giai đoạn logarit vào một môi trường có thành phần tương tự thì giai đoạn tiềm phát sẽ rút ngắn lại. Nếu cấy vi sinh vật từ giai đoạn tiềm phát hay từ giai đoạn tử vong thì giai đoạn tiềm phát sẽ kéo dài.

14.1.2. Giai đoạn logarit (Log Phase) hay Pha Chỉ số (Exponential Phase)

Trong giai đoạn này vi sinh vật sinh trưởng và phân cắt với nhịp độ tối đa so với bản tính di truyền của chúng nếu gặp môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp. Nhịp độ sinh trưởng của chúng là không thay đổi trong suốt giai đoạn này, các tế bào phân đôi một cách đều đặn. Do các tế bào sinh ra chỉ khác nhau rất ít cho nên đường cong sinh trưởng là một đường trơn nhẵn chứ không gấp khúc (hình 14.1). Quần thể tế bào trong giai đoạn này có trạng thái hóa học và sinh lý học cơ bản là như nhau cho nên việc nuôi cấy ở giai đoạn này thường được sử dụng để nghiên cứu sinh hóa học và sinh lý học vi sinh vật.

Sinh trưởng logarit là sinh trưởng đồng đều, tức là các thành phần tế bào được tổng họp với tốc độ tương đối ổn định. Nếu cân bằng dinh dưỡng hay các điều kiện môi trường thay đổi sẽ dẫn đến sự sinh trưởng không đồng đều. Sự sinh trưởng khi nhịp độ tổng hợp các thành phần của tế bào tương đối biến hóa sẽ biến đổi theo cho đến khi đạt tới một sự cân bằng mới. Phản ứng này rất dễ quan sát thấy khi làm thực nghiệm chuyển tế bào từ một môi trường nghèo dinh dưỡng sang một môi trường giàu hơn. Tế bào trước hết phải tạo nên các ribosome mới có thể nâng cao năng lực tổng hợp protein, sau đó là sự tăng cưởng tổng hợp protein và ADN. Cuối cùng tất yếu dẫn đến tốc độ phát triển nhanh chóng.

Lúc chuyển quần thể tế bào từ một môi trường giàu dinh dưỡng tới một môi trường nghèo thì cũng có kết quả về sự sinh trưởng không đồng đều như vậy. Vi sinh vật trước đó có thể thu được từ môi trường nhiều thành phần của tế bào nhưng khi chuyển sang môi trường nghèo chúng cần có thời gian để tạo ra các enzyme cần thiết để sinh tổng hợp các thành phần không có sẵn trong môi trường. Sau đó tế bào mới có thể phân cắt, ADN mới có thể tái tạo, nhưng việc tổng hợp protein và ARN là chậm cho nên tế bào nhỏ lại và tổ chức lại sự trao đổi chất của chúng cho đến khi chúng có thể sinh trưởng tiếp. Sau đó sự sinh trưởng cân bằng sẽ được hồi phục và trở về lại giai đoạn logarit.

Các thí nghiệm trên đây cho thấy sự sinh trưởng của vi sinh vật được kiểm soát một cách chính xác, phối hợp và phản ứng nhanh chóng với những sự biến đổi của môi trường.

Khi sự sinh trưởng của vi sinh vật bị hạn chế bởi nồng độ thấp của các chất dinh dưỡng cần thiết thì sản lượng tế bào cuối cùng sẽ tăng lên cùng với sự tăng lên của các chất dinh dưỡng bị hạn chế (hình 14.2a). Đây chính là cơ sở để sử dụng vi sinh vật trong việc định lượng vitamin và các nhân tố sinh trưởng khác. Tốc độ sinh trưởng cũng tăng lên cùng với sự tăng nồng độ các chất dinh dưỡng (hình 14.2b). Hình dáng của đường cong hầu như phản ánh tốc độ hấp thu chất dinh dưỡng nhờ sự chuyển vận protein của vi sinh vật. Lúc nồng độ chất dinh dưỡng đủ cao thì hệ thống vận chuyển sẽ bão hòa và tốc độ sinh trưởng không tăng lên cùng với sự tăng lên của nồng độ chất dinh dưỡng.

Hình 14.2: Nồng độ chất dinh dưỡng và sinh trưởng

(a )- Ảnh hưởng của sự hạn chế chất dinh dưỡng đối với sản lượng chung của vi sinh vật. Lúc nồng độ đủ cao thì sản lượng chung sẽ đạt tới ổn định.

(b)- Ảnh hưởng của sự hạn chế chất dinh dưỡng tới tốc độ sinh trưởng.

14.1.3. Giai đoạn Ổn định (Stationary Phase) hay Pha Cân bằng

Qua giai đoạn Logarit sự sinh trưởng của quần thể cuối cùng sẽ dừng lại, đường cong sinh trưởng đi ngang (hình 14.1). Nồng độ vi khuẩn trong giai đoạn ổn định thường vào khoảng 109/ml. Với các vi sinh vật khác thường không đạt được đến nồng độ này. Với động vật nguyên sinh và vi tảo thường chỉ đạt đến nồng độ 10 6/ml. Đương nhiên, số lượng tế bào cuối cùng quyết định bởi ảnh hưởng chung của điều kiện dinh đưỡng, chủng loại vi sinh vật và các nhân tố khác. Trong giai đoạn này số lượng tế bào sống là không thay đổi, có thể do số lượng tế bào mới sinh ra cân bằng với số lượng tế bào chết đi, hoặc là tế bào ngừng phân cắt mà vẫn giữ nguyên hoạt tính trao đổi chất.

Có nhiều nguyên nhân làm cho quần thể vi sinh vật chuyển sang giai đoạn ổn định. Trong đó nguyên nhân chủ yếu là sự hạn chế của chất dinh dưỡng. Nếu một chất dinh dưỡng thiết yếu bị thiếu hụt nghiêm trọng thì sự sinh trưởng sẽ chậm lại. Vi sinh vật hiếu khí thường bị hạn chế bởi nồng độ oxygen. Oxygen thường hòa tan ít trong nước, O2 trong nội bộ môi trường rất nhanh chóng bị tiêu thụ hết, chỉ có các vi sinh vật sinh trưởng ở bề mặt môi trường mới có đủ nồng độ O2 để sinh trưởng. Vì vậy khi nuôi cấy vi sinh vật phải sử dụng tới máy lắc hay các biện pháp thông khí khác. Quần thể vi sinh vật cũng có thể bị đình chỉ sinh trưởng khi gặp sự tích lũy của các sản phẩm trao đổi chất có hại. Một số vi sinh vật kỵ khí (như Streptococcus) có thể lên men đường làm sản sinh một lượng lớn acid lactic hay các acid hữu cơ khác, làm acid hóa môi trường và ức chế sự sinh trưởng của vi sinh vật. Đồng thời sự tiêu hao hết đường cũng làm cho tế bào đi vào giai đoạn ổn định. Sau nữa là, một số chứng cứ cho thấy khi số lượng vi sinh vật đạt đến một giới hạn nhất định thì sự sinh trưởng có thể bị đình chỉ. Sự sinh trưởng của vi sinh vật chuyển sang giai đoạn ổn định có thể do kết quả chung của rất nhiều nhân tố khác nhau

Như chúng ta.đã thấy vi khuẩn khi nuôi cấy theo mẻ sẽ chuyển sang giai đoạn ổn định khi thiếu thức ăn. Trong tự nhiên, do nhiều môi trường có nồng độ chấ dinh dưỡng rất thấp nên vi sinh vật thường chuyển sang giai đoạn ổn định. Đối với vi khuẩn việc chuyển sang giai đoạn ổn định có thể là một loại thích ứng tốt. Nhiều loại vi khuẩn không có sự biến hóa rõ rệt về hình thái (như hình thành bào tử nội sinh-endospore) nhưng chúng có thể thu nhỏ kích thước lại, thường do chất nguyên sinh co lại và nhân giả (nucleoid) đậm đặc lại. Một biến đổi quan trọng hơn là, khi thiếu thức ăn vi khuẩn sẽ sinh ra một loại protein đói (starvation proteins) làm cho tế bào đề kháng nhiều hơn với các thương tổn bằng nhiều con đường khác nhau. Chúng làm tăng các liên kết peptidoglycan và sự bền vững của thành tế bào. Chẳng hạn Dps (DNA-binding protein from starved cells), một loại protein kết hợp với ADN lấy từ các tế bào đói, có thể bảo vệ cho ADN. Phân tử Chaperones cản trở sự biến tính của protein và hồi phục lại được các protein bị tổn thương. Vì những việc đó và nhiều cơ chế khác mà các tế bào đói có thể khó bị chết đi và đề kháng được với tình trạng bị đói, với sự biến hóa của nhiệt độ, sự tổn thương về ôxy hóa và sự thẩm thấu, cũng như tăng sức đề kháng với các hóa chất có hại (như chlorine chẳng hạn). Những cải biến này rất có hiệu quả và làm cho một số vi khuẩn có thể sống lại sau vài năm bị đói. Rõ ràng việc hiểu rõ những vấn đề này sẽ có tầm quan trọng thực tiễn to lớn đối với y học và vi sinh vật học công nghiệp. Chúng còn có thể chứng minh vi khuẩn thương hàn (Salmonella typhimurium) và nhiều vi khuẩn gây bệnh khác có thể có khả năng gây bệnh mạnh hơn khi bị đói.

14.1.4. Giai đoạn tử vong (Death Phase)

Việc tiêu hao chất dinh dưỡng và việc tích lũy các chất thải độc hại sẽ làm tổn thất đến môi trường sống của vi sinh vật, làm cho số lượng tế bào sống giảm xuống. Đó là đặc điểm của giai đoạn tử vong. Giống như giai đoạn logarit, sự tử vong của quần thể vi sinh vật cũng có tính logarit (tỷ lệ tế bào chết trong mỗi giờ là không đổi). Tổng số tế bào sống và tế bào chết không thay đổi vì các tế bào chết chưa bị phân hủy. Muốn xác định số lượng tế bào sống phải pha loãng ra rồi cấy lên thạch đĩa và đưa vào điều kiện thích hợp để xác định số khuẩn lạc xuất hiện. Mặc dầu phần lớn vi sinh vật tử vong theo phương thức logarit nhưng sau khi số lượng tế bào đột nhiên giảm xuống thì tốc độ chết của tế bào chậm lại. Đó là do một số cá thể sống lại nhờ có tính đề kháng đặc biệt mạnh. Vì điều này và những nguyên nhân khác làm cho đường cong của giai đoạn tử vong có thể khá phức tạp.

14.1.5. Tính toán về quá trình sinh trưởng

Không ít các nhà vi sinh vật học đã tính toán về tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật trong giai đoạn logarit. Tính toán nhịp độ sinh trưởng sẽ làm cơ sở cho các nghiên cứu về sinh lý học, sinh thái học vi sinh vật, và còn để giải quyết một số vấn đề ứng dụng trong sản xuất công nghiệp.

Trong giai đoạn logarit mỗi cá thể vi sinh vật tiến hành phân cắt trong một thời gian hằng định. Số lượng tế bào tăng theo phương thức 2n. Thời gian giữa hai lần phân chia liên tiếp hay thời gian cần cho sự tăng đôi số tế bào được gọi là thời gian thế hệ (generation time hay doubling time). Ví dụ đưa một tế bào vào môi trường nuôi cấy, cứ 20 phút phân cắt một lần thì sau 20 phút có 2 tế bào, sau 40 phút có 4 tế bào và tiếp tục như vậy (bảng 14.1)

Bảng 14.1: Một ví dụ về sinh trưởng theo logarit

Thời gian* Số lần phân cắt 2n Số lượng (N¬0 x 2n) lg10 Nt

0 0 20=1 1 0,000

20 1 21=2 2 0,301

40 2 22=4 4 0,602

60 3 23=8 8 0,903

80 4 24=16 16 1,204

100 5 25=32 32 1,505

120 6 26=64 64 1,806

*Thời gian thế hệ là 20 phút, giả thiết là nuôi cấy từ 1 tế bào

Số lượng logarit tế bào là 2n, n là số thế hệ. Có thể biểu thị các số liệu trong bảng 14.1 bằng công thức sau đây:

Trong đó: N0 là số lượng tế bào ban đầu; Nt là số lượng tế bào ở thời gian t; n là số thế hệ.

Từ công thức trên có thể biến đổi như sau và số thế hệ n được tính bằng logarit thập phân:

Khi nuôi cấy phân mẻ (batch culture) tốc độ sinh trưởng trong giai đoạn logarit có thể biểu thị bằng hằng số tốc độ sinh trưởng bình quân k (mean growth rate constant k). Đó là số thế hệ sinh ra trong đơn vị thời gian, thường biểu thị bằng số thế hệ trong 1 giờ:

Thời gian cần thiết để tăng gấp đôi tổng số tế bào là thời gian thế hệ bình quân (mean generation time) hay thời gian tăn gấp đôi bình quân (mean doubling time) và được biểu thị bằng g. Nếu t=g thì N t= 2N0. Thay vào công thức trên ta có:

Thời gian thế hệ bình quân là đảo số của hằng số tốc độ sinh trưởng bình quân:

Thời gian thế hệ bình quân g có thể căn cứ trực tiếp vào đồ thị bán logarit (semilogarithmic plot) và hằng số tốc độ sinh trưởng để tính ra (hình 14.4). Ví dụ ,số lượng vi khuẩn tại giờ thứ 10 là từ 103 tăng lên đến 109 thì :

(thế hệ/h)

giờ/thế hệ hay 30 phút/thế hệ

Hình 14.3: Sinh trưởng thế hệ của vi sinh vật (biểu thị 6 thế hệ)

(Theo sách của Prescott,Harley và Klein). Hình 14.4; Xác định thời gian thế hệ.

Thời gian thế hệ có thể xác định bằng đường cong sinh trưởng của vi sinh vật. Lấy thời gian là trục hoành và lấy số lượng tế bào làm trục tung. Thời gian tăng gấp đôi số lượng của quần thể (thời gian thế hệ) có thể đọc trực tiếp trên đồ thị

Thời gian thế hệ thay đổi tùy theo chủng loại vi sinh vật, điều kiện nuôi cấy. Một số vi khuẩn thời gian thế hệ không quá 10 phút (0,17h) trong khi ở một số vi sinh vật nhân thực (eucaryotic) lại dài tới vài ngày (Bảng 14.2). Thời gian thế hệ trong tự nhiên thường là dài hơn so với khi nuôi cấy.

Bảng 14.2: Thời gian thế hệ của một số loài vi sinh vật

Vi sinh vật Nhiệt độ (0C) Thời gian thế hệ (giờ)

Vi khuẩn và Vi khuẩn lam

Beneckea natriegens 37 0,16

Escherichia coli 40 0,35

Bacillus subtilis 40 0,43

Staphylococcus aureus 37 0,47

Pseudomonas aeruginossa 37 0,58

Clostridium botulinum 37 0,58

Rhodospirillum rubrum 25 4,6-5,3

Anabaena cylindrica 25 10,6

Mycobacterium tuberculosis 37 Khoảng 12

Treponema pallidum 37 33

Tảo

Scenedesmus quadricauda 25 5,9

Chlorella pyrenoidosa 25 7,75

Asterionella formosa 20 9,6

Euglena gracilis 25 10,9

Ceratium tripos 20 82,8

Động vật nguyên sinh

Tetrahymena geleii 24 2,2-4,2

Leishmania donovani 26 10-12

Paramecium caudatum 26 10,4

Acanthamoeba castellanii 30 11-12

Giardia lamblia 37 18

Nấm

Saccharomyces cerevisiae 30 2

Monilinia fructicola 25 30

14.2. XÁC ĐỊNH SỰ SINH TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT

Có nhiều cách thông qua việc xác định sự biến đổi số lượng và chất lượng vi sinh vật để hiểu được sự sinh trưởng của vi sinh vật, biết được tốc độ sinh trưởng và thời gian thế hệ. Dưới đây sẽ giới thiệu các phương pháp thường dùng nhất cùng các ưu, khuyết điểm của các phương pháp này. Không có phương pháp nào là tốt nhất, lựa chọn phương pháp nào còn phụ thuộc vào từng trường hợp cụ thể.

14.2.1. Xác định số lượng tế bào

Phương pháp đơn giản nhất để xác định số lượng tế bào là đếm trực tiếp dưới kính hiển vi. Dùng các phòng đếm để đếm vừa nhanh chóng, dễ dàng, lại rẻ tiền nhất, lại có thể quan sát thấy kích cỡ và hình dáng tế bào. Thường dùng phòng đếm Petroff-Hausser để đếm tế bào động vật nguyên sinh. Dùng phòng đếm hồng cầu có thể đếm được các tế bào nhân nguyên thủy cũng như tế bào nhân thật. Với tế bào nhân nguyên thủy cần nhuộm màu hoặc là dùng kính hiển vi tương phản pha hay kính hiển vi huỳnh quang (phase-constrast or fluoresence microscope) để dễ quan sát hơn. Phòng đếm có cấu trúc để có một độ sâu nhất định lại có chia ra thành các ô nhỏ (hình 14.5). Khi đếm số lượng ta đưa dịch pha loãng vào phòng đếm, đậy lá kính (lamelle/ cover glass) lên trên, sau đó tiến hành đếm số lượng dưới kính hiển vi. Khuyết điểm của phương pháp này là không xác định được với các mẫu có số lượng vi khuẩn quá nhỏ, độ chính xác cũng không cao vì không phân biệt được giữa tế bào sống và tế bào chết.

Hình 14.5: Phòng đếm Petroff-Hauser:

(a)- Mặt nhìn nghiêng của phòng đếm- Phòng đếm chứa dịch huyền phù vi khuẩn là khoảng không gian bên dưới lá kính; (b)- Giữa phiến kính có phòng đếm với các ô nhỏ; (c) Ở độ phóng đại khoảng x 400-500 tiến hành đếm số lượng vi khuẩn trong các ô nhỏ. Lấy số lượng bình quân để tính ra mật độ vi khuẩn trong mẫu vật. Trong phạm vi 1mm2 có 225 ô nhỏ , do đó số lượng vi khuẩn trên 1mm2 là (số vi khuẩn/mm) x 25; vì phòng đếm có chiều dầy là 0,02mm do đó nồng độ vi khuẩn trong phòng đếm là: (số vi khuẩn)/m2 x 25 (tổng số ô nhỏ) x 50= số vi khuẩn/mm 3.

Vì 1 cm3=1 mm3 x 103cho nên giả thử số lượng vi khuẩn bình quân trong mỗi ô nhỏ là 28 thì trong 1 cm3 có nồng độ vi khuẩn là 28 x 25 x 50 x103= 3,5 x 107vi khuẩn. Nhân với độ pha loãng ban đầu (nếu có) sẽ biết được nồng độ vi khuẩn trong mẫu kiểm tra.

Với động vật nguyên sinh, vi tảo và nấm men có thể dùng máy đếm điện tử như loại máy Coulter Counter để xác định số lượng. Nguyên lý là hai bên mỗi lỗ nhỏ có điện cực và nối điện. Khi tế bào trong dịch huyền phù đi qua lỗ nhỏ thì cứ mỗi tế bào đi qua thì điện trở lại tăng lên (hoặc tính dẫn điện giảm xuống) và sinh ra một tín hiệu điện, máy đếm sẽ tự động ghi số. Kết quả xác định của loại máy này khá chính xác, có thể ứng dụng rộng rãi để xác định số lượng hồng cầu và bạch cầu, nhưng phương pháp này không thích hợp xác định số lượng vi khuẩn vì dễ bị can thiệp bời các hạt nhỏ và các vật chất dạng sợi trong mẫu vật.

Cả hai phương pháp nói trên đều không phân biệt được tế bào sống và tế bào chết. Để xác định số lượng tế bào sống người ta thường dùng phương pháp cấy dịch pha loãng lên bề mặt môi trường thạch đĩa. Sau khi nuôi cấy mỗi vi khuẩn sẽ tạo thành 1 khuẩn lạc. Ví dụ ở độ pha loãng 1 x 10-6 đếm được 150 khuẩn lạc thì có nghĩa là mật độ vi khuẩn trong mẫu là 1,5 x 108.

Dùng dụng cụ đếm khuẩn lạc càng thêm thuận tiện. Phương pháp này cho biết số lượng các tế bào sống của vi sinh vật. Phương pháp này đơn giản, nhạy cảm và thích hợp ứng dụng rộng rãi để xác định số lượng vi sinh vật sống khi phân tích các mẫu thực phẩm, nước, đất...Tuy nhiên kết quả cũng chịu ảnh hưởng của một số nhân tố. Nếu vi khuẩn dính thành khối không tách rời nhau ra thì kết quả thu được là thấp hơn thực tế., vì mỗi khuẩn lạc không phát triển từ một tế bào riêng rẽ. Vì vậy kết quả thu được từ phương pháp này được coi là số đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU-colony forming unit). CFU không hoàn toàn phù hợp với số tế bào sống trong mẫu vật. Trong quá trình sử dụng phương pháp này nên sử dụng độ pha loãng nào cho số khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa chỉ nằm trong phạm vi khoảng 30-300 mà thôi. Đương nhiên môi trường dinh dưỡng không thể đáp ứng chung cho mọi loại vi sinh vật, do đó kết quả thu được bao giờ cũng thấp hơn thực tế. Khi trộn thạch với dịch pha loãng thì thạch đã đủ nguội để không làm chết vi khuẩn hay làm thương tổn với một số loại mẫn cảm với nhiệt độ . Việc cấy cấy dịch pha loãng trên bề mặt rồi dàn đều bằng que gạt thủy tinh thường cho kết quả cao hơn về số lượng vi sinh vật so với phương pháp trộn với môi trường thạch chưa đông.

Hình 14.6: Tách khuẩn lạc và phương pháp kiểm tra số lượng vi sinh vật thông qua đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch đĩa.

(a) (b)- Cách ria cấy để tách khuẩn lạc riêng rẽ (không dùng để đếm số lượng) (c)(d)- Cách pha loảng rồi trộn với môi trường thạch chưa đông

(e)(f)- Cách dàn dịch pha loãng bằng que gạt trên mặt thạch (cho số lượng khuẩn lạc nhiều hơn).Theo sách của K.P.Talaro,2005.

Để xác định số lượng vi sinh vật còn có thể nuôi cấy giấy lọc đã lọc dịch pha loãng mẫu vật. Phương pháp này gọi là phương pháp màng lọc (membrane filter). Dùng một thiết bị lọc đặc biệt đặt vừa một giấy lọc hình tròn có các lỗ nhỏ hơn kích thước vi khuẩn và các vi sinh vật khác. Sau khi lọc đặt giấy lọc lên môi trường thạch thích hợp hoặc thấm ướt màng lọc bằng dịch môi trường thích hợp rồi để nuôi cấy 24 giờ. Đếm số khuẩn lạc mọc trên giấy lọc để tính ra mật độ vi khuẩn sống có mặt trong mẫu vật (hình 14.7)

Hình 14.7: Phương pháp lọc màng để xác định số lượng vi sinh vật

Phương pháp này thích hợp để sử dụng phân tích vi sinh vật trong nước. Có thể dùng các môi trường khác nhau thích hợp với các nhóm vi sinh vật khác nhau (hình 14.8)

Hình 14.8: Các loại khuẩn lạc mọc trên màng lọc.

Theo sách của Prescott,Harley và Klein (2005)

(a)- Tổng số vi khuẩn mọc trên môi trường tiêu chuẩn, Dùng chỉ thị màu để nhuộm đỏ khuẩn lạc cho dễ điếm;

(b)- Dùng môi trường thích hợp để kiểm tra nhóm vi khuẩn coliform có nguồn gốc từ phân (khuẩn lạc bắt màu xanh);

(c)- Dùng môi trường thạch m-Endo để xác định vi khuẩn E.coli và các Coliform khác- khuẩn lạc có màu lục;

(d)- Nắm sợi và nấm men mọc trên môi trường Thạch - Mạch nha.

Phương pháp màng lọc còn dùng để đếm trực tiếp vi khuẩn. Dịch mẫu vật được lọc qua một màng polycarbonate màu đen. Vi khuẩn trên màng lọc được nhuộm màu huỳnh quang bằng thuốc nhuộm acridine da cam hoặc DAPI (diamidino-2-phenylindole). Quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang có thể thấy các tế bào vi sinh vật hiện lên màu da cam hay màu lục trên một nền đen. Hiện đã có những kit thương mại cho phép phân biệt tế bào sống và tế bào chết khi kiểm tra.

14.2.2. Xác định khối lượng tế bào

Sự sinh trưởng của vi sinh vật không chỉ biểu hiện ở số lượng tế bào mà còn ở cả sự tăng trưởng của tổng khối lượng tế bào. Phương pháp trực tiếp nhất là xác định trọng lượng khô của tế bào. Trước hết cần ly tâm để thu nhận sinh khối tế bào. Sau đó rửa tế bào rồi làm khô trong lò sấy rồi cân trọng lượng khô. Phương pháp này thích hợp để xác định sự sinh trưởng của nấm. Phương pháp này tốn thời gian và không thật mẫn cảm. Đối với vi khuẩn vì trọng lượng từng cá thể là rất nhỏ, thậm chí phải ly tâm tới vài trăm ml mới đủ số lượng để xác định trọng lượng sinh khối khô.

Phương pháp nhanh hơn, mẫn cảm hơn là dùng phương pháp đo độ đục nhờ tán xạ ánh sáng. Mức độ tán xạ ánh sáng tỷ lệ thuận với nồng độ tế bào. Lúc nồng độ vi khuẩn đạt đến 107 tế bào/ml thì dịch nuôi cấy sẽ vẩn đục, nồng độ càng tăng thì độ đục cũng tăng theo và làm cản trở ánh sáng đi qua dịch nuôi. Có thể đo độ tán xạ ánh sáng bằng quang phổ kế (spectrophotometer). Ở một mức độ hấp thụ ánh sáng thấp, giữa nồng độ tế bào và giá trị hấp thụ ánh sáng có quan hệ tuyến tính (hình 14.9). Chỉ cần nồng độ vi sinh vật đạt tới nồng độ có thể đo được là đều có thể dùng phương pháp đo độ đục trên quang phổ kế để xác định sự sinh trưởng của vi sinh vật. Nếu hàm lượng một số vật chất trong mỗi tế bào là giống nhau thì tổng lượng chất đó trong tế bào có tương quan trực tiếp với tổng sinh khối vi sinh vật. Chẳng hạn, thu tế bào trong một thể tích nhất định của dịch nuôi cấy, rửa sạch đi rồi đo tổng lượng protein hay tổng lượng nitrogen, có thể thấy sự tăng quần thể vi sinh vật là phù hợp với sự tăng tổng lượng protein (hay N). Cũng tương tự như vậy, việc xác định tổng lượng chlorophyll có thể dùng đẻ đo sinh khối tảo; đo hàm lượng ATP có thể biết được sinh khối của các vi sinh vật sống.

Hình 14.9: Đo số lượng vi sinh vật bằng phương pháp đo độ đục.

Thông qua việc đo độ hấp thụ ánh sáng có thể xác định được sinh khối vi sinh vật. Khi số lượng tế bào tăng lên sẽ dẫn đến việc tăng độ đục, mức độ tán xạ ánh sáng nhiều hơn và quang phổ kế sẽ đo được mức độ tăng lên của trị số hấp thụ ánh sáng. Trên quang phổ kế có hai thang chia độ: phía dưới là trị số hấp thụ ánh sáng, phía trên là mức độ thấu quang. Khi trị số hấp thụ ánh sáng tăng lên thì mức độ thấu quang hạ xuống.

14.3. NUÔI CẤY LIÊN TỤC VI SINH VẬT

Trong các phần trên chúng ta xem xét việc nuôi cấy phân mẻ (batch cultures) trong các hệ thống kín, tức là không có chuyện bổ sung chất dinh dưỡng, cũng không thải loại các sản phẩm có hại sinh ra trong quá trinh sống. Giai đoạn logarit chỉ duy trì qua vài thế hệ sau đó chuyển vào giai đoạn ổn định. Nếu nuôi cấy vi sinh vật trong một hệ thống hở, trong quá trình nuôi cấy thường xuyên bổ sung chất dinh dưỡng và thải loại các chất cặn bã thì có thể làm cho môi trường luôn giữ ở trạng thái ổn định. Đó là hệ thống nuôi cấy liên tục (continuous culture system). Trong hệ thống này sự sinh trưởng của vi sinh vật luôn giữ được ở trạng thái logarit, nồng độ sinh khối vi sinh vật luôn giữ được ổn định trong một thời gian tương đối dài.

Giả thử ta có một bình nuôi cấy trong đó vi khuẩn đang sinh trưởng, phát triển. Ta cho chảy liên tục vào bình một môi trường mới có thành phần không thay đổi. Thể tích bình nuôi cấy giữ ổn định. Dòng môi trường đi vào bù đắp cho dòng môi trường đi ra với cùng một tốc độ. Ta gọi thể tích của bình là v (lit), tốc độ dòng môi trường đi vào là f (lít/ giờ). Tốc độ (hay Hệ số) pha loãng được gọi là D (f/v). Đại lượng D biểu thị sự thay đổi thể tích sau 1 giờ. Nếu vi khuẩn không sinh trưởng và phát triển thì chúng sẽ bị rút dần ra khỏi bình nuôi cấy theo tốc độ:

ν= dX/dt = D.X

X là sinh khối tế bào

Người ta thường dùng hai loại thiết bị nể nuôi cấy liên tục vi sinh vât. Đó là Chemostat và Turbidostat.

14.3.1. Chemostat

Khi sử dụng Chemostat để nuôi cấy vi sinh vật người ta đưa môi trường vô khuẩn vào bình nuôi cấy với lượng tương đương với tốc độ đưa môi trường chứa vi khuẩn ra khỏi bình nuôi cấy (xem hình 14.10). Trong môi trường một số chất dinh dưỡng thiết yếu ( như một vài acid amin) cần khống chế nồng độ trong một phạm vi nhất định. Vì vậy tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật trong hệ thống quyết định bởi tốc độ môi trường mới được đưa vào hệ thống và nồng độ tế bào phụ thuộc vào nồng độ các chất dinh dưỡng được hạn chế. Nhịp độ đổi mới chất dinh dưỡng biểu thị bởi nhịp độ pha loãng D (dilution rate). Tốc độ lưu thông của chất dinh dưỡng (ml/h) được biểu thị bằng f và thể tích bình nuôi cấy là V (ml):

D= f/V

Chẳng hạn nếu f là 30ml/h và V là 100ml thì nhịp độ pha loãng D là 0,30h-1. Cả số lượng vi sinh vật và thời gian thế hệ đều có liên quan đến nhịp độ pha loãng (hình 14.11). Trong một phạm vi nhịp độ pha loãng tương đối rộng thì mật độ vi sinh vật trong hệ thống là không thay đổi.. Khi nhịp đọ pha loãng tăng lên, thời gian thế hệ hạ xuống (tốc độ sinh trưởng tăng lên), khi đó chất dinh dưỡng hạn chế bị tiêu hao hết. Nếu nhịp độ pha loãng quá cao thì vi sinh vật bị loại ra khỏi bình nuôi cấy trước khi kịp sinh sôi nẩy nở bởi vì lúc đó nhịp độ pha loãng cao hơn tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật. Nồng độ các chất dinh dưỡng hạn chế tăng lên khi nhịp độ pha loãng tăng cao vi có ít vi sinh vật sử dụng chúng.

Hình 14.10: Nuôi cấy liên tục trong

Chemostat và Turbidostat Hình14.11: Hệ thống nuôi cấy liên tục (Chemostat)

Khi nhịp độ pha loãng rất thấp thì nếu tăng nhịp độ pha loãng sẽ làm cho cả mật độ tế bào và tốc độ sinh trưởng đều tăng lên. Đó là do hiệu ứng của nồng độ chất dinh dưỡng đối với nhịp độ sinh trưởng (growth rate). Quan hệ này có lúc được gọi là quan hệ Monod (Monod relationship). Trong điều kiện nhịp độ pha loãng thấp , chỉ có ít ỏi chất dinh dưỡng được cung cấp thì tế bào phải dùng phần lớn năng lượng để duy trì sự sống chứ không dùng để sinh trưởng, phát triển. Lúc nhịp độ pha loãng tăng lên, chất dinh dưỡng tăng lên, tế bào có nhiều năng lượng được cung cấp, không những để duy trì sự sống mà còn có thể dùng để sinh trưởng, phát triển, làm tăng cao mật độ tế bào. Nói cách khác, khi tế bào có thể sử dụng năng lượng vượt quá năng lượng duy trì (maintenance energy) thì nhịp độ sinh trưởng sẽ bắt đầu tăng lên.

Hình 14.12: Tỷ lệ pha loãng trong chemostat và sinh trưởng của vi sinh vật

14.3.2. Turbidostat

Turbidostat là loại hệ thống nuôi cấy liên tục thứ hai. Thông qua tế bào quang điện (photocell) để đo độ hấp thụ ánh sáng hay độ đục trong bình nuôi cấy để tự động điều chỉnh lưu lượng môi trường dinh dưỡng, làm cho độ đục hay mật độ tế bào giữ ở mức độ như dự kiến. Turbidostat và Chemostat có nhiều điểm khác nhau. Trong hệ thống Turbidostat môi trường không chứa các chất dinh dưỡng hạn chế, nhịp độ pha loãng không cố định. Turbidostat hoạt động tốt nhất khi nhịp độ pha loãng cao trong khi Chemostat lại ổn định nhất và hiệu quả nhất khi nhịp độ pha loãng tương đối thấp.

Hệ thống nuôi cấy liên tục là rất có lợi vì các tế bào luôn ở trạng thái sinh trưởng thuộc giai đoạn logarit. Hơn nữa có thể dùng làm mô hình để nghiên cứu sự sinh trưởng của vi sinh vật trong điều kiện nồng độ chất dinh dưỡng thấp tương tự như ở môi trường tự nhiên. Hệ thống nuôi cấy liên tục rất có ích trong việc nghiên cứu nhiều lĩnh vực khác. Chẳng hạn, để nghiên cứu tác dụng tương hỗ giữa các loài vi sinh vật trong điều kiện môi trường tương tự như môi trường nước ao hồ nước ngọt. Hệ thống nuôi cấy liên tục đã được sử dụng trong các ngành vi sinh vật học công nghiệp và thực phẩm.

14.4. ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC NHÂN TỐ MÔI TRƯỜNG ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT

Như chúng ta đã biết vi sinh vật có khả năng đáp ứng với sự biến hóa của nồng độ chất dinh dưỡng, nhất là các chất dinh dưỡng hạn chế. Sự sinh trưởng của vi sinh vật chịu ảnh hưởng rất lớn đối với các nhân tố vật lý, hóa học của môi trường sống. Hiểu biết về ảnh hưởng của các nhân tố môi trường đối với sự sinh trưởng của vi sinh vật giúp ích rất nhiều cho việc khống chế vi sinh vật cũng như đối với việc nghiên cứu sự phân bố sinh thái của vi sinh vật. Đáng chú ý là một số vi sinh vật có thể sống được trong những điều kiện cực đoan (extreme) và khó sống (inhospitable). Các vi sinh vật nhân nguyên thủy (Procaryotes) có thể sinh tồn tại ở mọi nơi có thể sinh sống. Nhiều nơi các vi sinh vật khác không thể tồn tại được nhưng vi sinh vật nhân nguyên thủy vẫn có thể sinh trưởng rất tốt. Chẳng hạn vi khuẩn Bacillus infernus có thể sống ở độ sâu 1,5 dặm dưới mặt đất, nơi không có ôxy và có nhiệt độ cao đến 600C. Những vi sinh vật có thể sinh trưởng được trong những hoàn cảnh hà khắc như vậy được gọi là các vi sinh vật ưa cực đoan.

Trong phần này chúng ta sẽ xem xét ảnh hưởng của một số nhân tô chủ yếu của môi trường đối với sự sinh trưởng của vi sinh vật (bảng 14.3)

Bảng 14.3: Phản ứng của vi sinh vật với các nhân tố môi trường

Thuật ngữ Định nghĩa Vi sinh vật đại diện

Hoạt tính của nước và dung chất

Vi sinh vật ưa áp (Osmotolerant) Có thể sinh trưởng trong một phạm vi rộng về hoạt tính của nước và nồng độ thẩm thấu. Staphylococcus aureus, Saccharomyces

Vi sinh vật ưa măn (Halophile) Cần sinh trưởng ở nồng độ NaCl cao, thường là từ 0,2 mol/L trở lên. Halobacterium,Dunaliella, Ectothiorhodospira

pH

Ưa acid (Acidophile) Sinh trướng tốt nhất trong phạm vi pH 0-5,5 Sulfolobus,Picrofilus, Ferroplasma, Acontium, Cyanidum caldarium.

Ưa trung tính (Neutrophile) Sinh trướng tốt nhất trong phạm vi pH 5,5- 8,0 Escherichia, Euglena, Paramecium

Ưa kiềm(Alkalophile) Sinh trướng tốt nhất trong phạm vi pH 8,5-11,5 Bacillus alcalophilus, Natronobacterium

Nhiệt độ

Ưa lạnh(Psychrophyle) Sinh trưởng tốt nhất ở 150C hay thấp hơn. Bacillus psychrophilus, Chlamydomonas nivalis

Chịu lạnh(Psychrotroph) Có thể sinh trưởng ở 0-70C nhưng sinh trưởng tốt nhất ở 20-300C, còn có thể sinh trưởng được ở khoảng 350C Listeria monocytogenes, Pseudomonas fluorescens

Ưa ấm(Mesophile) Sinh trưởng tốt nhất ở 25-450C. Escherichia coli, Neisseria, Gonorrhoeae, Trichomona vaginalis.

Ưa nhiệt(Thermophile) Có thể sinh trưởng ở nhiệt độ 550C hoặc cao hơn, nhiệt độ thích hợp nhất thường là giữa 55 và 650C Bacillus stearothermophilus, Thermus aquaticus, Cyanidium caldarium, Chaetomium thermophile

Ưa nhiệt cao (Hyperthermophile) Thích hợp phát triển ở nhiệt độ giữa 80 và khoảng 1130C Sulfolobus, Pyrodictium, Pyrococcus.

Nồng độ Ôxy

Hiếu khí bắt buộc (Obligate aerobe) Hoàn toàn dựa vào O2 của không khí để sinh trưởng Micrococcus luteus, Pseudomonas, Mycobacteriun, phần lớn Tảo, Nấm và ĐV nguyên sinh

Kỵ khí không bắt buộc (Facultative anaerobe) Không cần O2 để sinh trướng nhưng sinh trưởng tốt hơn khi có mặt O2¬. Escherrichia, Enterococcus, Saccharomyces cerevisiae

Kỵ khí chịu Oxy (Aetolerant anaerobe) Sinh trưởng như nhau khi có mặt hay không có ôxy Streptococcus pyogenes

Kỵ khí bắt buộc (Obligate anaerobe) Bị chết khi có mặt O2 Clostridium, Bacteroides, Methanobacterium, Trepomonas agilis.

Vi hiếu khí (Microaerophile) Cần O2 ở mức độ thấp hơn2-10% để sinh trưởng và bị tổn hại trong không khí (20%) Campylobacter, Spirillum volutans, Treponema pallidum

Áp suất

Ưa áp (Barophile) Sinh trưởng nhanh hơn khi áp suất thủy tĩnh cao Photobacterium profindum, Shewanella benthica, Methanococcus jannaschii

14.4.1. Hoạt tính của nước và dung chất

Vì tế bào vi sinh vật tách với môi trường của chúng bằng loại màng sinh chất có tính thẩm thấu chọn lọc cho nên vi sinh vật chịu ảnh hưởng của sự biến đổi nồng độ thẩm thấu trong môi trường. Nếu một vi sinh vật được đưa vào dung dịch có nồng độ thẩm thấu thấp thì nước sẽ xâm nhập vào tế bào, nếu không có sự khống chế hữu hiệu thì tế bào sẽ bị trương lên và vỡ ra. Nhờ có các thể nội hàm mà có thể giảm thấp nồng độ thẩm thấu của tế bào chất. Lúc tính thẩm thấu của môi trường thấp hơn tính thẩm thấu của tế bào chất, các vi sinh vật nhân nguyên thủy cũng có thể phá vỡ các kênh mẫn cảm với áp suất làm cho dung chất thấm ra.

Phần lớn vi khuẩn, tảo và nấm thường có thành tế bào vững chắc, có thể duy trì hình thái và tính hoàn chỉnh của tế bào. Lúc đưa tế bào các vi sinh vật có thành tế bào vững chắc vào môi trường áp suất thẩm thấu cao thì nước sẽ thoát ra, màng sinh chất sẽ tách ra khỏi thành tế bào và tạo ra tình trạng co nguyên sinh. Sự mất nước này của tế bào sẽ tổn hại tới màng tế bào chất, tế bào sẽ mất khả năng trao đổi chất và ngừng sinh trưởng. Điều này liên quan đến việc bảo quản thực phẩm nhờ muối mặn hoặc tẩm đường (làm mứt, ngâm mật ong...).

Nhiều vi sinh vật sử dụng dung chất hỗn hợp (compatible solute) để làm cho nồng độ thẩm thấu của nguyên sinh chất cao hơn môi trường chung quanh, làm cho màng sinh chất vẫn gắn được với thành tế bào. Sở dĩ gọi là dung chất hỗn hợp là vì dung chất đó có thể thích hợp để tế bào sinh trưởng và phát triển ngay khi có nồng độ cao trong tế bào. Phần lớn vi sinh vật nhân nguyên thủy có thể nâng cao nồng độ thẩm thấu trong tế bào ở môi trường áp suất thẩm thấu cao là nhờ tổng hợp hoặc hấp thu choline, betaine, proline, acid glutamic và các acid amin khác. Việc nâng cao nồng độ K+ cũng có thể ở một mức độ nào đó giúp nâng cao nồng độ thẩm thấu trong tế bào. Tảo và nấm thì sử dụng saccharose và các polyol, ví dụ như arabitol, glycerol, mannitol,... để đạt được mục đích như vậy. Polyol và acid amin là những dung chất lý tưởng để nâng cao nồng độ thẩm thấu trong tế bào bởi vì chúng không phá hủy cấu trúc và chức năng của enzym. Nhiều vi sinh vật nhân nguyên thủy như Halobacterium salianarium sử dụng K+ để nâng cao nồng độ thẩm thấu trong tế bào, Na+ cũng có tác dụng này nhưng không sử dụng được cao như K+. Các enzyme của Halobacterium cần nồng độ muối cao để duy trì hoạt tính. Động vật nguyên sinh do không có thành tế bào nên phải sử dụng các không bào (vacuoles) để bài xuất phần nước dư thừa khi sống trong môi trường có nồng độ thẩm thấu thấp.

Tác dụng tương hỗ giữa phân tử nước và phân tử dung chất được gọi là hiệu ứng thẩm thấu (osmotic effect) còn hiệu ứng cơ chất (matric effect) là biểu thị các phần tử nước bi hấp phụ (adsorption) trên bề mặt các chất rắn. Hai hiệu ứng này dẫn đến việc giảm sút phần nước có thể dược vi sinh vật sử dụng. Vì nồng độ thẩm thấu trong môi trường có ảnh hưởng sâu sắc đối với vi sinh vật cho nên để định lượng khả năng sử dụng nước các nhà vi sinh vật học thường dùng khái niệm hoạt độ nước aw (water activity aw) để biểu thị tính hữu hiệu của nước. Cũng có thể dùng thế năng nước (water potential) tương quan với aw để biểu thị tính hữu hiệu của nước. Hoạt độ nước của một dung dịch là 1/100 của độ ẩm tương đối của dung dịch này (tính theo %), cũng là tương đương với tỷ lệ giữa áp suất bay hơi của dung dịch này (Psoln) và áp suất bay hơi của nước tinh khiết (Pwater):

Hoạt độ nước của một dung dịch hay một chất răn có thể xác định bằng cách đưa vào một vật chứa kín và đo độ ẩm tương đối sau khi hệ thống đạt tới trạng thái cân bằng (equilibrium). Ví dụ, một mẫu vật sau khi đạt tới trạng thái cân bằng trong hệ thống này mà không khí đạt tới 95% bão hòa, thì cũng tức là không khí chứa 95% độ ẩm khi đạt tới cân bằng ở cùng nhiệt độ với một mẫu nước thuần khiết, hoạt độ nước của mẫu vật này là 0,95%. Hoạt độ nước tỷ lệ nghịch với áp suất thẩm thấu, nếu áp suất thẩm thấu cao thì trị số aw là thấp.

Các vi sinh vật khác nhau có năng lực thích ứng khác nhau rất lớn đối với môi trường có hoạt độ nước thấp (bảng 14.4)

Bảng 14.4: Trị số tương đối về hoạt độ nước (aw) thấp nhất đối với sự sinh trưởng của vi sinh vật (theo A.D. Brown, 1976)

Hoạt độ nước Môi trường Vi khuẩn, Nấm, Tảo

1,00 Nước thuần khiết Phần lớn VK Gram (-) không ưa mặn

0,95 Bánh mỳ Phần lớn trực khuẩn Gram (-) Basidiomycetes Fusarium

Phần lớn Mucor,Rhizopus, Bacillus.

0,90 Đùi gia súc Phần lớn cầu khuẩn, Nấm men có bào tử túi.

0,85 Salami Ý Staphylococcus

0,80 Thực phẩm muối Saccharomyces rouxii (trong muối), Penicillium

0,75 Hồ muối

Cá muối Halobacterium, Aspergillus,

Dunaliella , Actinospora

0,70 Ngũ cốc, kẹo, quả khô Aspergillus

0,60 Sôcôla, mật ong, sữa bột Saccharomyces rouxii (trong đường), Xeromyces bisporus

0,55 ADN bị phá hủy

Có thể kể thêm vài ví dụ khác về trị số aw: máu người- 0,995; quả tươi- 0,97-0,98; nước biển- 0,98; thịt gia súc tươi- 0,97; sirô- 0,90; giăm bông- 0,90; lạp xường- 0,85; mứt quả- 0,80; nước đường bão hòa- 0,76; bột mỳ- 0,65...

Vi sinh vật muốn giữ lượng nước bằng cách duy trì dung chất nội bào ở nồng độ cao khi sinh trưởng trong môi trường có hoạt độ nước thấp sẽ gặp khó khăn khá lớn. Những vi sinh vật có thể tồn tại trong những điều kiện như vậy được gọi là các vi sinh vật chịu áp (osmotolerant). Chúng có thể sinh trưởng được trong một phạm vi nồng độ thẩm thấu hoặc hoạt độ nước khá rộng. Ví dụ , vi khuẩn Staphylococcus aureus có thể nuôi cấy trên môi trường có nồng độ NaCl cao tới 3 mol/L. Chúng cũng có thể thích ứng sinh trưởng trên da người. Nấm men Saccharomyces rouxii có thể sinh trưởng trên dung dịch đường có hoạt độ nước thấp đến 0,6. Tảo lục Dunaliella viridis có thể chịu được nồng độ NaCl cao đến 1,7mol/L hoặc nồng độ bão hòa.

Mặc dầu một số ít vi sinh vật có thể thực sự chịu áp nhưng phần lớn vi sinh vật chỉ có thể sinh trưởng tốt ở hoạt độ nước khoảng 0,98 (tương đương với aw của nước biển) hoặc cao hơn nữa. Lợi dụng điều này người ta sử dụng phương pháp sấy khô hay dùng muối, dùng đường để bảo quản thực phẩm, phòng tạp nhiễm bởi vi sinh vật. Tuy nhiên nhiều nấm chịu áp vẫn có thể làm hư hỏng các thực phẩm đã sấy khô hoặc ướp muối, tẩm đường.

Vi sinh vật ưa mặn (Halophile) hoàn toàn thích ứng với môi trường cao áp (hypertonic), cần nồng độ NaCl cao để sinh trưởng. Phạm vi nồng độ muối cần thiết để sinh trưởng đối với nhóm vi khuẩn ưa mạn cực đoan (extreme halophilic bacteria) là 2,8-6,2 mol/L (nồng độ muối bão hòa). Tại Biển Chết (Dead Sea)- một hồ thấp nhất thế giới nằm giữa Israel và Jordan, và tại hồ Đại Diêm (Great Salt Lake) ở bang Utah (Hoa Kỳ) và tại các môi trường khác có nồng độ muối gần với bão hòa, có thể phân lập được các Cổ khuẩn (archeon) thuộc chi Halobacterium. Chúng cùng các vi khuẩn ưa mặn cực đoan khác không giống với phần lớn các vi sinh vật chịu áp (osmotolerant) ở chỗ không phải là đơn giản thông qua việc nâng cao nồng độ dung chất nội bào, mà chủ yếu là sửa đổi cấu trúc protein và màng của mình để thích ứng với nồng độ muối cao. Những vi khuẩn ưa mặn cực đoan này duy trì nồng độ kali nội bào sao cho áp suất thẩm thấu cao hơn môi trường sống; nồng độ K+ nội bào có thể tới 4-7 mol/L. Các enzym, ribosom và protein vận chuyên của các vi khuẩn này cần nồng độ K+ cao để duy trì tính ổn định và hoạt tính. Ngoài ra nồng độ Na+ cao cũng giúp cho sự ổn định của tế bào và màng sinh chất của vi khuẩn Halobacterium. Nếu nồng độ Na + quá thấp thì thành tế bào và màng sinh chất sẽ hoàn toàn bị phá hủy. Vi khuẩn ưa mặn cực đoan thích ứng thành công với điều kiện môi trường muối cao, nơi có thể tiêu diệt hầu hết các sinh vật khác. Tuy nhiên chúng cũng đã biệt hóa (specialized), mất đi tính linh hoạt (flexibility) sinh thái và chỉ có thể sinh trưởng trong một ít môi trường cực đoan.

14.4.2. pH

pH là số đo hoạt tính ion hydrogen của một dung dịch và đó là số logarit âm của nồng độ ion hydrogen (biểu thị bằng nồng độ phân tử):

pH= -log[H+]= log (1/[H+ ])

Thang pH từ pH 0,0 (1,0 mol H+) đến pH 14,0 (1,0 x 10 -14mol H+). Mỗi đơn vị pH đại biểu cho sự biến đổi 10 lần về nồng độ ion hydrogen. Hình 14.13 cho thấy nơi cư trú mà vi sinh vật có thể sinh trưởng là rất rộng, từ pH rất acid (pH 1-2) đến những hồ hay đất rất kiềm với pH giữa 2 và 10.

pH có ảnh hưởng rõ rệt đối với sự sinh trưởng của vi sinh vật. Mỗi vi sinh vật đều có một phạm vi pH sinh trưởng nhất định và pH sinh trưởng tốt nhất. Vi sinh vật ưa acid (acidophile) có pH sinh trưởng tốt nhất là pH 0-5,5 ; đối với vi sinh vật ưa trung tính là pH 5,5-8,0 ; đối với vi sinh vật ưa kiềm (alkalophile) là pH 8,5-11,5. Vi sinh vật ưa kiềm cực đoan có mức sinh trưởng tối ưu ở pH 10 hay cao hơn nữa. Nói chung, các nhóm vi sinh vật khác nhau đều có phạm vi sinh trưởng riêng của mình. Phần lớn vi khuẩn và động vật nguyên sinh là ưa trung tính. Phần lớn nấm là ưa hơi acid (pH 4-6). Cũng có nhiều trường hợp ngoại lệ. Ví dụ, tảo Cyanidium caldarium và cổ khuẩn Sulfolobus acidocaldarius thường sống trong các suối nước nóng acid, chúng sinh trưởng tốt ở nhiệt độ cao và pH từ 1 đến 3. Cổ khuẩn Ferroplasma acidarmanus và Picrophilus oshimae có thể sinh trưởng ở pH=0 hay rất gần với 0.

Bảng14.5: Thang pH

Mặc dầu vi sinh vật thường có thể sinh trưởng trong một phạm vi pH khá rộng, và xa với pH tốt nhất của chúng, nhưng tính chịu đựng (tolerance) của chúng cũng có giới hạn nhất định. Khi pH trong tế bào chất có sự biến hóa đột ngột sẽ làm phá vỡ màng sinh chất hoặc làm ức chế hoạt tính của enzyme hay proteine chuyển màng, do đó làm tổn thương đến vi sinh vật. Vi sinh vật nhân nguyên thủy bị chết khi pH nội bào giảm xuống thấp hơn 5,0-5,5. Sự biến đổi pH của môi trường sẽ làm thay đổi trạng thái điện ly của phân tử các chất dinh dưỡng, làm hạ thấp khả năng sử dụng chúng của vi sinh vật.

Khi pH trong môi trường có sự biến hóa tương đói lớn thì pH nội bào của phần lớn vi sinh vật vẫn gần trung tính. Nguyên nhân có thể là do tính thấm của H+ qua màng sinh chất là tương đói thấp. Vi sinh vật ưa trung tính thông qua hệ thống vận chuyển đã sử dụng K+ thay cho H+. Vi sinh vật ưa kiềm cực đoan như Bacillus alcalophilus dùng Na+ nội bào thay thế cho H+ của môi trường bên ngoài, giữ cho pH nội bào gần với trung tính. Ngoài ra hệ thống chất đệm nội bào (intering buffering) cũng có vai trò quan trọng trong việc duy trì pH ổn định.

Vi sinh vật phải có năng lực thích ứng với sự biến đổi pH của môi trường thì mới có thể sinh tồn. Đối với vi khuẩn, hệ thống vận chuyển ngược K+/H+ và Na+/H +có thể dùng để khắc phục những biến đổi nhỏ về pH. Nếu pH quá acid các cơ chế sẽ phát huy tác dụng. Lúc pH giảm xuống tới pH 5,5-6,0 vi khuẩn thương hàn (Salmonella typimurium) và Escherichia coli có thể tổng hợp ra một loạt các protein mới và được gọi là một phần của đáp ứng chống chịu acid. ATPase chuyển vị proton được dùng để sản sinh ra nhiều ATP hoặc bơm proton

Ra ngoài tế bào. Nếu pH bên ngoài giảm xuống còn 4,5 hay thấp hơn nữa vi khuẩn sẽ tổng hợp ra các phân tử đi kèm, chẳng hạn như các protein gây sốc acid (acid shock proteins) hay các protein gây sốc nhiệt (heat shock proteins). Chúng được dùng để phòng ngừa sự biến tính acid của các proteín khác và giúp sửa chữa lại các protedins đã bị biến tính.

Vi sinh vật thường sinh ra các chất thải trao đổi chất có tính acid hay kiềm để làm thay đổi pH môi trường sống. Vi sinh vật lên men sử dụng nguồn carbonhydrat để tạo ra các acid hữu cơ. Các vi sinh vật dinh dưỡng hóa năng vô cơ (chemolithotrophs) như Thiobacillus có thể ôxy hóa các hợp chất lưu huỳnh dạng khử để sinh ra acid sulfuric. Một số vi khuẩn khác thông qua việc phân giải các acid amin làm sinh ra NH3 và làm kiềm hóa môi trường.

Người ta thường bổ sung các chất đệm (buffers) vào môi trường nuôi cấy để phòng ngừa sự ức chế quá trình sinh trưởng của vi sinh vật khi pH biến hóa quá lớn. Phosphat là chất đệm thường được sử dụng, điển hình là muối H2PO4- acid yếu và muối HPO42- kiềm yếu :

H+ + HPO42- → H 2PO4-

OH- + H2PO4 - → HPO42- + HOH

Nếu bổ sung H+ vào hệ thống đệm nó sẽ kết hợp với HPO42- để tạo ra acid yếu. Nếu bổ sung OH- vào hệ thống đệm nó sẽ kết hợp với H2PO 4- để tạo thành nước. Như vậy là pH môi trường không bị biến hóa quá lớn. Trong các môi trường phức tạp thì peptid và các acid amin cũng có năng lực đệm (buffering effect) rất mạnh.

14.4.3. Nhiệt độ

Cũng giống như các sinh vật khác, nhiệt độ của môi trường cũng có ảnh hưởng rất lớn đối với vi sinh vật. Trên thực tế, do vi sinh vật thường là các sinh vật đơn bào cho nên chúng rất mẫn cảm với sự biến hóa của nhiệt độ, và thường bị biến hóa cùng với sự biến hóa về nhiệt độ của môi trường xung quanh. Chính vì vậy, nhiệt độ của tế bào vi sinh vật cũng phản ánh trực tiếp nhiệt độ của môi trường xung quanh. Một nhân tố quyết định ảnh hưởng của nhiệt độ đối với sự sinh trưởng của vi sinh vật đó là tính mẫn cảm với nhiệt độ của các phản ứng xúc tác nhờ enzym. Trong phạm vi nhiệt độ thấp, khi nhiệt độ tăng lên sẽ làm tăng tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật, vì phản ứng xúc tác nhờ enzyme cũng giống như các phản ứng hóa học nói chung, khi nhiệt độ tăng lên 100C tốc độ phản ứng sẽ tăng gấp đôi. Vì các phản ứng trong tế bào đều tăng cho nên toàn bộ hoạt động trao đổi chất sẽ tăng lên khi nhiệt độ cao hơn, và vi sinh vật sẽ sinh trưởng nhanh hơn. Lúc nhiệt độ tăng lên đến một mức độ nhất định thì nhiệt độ càng tăng tốc độ sinh trưởng càng giảm. Khi nhiệt độ tăng quá cao vi sinh vật sẽ chết. Khi nhiệt độ quá cao sẽ gây ra sự biến tính của enzym, của các thể vận chuyển (transport carriers) và các protein khác. Màng sinh chất sẽ bị tổn thương vì hai lớp lipid sẽ bị hòa tan. Do đó mặc dầu ở nhiệt độ càng cao các phản ứng xúc tác tiến hành càng nhanh nhưng do các nguyên nhân nói trên mà tế bào bị tổn thương đến mức khó hồi phục và dẫn đến việc ức chế sinh trưởng. Tại điều kiện nhiệt độ rất thấp màng sinh chất bị kết đông lại, enzyme cũng ngừng hoạt động. Nói chung, néu vượt quá nhiệt độ tốt nhất đối với vi sinh vật, chức năng và kết cấu tế bào đều bị ảnh hưởng. Nếu nhiệt độ rất thấp, tuy chức năng chịu ảnh hưởng nhưng thành phần hóa học và kết cấu không nhất thiết chịu ảnh hưởng.

Do ảnh hưởng hai mặt, vừa có lợi vừa có hại của nhiệt độ đối với vi sinh vật mà có thể xác định các loại nhiệt độ cơ bản (cardinal temperaturre) đối với sự sinh trưởng của vi sinh vật. Đó là nhiệt độ thấp nhất (minimum), nhiệt độ tốt nhất (optimum) và nhiệt độ cao nhất (maximum) đối với sự sinh trưởng.

Hình 14.13: Ảnh hưởng của nhiệt độ đối với tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật

(Theo sách của Prescott, Harley và Klein)

Mặc dầu đường biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đối với sinh trưởng của vi sinh vật là phụ thuộc vào từng vi sinh vật, từng điều kiện khác nhau nhưng nhiệt độ tốt nhất thường gần với nhiệt độ cao nhất hơn là so với nhiệt độ thấp nhất. Ba nhiệt độ cơ bản của cùng một loài vi sinh vật không phải là cố định mà thường phụ thuộc vào pH, thức ăn và các nhân tố khác. Chẳng hạn, một loại động vật nguyên sinh có tiên mao là Crithidia fasciculate sống trong đường tiêu hóa của muỗi có thể sinh trưởng trên môi trường đơn giản ở nhiệt độ 22-270C nhưng ở nhiệt độ 33-340C thì lại không sinh trưởng được nếu không bổ sung vào môi trường ion kim loại, acid amin, vitamin và lipid.

Nhiệt độ cơ bản của các vi sinh vật khác nhau là khác nhau rất nhiều. Nhiệt độ tốt nhất có thể thấp từ 00C đến cao tới 750C. Nhiệt độ thấp nhất để sinh trưởng có thể đến -20 0C. Nhiệt độ cao nhất có thể vượt quá 1000C. Nhân tố chủ yếu quyết định phạm vi sinh trưởng này có thể là nước. Ngay trong điều kiện tối cực đoan thì vi sinh vật cũng cần có nước ở trạng thái dịch thể mới có thể sinh trưởng. Đối với số đông vi sinh vật thì phạm vi nhiệt độ sinh trưởng thường trong khoảng 30 0C. Một số vi sinh vật (như Cầu khuẩn lậu - Nesseria gonorrhoeae) có phạm vi nhiệt độ sinh trưởng rất hẹp. Trong khi đó cũng có những vi sinh vật (như Enterococcus facalis) lại có phạm vi nhiệt độ sinh trưởng rất rộng. Nhiệt độ sinh trưởng cao nhất là khác nhau giữa các nhóm lớn vi sinh vật. Nhiệt độ sinh trưởng cao nhất đối với động vật nguyên sinh (protozoa) là 500C. Một số tảo và nấm có thể sinh trưởng ở nhiệt độ cao tới 55-60 0C. Một số vi sinh vật nhân nguyên thủy có thể sinh trưởng ở 1000C (nhiệt độ nước sôi) hay gần như vậy. Gần đây người ta còn phát hiện thấy có những vi sinh vật sinh trưởng được ở cả những điều kiện nhiệt độ cao hơn 1000C. Đã có các thông báo cho biết đã phát hiện thấy các vi sinh vật nhân nguyên thủy tại dịch phun giàu sulphid (black smoker) ở vết nứt dưới đáy biển - nơi nhiệt độ nước cao tới 3500C. Những vi sinh vật này sinh trưởng, phát triển rất tốt ở nhiệt độ 113 0C và còn có thể sinh trưởng, phát triển ở nhiệt độ cao hơn nữa. Áp suất cao ở miệng núi lửa dưới đáy biển làm cho nước ở nhiệu độ siêu cao vẫn tồn tại ở trạng thái dịch thể (ở áp suất 265 atm nước biển sẽ sôi ở 4600C). Phát hiện này cho thấy protein, màng, acid nucleic của các vi sinh vật này có tính kháng nhiệt rất cao. Đây là những vật liệu rất tốt giúp cho việc nghiên cứu cơ chế ổn định của màng và các cao phân tử sinh học. Tương lai có thể nghĩ đến khả năng thiết kế các enzyme có thể phát huy tác dụng trong những điều kiện rất cao. Những enzyme bền nhiệt từ các vi sinh vật này sẽ có những ứng dụng rất quan trọng trong công nghiệp và trong nghiên cứu khoa học. Chẳng hạn men Taq polymerase nhận được từ cổ khuẩn Thermus aquaticus đã được ứng dụng rộng rãi trong phản ứng chuỗi polymerase. Rõ ràng là vi sinh vật nhân nguyên thủy có thể sinh trưởng được ở những nhiệt độ cao hơn vi sinh vật nhân thật. Đó là vì vi sinh vật nhân thật không có thể tạo ra được các màng cơ quan tử có chức năng tương ứng ở điều kiện nhiệt độ cao hơn 600C. Ngoài ra các cơ quan quang hợp cũng hầu như không ổn định như vậy và do đó không phát hiện thấy có sự sinh trưởng của các vi sinh vật quang hợp trong môi trường nhiệt độ rất cao. Căn cứ vào phạm vi nhiệt độ sinh trưởng có thể chia vi sinh vật thành 5 nhóm.

Bảng 14.6: Phạm vi nhiệt độ (NĐ) đối với sự sinh trưởng của vi sinh vật

Vi sinh vật NĐ thấp nhất NĐ tốt nhất NĐ cao nhất

VSV không quang hợp

Bacillus psychrophilus -10 23-34 28-30

Micrococcus cryophilus -4 10 24

Psedomonas fluorescens 4 25-30 40

Staphylococcus aureus 6,5 30-37 46

Enterococcus faecalis 0 37 44

Escherichia coli 10 37 45

Neisseria gonorrhoeae 30 35-36 38

Thermoplasna acidophilum 45 59 62

Bacillus stearothermophilus 30 60-65 75

Thermus aquaticus 40 70-72 79

Sulfolobus acidocaldarius 60 80 85

Pyrococcus abyssi 67 96 102

Pyrodictium occultum 82 105 110

Pyrolobus fumarii 90 106 113

Vi khuẩn quang hợp và vi khuẩn lam

Rhodospirillum rubrum - 30-35 -

Anabaena variabilis - 35 -

Osillatoria tenuis - - 45-47

Synechococcus eximius 70 79 84

Tảo nhân thật

Chlamydomonas nivalis -36 0 4

Fragilaria sublinearis -2 5-6 8-9

Chlorella pyrenoidosa - 25-26 29

Euglena gracilis - 23 -

Skeletonema costatum 6 16-26 >28

Cyanidium caldarium 30-34 45-50 56

Nấm

Candida scottii 0 4-15 15

Saccharomyces cerevisiae 1-3 28 40

Mucor pusillus 21-23 45-50 50-58

Động vật nguyên sinh

Amoeba proteus 4-6 22 35

Naegleria fowleri 20-25 35 40

Trichomonas vaginalis 25 32-39 42

Paramecium caudatum 25 28-30

Tetrahymena pyriformis 6-7 20-25 33

Cyclidium citrullus 18 43 47

Vi sinh vật ưa lạnh (Psychrophile): Đó là các vi sinh vật có thể sinh trưởng ở 00C, sinh trưởng tốt nhất ở 150 C hay thấp hơn, nhiệt độ cao nhất chỉ là khoảng 20 0C. Tại Nam cực và Bắc cực dễ dàng phân lập các vi sinh vật thuộc nhóm này. Vì có tới 90% nước biển thấp hơn hay bằng 50C nên tại đó có lượng lớn các vi sinh vật ưa lạnh. Chlamydomonas nivalis là một loài tảo ưa lạnh, chúng sinh bào tử màu đỏ tươi làm cho khối băng tuyết có màu phấn hồng (pink). Phần lớn vi khuẩn ưa lạnh thuộc về các chi Pseudomonas, Vibrio, Alcaligenes, Bacillus, Arthrobacter, Moritella, Photobacterium, và Shewanella. Cổ khuẩn Methanogenum ưa lạnh gần đây đã được phân lập tại hồ Ace ở Châu Nam cực.Vi sinh vật ưa lạnh thông qua nhiều loại phương thức để thích ứng được với môi trường lạnh. Chúng phát huy cơ chế rất tốt để tổng hợp protein, enzym, các hệ thống vận chuyển. Màng tế bào của vi sinh vật ưa lạnh có chứa nhiều các acid béo không bão hòa, có thể giữ được trạng thái chất bán lưu (semifluid) khi gặp lạnh. Tuy nhiên nhiều vi sinh vật ưa lạnh ở nhiệt độ cao hơn 200C màng tế bào sẽ bị phá hại.

Nhiều vi sinh vật sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ 20-300 C, nhiệt độ cao nhất là cao hơn 350C, nhưng chúng vẫn có thể sinh trưởng trong điều kiện 0-70C.Chúng thuộc về nhóm ưa lạnh không bắt buộc (Psychrotrophs hay facultative psychrophiles). Những vi khuẩn và nấm thuộc nhóm này là nguyên nhân chính làm hư hỏng thực phẩm giữ lạnh.

Vi sinh vật ưa ấm (Mesophile): Đó là các vi sinh vật sinh trưởng tốt nhất ở 20-450C, nhiệt độ sinh trưởng thấp nhất là 15-200C. Nhiệt độ sinh trưởng cao nhất là khoảng 45 0C hoặc thấp hơn. Phần lớn vi sinh vật là thuộc về nhóm này. Hầu như mọi vi khuẩn gây bệnh cho người đều là vi sinh vật ưa ấm, bởi vì thân nhiệt của người là 37 0C.

Hình 14.14 :Phạm vi nhiệt độ sinh trưởng của vi sinh vật

(Theo sách của Prescott, Harley và Klein).

Vi sinh vật ưa nhiệt (Thermophile): Đó là các vi sinh vật sinh trưởng được ở nhiệt độ 550C hay cao hơn nữa. Nhiệt độ sinh trưởng tốt nhất đối với chúng là 33-650C. Thành phần chủ yếu của nhóm này là vi khuẩn (chủ yếu là xạ khuẩn), một ít tảo và nấm (bảng 14.6). Chúng phát triển trong đống phân chuổng ủ, dưới đáy các cột rơm rạ hay cỏ khô, trong đường dẫn nước nóng, trong các suối nước nóng...Vi sinh vật ưa nóng khác với vi sinh vật ưa ấm ở chỗ chúng có hệ thống tổng hợp enzyme và protein bền nhiệt (heat-stable) và có thể hoạt động ở nhiệt độ cao. Màng sinh học của chúng có lipid bão hòa ở mức cao, có điểm sôi cao hơn và vì vậy vẫn giữ được nguyên vẹn ở nhiệt độ cao.

Có một số ít các vi sinh vật ưa nhiệtcó thể sinh trưởng ở nhiệt độ 900C hay cao hơn. Nhiệt độ sinh trưởng cao nhất là 100 0C. Người ta xếp các vi sinh vật có nhiệt độ sinh trưởng tốt nhất ở 80-1130C vào nhóm Vi sinh vật ưa siêu nóng (Hyperthermophiles). Chúng thường không thể sinh trưởng bình thường ở nhiệt độ thấp hơn 550C. Vi khuẩn Pyrococcus abyssi và Pyrodictium occultum là ví dụ về những vi sinh vật ưa siêu nhiệt được tìm thấy ở những đáy biển nóng.

14.4.4. Nồng độ oxygen

Các vi sinh vật sinh trưởng trong điều kiện có oxygen được gọi là vi sinh vật hiếu khí (aerobe), còn các vi sinh vật sinh trưởng trong điều kiện không có oxygen được họi là các vi sinh vật kỵ khí (anaerobe). Hầu hết các cơ thể đa bào đều phải cần sinh trưởng trong điều kiện có oxygen, chúng là các sinh vật hiếu khí bắt buộc (obligate aerobes). Oxygen làchất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi vận chuyển điện tử khi hô hấp hiếu khí. Ngoài ra, các vi sinh vật nhân thật (eucaryotes) hiếu khí còn dùng oxygen để tổng hợp sterol và các acid béo không bão hòa. Các vi sinh vật kỵ khí không bắt buộc (facultative anaerobes) không cần oxygen để sinh trưởng nhưng khi có oxygen thì sinh trưởng tốt hơn. Khi có oxygen chúng sử dụng phương thức hô hấp hiếu khí. Các vi sinh vật kỵ khí chịu oxygen (aerotolerant anaerobes) như vi khuẩn Enterococcus faecalis có thể sinh trưởng như nhau trtong điều kiện có oxygen cũng như không có oxygen. Ngược khuẩn Bacteroides, Fusobacterium, Clostridiun pasteurianum, Methanococcus.... sẽ bị chết khi có oxygen.

Hình 14.15: Oxygen và sự sinh trưởng của vi khuẩn

Chú thích: Các nhóm vi sinh vật xem trong bài

Mỗi chấm biểu hiện khuẩn lạc của vi khuẩn trong hay trên bề mặt môi trường. SOD và catalase là biểu thị vi khuẩn có tồn tại enzyme superoxide dismutase và catalase hay không?(Theo sách của Prescott,Harley và Klein)

Vi sinh vật kỵ khí chịu oxygen và vi sinh vật kỵ khí bắt buộc không sinh năng lượng thông qua quá trình hô hấp, chúng thu được năng lượng thông qua quá trình lên men hay hô hấp kỵ khí (anaerobic respiration). Sau cùng, phải kể đến nhóm vi sinh vật vi hiếu khí (microaerophiles), chúng không sinh trưởng được trong điều kiện không khí bình thường (20% O2) và cần sinh trưởng trong điều kiện nồng độ O2 khoảng 2-10% Quan hệ giữa vi sinh vật và oxygen có thể xác định bằng một thí nghiệm đơn giản nha sau: nuôi cấy vi sinh vật trong ống nghiệm chứa môi trường đặc hoặc môi trường đặc biệt như môi trường chứa thioglycollate (là chất khử làm giảm nồng độ oxygen trong môi trường).

Cùng một nhóm vi sinh vật có thể có nhiều loại quan hệ khác nhau với O2. Cả 5 loại hình đều có thể thấy ở vi sinh vật nhân nguyên thủy (prpcaryotes) và động vật nguyên sinh. Nấm thường là hiếu khí, chỉ trừ một số loài đặc biệt, nhất là nấm men, thuộc loại kỵ khí không bắt buộc. Tảo hầu như đều thuộc loại hiếu khí bắt buộc. Đáng chú ý là năng lực có thể sinh trưởng cả trong môi trườnghiếu khí lẫn môi trường kỵ khí làm cho vi sinh vật có tính linh hoạt cao và đó chính là một loại ưu thế sinh thái học.

Mặc dầu O2 có thể làm chết các vi sinh vật kỵ khí bắt buộc, nhưng trong môi trường hiếu khí vẫn có thể phân lập được chúng. Đó là do chúng thường sống chung với loại kỵ khí không bắt buộc và bọ này tiêu thụ hết O2 , tạo nên môi trường kỵ khí cục bộ giúp cho vi sinh vật kỵ khí bắt buộc có thể sinh trưởng được. Ví dụ trong khoang miệng vi khuẩn kỵ khí bắt buộc Bacteroides gingivalis có thể sinh trưởng được trong các khe kỵ khí quanh răng.

Sự khác biệt trong quan hệ của vi sinh vật với O2 do nhiều nguyên nhân khác nhau, bao gồm việc bất hoạt của protein và tác dụng độc hại của O2 trong điều kiện hiếu khí. Các enzyme có thể bị bất hoạt khi các nhóm mẫn cảm như sulfhydryls bị oxy hóa. Chẳng hạn như enzyme cố định đạm nitrogenase là loại rất mẫn cảm với O 2 ¬.

Vì hai điện tử bên ngoài của oxygen không thành cặp do đó rất dễ tiếp nhận điện tử và bị khử. Flavoprotein, một số thành phần tế bào khác và sự bức xạ đều có thể thúc đẩy việc khử oxy, tạo thành các sản phẩm khử như gốc tự do superoxide, hydrogen peroxide, gốc hydroxyl.

O2 + e- → O2- (gốc tự do superoxide)

O2 + e- + 2H+ → H 2O2 (hydrogen peroxide)

O2 + e- + H+ → H 2O + OH¬¬-(gốc hydroxyl)

Các sản phẩm khử oxy này là cực kỳ có hại vì chúng là các chất oxy hóa mạnh và phá hủy nhanh chóng các thành phần tế bào. Vi sinh vật nào phải có năng lực tự chống lại được các sản phẩm khử này mới tránh khỏi bị tiêu diệt. Bạch cầu trung tính (neutrophils) và đại thực bào (macrophage) đã lợi dụng các sản phẩm độc hại này để tiêu diệt các vi sinh vật gây bệnh xâm nhập cơ thể.

Nhiều vi sinh vật sinh ra các enzyme để chống lại các sản phẩm khử độc hại này. Vi khuẩn hiếu khí bắt buộc và vi khuẩn kỵ khí không bắt buộc thường chứa các enzyme như superoxide dismutase (SOD) và catalase, chúng phân biệt xúc tác việc phá hủy gốc superoxide và hydrogen peroxide. Peroxidase cũng có thể dùng để phá hủy hydrogen peroxide:

2O2∙- + 2H+ →→superoxide dismutase→→ O2 + H 2O

2H2O2→→catalase→→ 2H 2O + O 2

H2O2 + NADH + H+→→peroxidase→→ 2H2O + NAD +

Vi sinh vật kỵ khí chịu oxygen có thể thiếu catalase nhưng hầu hết luôn có superoxide dismutase. Vi khuẩn kỵ khí chịu oxygen Lactobacillus plantarum dùng ion Mn2+ thay thế SOD đểđể phân giải gốc tự do của superoxide. Tất cả các vi sinh vật kỵ khí bắt buộc đều không có hai loại enzyme nói trên hoặc có với nồng độ rất thấp và do đó không có năng lực chống chịu được với oxygen.

Vì vi sinh vật hiếu khí cần O2, trong khi vi sinh vật kỵ khí lại bị chết vì O2, cho nên việc nuôi cấy hai nhóm này phaỉ bằng các phương pháp hoàn toàn khác nhau. Lúc nuôi cấy khối lượng lớn vi sinh vật hiếu khí phải nuối cấy trên máy lắc hay phải thổi không khí vô khuẩn vào bình (hay nồi) nuôi cấy . Còn khi nuôi cấy vi khuẩn kỵ khí thì phải loại bỏ hết O2. Có thể dùng các phương pháp sau đây:

- Sử dụng môi trường kỵ khí đặc biệt, có chứa các chất khử như thioglycolate hay cysteine. Khi chế tạo môi trường cần đun lên để làm tan các thành phần và cũng đồng thời loại trừ hết O 2 hòa tan trong môi trường. Khi đó vi sinh vật kỵ khí có thể mọc được lên trên bề mặt môi trường.

- Nuôi cấy trong các tủ nuôi cấy kỵ khí (anaerobic work chamber) đã hút chân không và bổ sung bằng khí nitrogen. Thường còn cần bổ sung cả khí CO2 bởi vì nhiều vi khuẩn kỵ khí sinh trưởng tốt khi có tồn tại một lượng nhỏ khí CO2 .

- Một phương pháp rất phổ biến khi nuôi cấy một lượng nhỏ vi sinh vật kỵ khí là dùng bình kỵ khí (Gas Pak jar). Trong hệ thống này lợi dụng H2 và chất xúc tác palladium để làm cho O2 kết hợp với H2 tạo thành nước để không cò O 2 trong môi trường. Các chất khử đưa vào môi trường thạch cũng có thể giúp loại bỏ O2.

- Có thể dùng túi nhựa để tạo ra các môi trường kỵ khí khi nuôi cấy một lượng nhỏ các vi sinh vật kỵ khí. Trong túi nhựa chứa CaCO3 và chất xúc tác để tạo ra điệu kiện kỵ khí giàu CO 2. Một dung dịch đặc biệt được đưa vào túi nhựa sau đó đưa hộp lồng (hộp Petri) hay các dụng cụ nuôi cấy khác vào và hàn kín túi nhựa lại.

Tùy từng trường hợp cụ thể mà sử dụng các phương pháp nuôi cấy kỵ khí khác nhau.

Hình 14.17: Nuôi cấy vi sinh vật kỵ khí trong các bình kỵ khí.

(Theo sách của Prescott,Harley và Klein).

14.4.5 Áp suất (Pressure)

Phần lớn vi sinh vật có thể sống trên lục địa hay trên bề mặt nước, là những nơi có áp suất không khí là 1 atm (atmosphere) và không chịu ảnh hưởng rõ rệt gì của áp suất này.Nhưng đáy biển (nơi có độ sâu 1000m trở lên) lại chiếm đến 75% thể tích đại dương. Ở những nơi đóp áp suất cao đến 600-1000m, nhiệt độ lạnh tới 2-3 0C. Trong môi trường cực đoan (extreme) như vậy vẫn có một số vi sinh vật thích ứng để tồn tại. Phần lớn thuộc về nhóm chịu áp (barotolerant). Tuy áp suất tăng lên cao sẽ có ảnh hưởng đến chúng, nhưng ảnh hưởng bất lợi này nhỏ hơn nhiều khi so với các vi sinh vật không chịu áp (nontolerant). Một số vi khuẩn sống trong đường tiêu hóa của những động vật không xương sống ở dưới biển sâu (như amphipods và holothurians) là những vi khuẩn ưa áp (barophilic). Chúng sinh trưởng càng nhanh trong điều kiện áp suất cao. Chúng có vai trò quan trọng trong vòng tuần hoàn các chất dinh dưỡng dưới đáy biển. Tại khe biển Mariana gần Philippine (sâu khoảng 10 500m) người ta đã phân lập được những vi khuẩn ưa áp có thể sinh trưởng trong điều liện 20C với áp suất khoảng 400-500atm. Những vi khuẩn này hiện đã biết là thuộc về các chi Photobacterium, Shewanella, Colwellia...Một số thuộc về Cổ khuẩn vừa ưa áp vừa ưa nhiệt (thermobarophiles), chẳng hạn như Pyrococcus spp., Methanococcus jannasschi...

14.4.6. Bức xạ (Radiation)

Thế giới mà chúng ta đang sống đầy các loại bức xạ điện từ trường (electromagnetic radiation). Các bức xạ này hình thành như sóng trên mặt nươc và lan truyền trong không khí. Cự ly giữa hai đỉnh sóng hay cuối sóng được gọi là độ dài sóng (wavelength). Khi độ dài sóng giảm đi thì thì năng lượng bức xạ tăng lên. Tia gamma hay tia X có năng lượng cao hơn bức xạ của ánh sáng nhìn thấy (ánh sáng khả kiến) hay tia hồng ngoại. Bức xạ điện từ trường còn giống như một dòng năng lượng hợp bởi các photon (quang tử). Mỗi photon đều có năng lượng nhất định, năng lượng cao hay thấp quyết định bởi độ dài sóng của bức xạ.

Ánh sáng mặt trời là nguồn bức xạ chủ yếu trên trái đất, bao gồm ánh sáng khả kiến (visible light), tia tử ngoại (ultraviolet), tia hồng ngoại (infraded rays) và sóng radio (vô tuyến điện). Ánh sáng khả kiến là loại thường thấy và quan trọng nhất trong môi trường chung quanh chúng ta: mọi sự sống đều phụ thuộc vào các cơ thể có khả năng quang hợp dựa vào năng lượng của mặt trời. Bức xạ mặt trời có 60% nằm ở vùng tia hồng ngoại chứ không phải ở vùng ánh sáng khả kiến. Tia hồng ngoại là nguồn nhiệt lượng chủ yếu của trái đất. Ở tầm mặt biển chỉ thấy có rất ít bức xạ tử ngoại 290-300nm (nanometre). Tia tử ngoại có bước sóng thấp hơn 287nm hấp thụ bởi oxygen trong không khí và tạo ra tầng ozone (O3) ở độ cao cách mặt đất khoảng 25-50km. Tầng ozone hấp thụ các tia tử ngoại bước sóng tương đối dài và giải phóng ra O2 . Bởi vì tia tử ngoại rất có hại cho sinh vật nên việc tầng ozone tiêu trừ bớt tia tử ngoại là có tác dụng rất quan trọng đối với sự sống trên trái đất. Vì các loại bước sóng trong ánh sáng mặt trời phân bố đồng đều trong phạm vi ánh sáng khả kiến cho nên ta thấy ánh sáng mặt trời cơ bản có màu "trắng".

Nhiều bức xạ điện từ trường là rất có hại đối với vi sinh vật, nhất là các bức xạ có bước sóng ngắn, cao năng lượng là các bức xạ ion hóa (ionizing radiation), chúng làm nguyên tử mấtđi điện tử (electron) hoặc ion hóa (ionize). Có hai loại bức xạ ion hóa. Một là, tia X tạo ra bởi con người, hai là,tia gamma ( tia γ) sinh ra trong quá trình tan rã các đồng vị phóng xạ (radioisotope). Bức xạ ion hóa mức thấp sẽ làm sản sinh các đột biến (mutations) và gián tiếp làm chết vi sinh vật. Bức xạ ion hóa cao sẽ trực tiếp giết chết vi sinh vật. Mặc dầu vi sinh vật có tính đề kháng cao hơn về các bức xạ ion hóa so với các sinh vạt khác, nhưng với liều lượng đủ cao chúng sẽ giết hết vi sinh vật. Chính vì vậy có thể dùng bức xạ ion hóa để diệt khuẩn. Tuy vậy, một số sinh vật nhân nguyên nthủy (như vi khuẩn Deinococcus radiodurans và các vi khuẩn sinh vật sinh bào tử) có thể vẫn tồn tại được ngay cả ở các mức bức xạ ion hóa khá cao.

Bức xạ ion hóa gây cho tế bào rất nhiều biến hóa, có thể phá vỡ liên kết hudrogen, oxy hóa liên kết đôi, phá hủy cấu trúc vòng, cao phân tử hóa một số phân tử.Oxygen có thể làm tăng các hiệu ứng này, có thể là do việc sản sinh gốc tự do hydroxyl (OH-)... Mặc dầu có rất nhiều thành phần tế bào chịu ảnh hưởng, nhưng nguyên nhân quan trọng nhất gây chết là sự phá hủy ADN.

Vì bước sóng ngắn (10-400nm) có năng lượng cao cho nên bức xạ tử ngoại (Ultraviolet radiation) có thể tiêu diệt các loại vi sinh vật. Bức xạ tử ngoại (UV) mạnh nhất ở bước sóng 260nm. Chúng dễ bị ADN hấp thụ, làm cho trên 1 sợi đơn ADN hình thành những song phân tử (dimers) thymine, chúng làm ức chế quá trình tái tạo (replication) và công năng của ADN. Thiệt hại này có thể được sửa chữa qua một số con đường. Theo con đường quang hoạt hóa một loại enzyme quang hoạt hóa sử dụng ánh sáng xanh lam để tách song phân tử thymine. Trong hoạt hóa tối một đoạn ngắn ADN có chứa các song phân tử thymine có thể bị cắt rời và đổi chỗ để thành một đoạn ADN bình thường. Thiệt hại này cũng có thể sửa chữa nhờ các protein recA trong quá trình tái tổ hợp (recombination) hoặc quá trình SOS. Thiệt hại không có thể được khắc phục nếu như liều lượng UV quá lớn, tạo nên những tổn thất quá nặng.

Mặc dầu bức xạ UV quá nhỏ (thấp hơn 290 và 300nm) khó có thể lọt xuống bề mặt trái đất, bức xạ UV nhưng bước sóng 325-400nm cũng có thể gây hại cho vi sinh vật. Chúng phân cắt tryptophan thành những quang sản phẩm (photoproducts) độc hại. Những sản phẩm này tác dụng đồng thời với các bức xạ gần tử ngoại làm phá vỡ sợi ADN. Cơ chế cụ thể của tác dụng này không giống với cơ chế tác dụng của UV với bước sóng 260nm.

Ánh sáng khả kiến là nguồn năng lượng chủ yếu của quá trình quang hợp.

(photosynthesis) vì vậy rất cần cho các sinh vật. Nhưng nếu ánh sáng khả kiến quá mạnh sẽ có thể gây hại hay làm chết vi sinh vật. Tham gia vào quá trình này có một loại sắc tố gọi là chất quang mẫn (photosensitizers) và oxygen. Các sắc tố ở vi sinh vật như chlorophyll, bacteriochlorophyll, cytochromes,và flavin có thể hấp thụ ánh sáng mặt trời và bị kích hoạt tạo ra các chất quang mẫn. Các chất quang mẫn (P) khi bị kích hoạt có thể chuyển năng lượng cho O2 để làm ra oxygene đơn - singlet oxygen ( ﺍ O2).

Ánh sáng

P-------→ P (hoạt tính)

P hoạt tính + O2 -→ P + O 2

Oxygenđơn là chất có hoạt tính rất mạnh, là chất oxy hóa mạnh có thể phá hủy nhanh chóng tế bào, chúng cũng là nhân tố chủ yếu được các đại thực bào (phagocytes) dùng để diệt khuẩn.

Hình 14.18: Phạm vi bước sóng của các bức xạ điện từ trường - Phần ánh sáng khả kiến được trình bầy phía dưới. (Theo sách của Prescott,Harley và Klein).

Nhiều vi sinh vật trong không khí hoặc sống trên bề mặt các vật tiếp súc với không khí sử dụng sắc tố carotenoid để bảo vệ chống lại với quang oxy hóa (photooxidation). Carotenoid có thể làm phá hủy các oxygen đơn, hấp thu năng lượng của oxygen đơn và biến thành trạng thái phi hoạt tính. Cả các vi sinh vật quang hợp lẫn vi sinh vật không quang hợp đều sử dụng sắc tố vào mục đích này.

14.5. SỰ SINH TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT TRONG MÔI TRƯỜNG TỰ NHIÊN

14.5.1. Các nhân tố của môi trường làm hạn chế sự sinh trưởng

Môi trường sinh sống của vi sinh vật là phức tạp và thường xuyên biến đổi.Vi sinh vật đặc trưng cho mỗi môi trường cụ thể bị bao bọc bởi sự biến đổi của các chất dinh dưỡng và các nhân tố môi trường khác. Đúng là vi sinh vật đã sinh trưởng trong một màng sinh học (biofilm). Vi sinh vật sinh trưởng trong một "vi môi trường" (microenvironments) cho đến khi môi trường hay các nhân tố dinh dưỡng đạt tới sự sinh trưởng giới hạn. Nguyên tắc lượng tối thiểu của Liebig xác định rằng: tổng sinh khối của một cơ thể quyết định bởi sự có mặt của chất dinh dưỡng với nồng độ thấp nhất theo nhu cầu của cơ thể. Nguyên tắc này có thể phù hợp cho điều kiện phòng thí nghiệm cũng như trong môi trường đất và nước. Sự tăng lên của một nhân tố dinh dưỡng cần thiết (chẳng hạn như phosphate) sẽ làm tăng lên quần thể vi sinh vật cho đến khi một số nhân tố dinh dưỡng khác trở thành nhân tố giới hạn. Nếu một chất dinh dưỡng nào đó là giới hạn thì tăng các nhân tố dinh dưỡng khác không có ích lợi gì. Tình hình thực tế còn phức tạp hơn thế nữa. Nhiều nhân tố giới hạn có thể ảnh hưởng thường xuyên lên quần thể vi sinh vật, chẳng hạn như nhiệt độ, pH, ánh sáng, nồng độ muối... Định luật chống chịu của Shelford (Shelford's law of tolerance) xác định: vi sinh vật có một yêu cầu nhất định đối với các nhân tố môi trường, Thấp hay cao hơn yêu cầu này thì vi sinh vật không thể tồn tại và sinh trưởng mặc dầu vẫn có đầy đủ các chất dinh dưỡng. Chẳng hạn mỗi vi sinh vật có một phạm vi nhiệt độ sinh trưởng nhất định. Cũng tương tự như vậy đối với pH, nồng độ oxygen, nồng độ muối... Sự sinh trưởng của vi sinh vật phụ thuộc vào cả sự cung cấp chất dinh dưỡng lẫn khả năng chống chịu với các điều kiện của môi trường.

Khi vi sinh vật có đủ điều kiện dinh dưỡng để sinh trưởng mạnh mẽ thì cũng đồng thời sinh ra các chất thải có hại và làm hạn chế sự sinh trưởng của chúng.

Đáp ứng với mức dinh dưỡng thấp (môi trường nghèo - oligotrophic environments) và có sự cạnh tranh, nhiều vi sinh vật đã chiếm đoạt thức ăn và khai thác chúng để làm nguồn cạnh tranh. Vi sinh vật thường biến đổi hình thái để làm tăng bề mặt và năng lực hấp thu chất dinh dưỡng. Các vi sinh vật nhân nguyên thủy hình que biến thành dạng "mini" hay "ultramini" (siêu nhỏ) hoặc mọc ra các cái cuống (prosthecate) để đáp ứng với tình trạng thiếu thức ăn. Sự thiếu hụt chất dinh dưỡng sẽ dẫn đến nhiều biến đổi ở vi sinh vật, chẳng hạn chúng có thể từng bước khép lại hoạt động của các gen liên quan đến trao đổi chất , trừ việc duy trì "gen quản gia" (housekeeping gene).

Nhiều nhân tố có thể làm cải biến mức dinh dưỡng trong môi trường nghèo. Chẳng hạn vi sinh vật có thể tách các chất dinh dưỡng hạn chế ra (như là sắt) khiến không còn sắt để cạnh tranh nữa. Không khí cũng có thể cung cấp chất dinh dưỡng giúp cho sự sinh trưởng của vi sinh vật. Điều này có thể thấy được trong phòng thí nghiệm cũng như ngoài thiên nhiên. Đã phát hiện thấy chất hữu cơ trong không khí có thể xúc tiến sự sinh trưởng của vi sinh vật trên môi trường pha loãng (dilute media). Môi trường sinh trưởng được làm giàu bằng chất hữu cơ trong không khí cũng có thể làm tăng rõ rệt sự phát triển của quần thể vi sinh vật. Ngay trong nước cất- thường chứa dấu vết chất hữu cơ, cũng có thể hấp thu những hợp chất 1 carbon từ không khí để giúp cho sự sinh trưởng vủa vi sinh vật. Sự tồn tại các chất dinh dưỡng trong không khí và tình trạng sinh trưởng của vi sinh vật, nếu không xem xét đến sẽ có thể ảnh hưởng đến các thực nghiệm về sinh hóa học hay sinh học phân tử, cũng như các nghiên cứu về sự sinh trưởng của vi sinh vật trong các môi trường dinh dưỡng nghèo (oligotrophic).

Các chất tự nhiên (natural substances) cũng có thể ức chế trực tiếp tới sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật trong các môi trường dinh dưỡng thấp. Các chất đó bao gồm phenol, tannin, ammonia, ethylene, và các hợp chất lưu huỳnh bay hơi. Đây có thể là một phương thức giúp vi sinh vật tránh tận dụng các năng lượng giới hạn trước khi được cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết. Các hóa chất này là rất quan trọng trong bệnh lý học thực vật và có thể giúp khống chế các bệnh vi sinh vật trong đất.

14.5.2. Kiểm tra số lượng vi sinh vật nhân nguyên thủy tuy sống nhưng không nuôi cấy được

Khi nghiên cứu sự sinh trưởng của quần thể vi sinh vật nhân nguyên thủy (procariotic) trong thiên nhiên bên ngoài phòng thí nghiệm cần phải xác định số lượng vi sinh vật sống. Trong lịch sử vi sinh vật học thường người ta định nghĩa vi sinh vật sống là có thể sinh trưởng, có thể hình thành khuẩn lạc (colony) hoặc tạo ra độ đục rõ rệt trên môi trường dịch thể. John R.Postgate ở Đại học Sussex (nước Anh) là một trong những học giả đầu tiên xác định vi sinh vật chịu ức chế (stressed) khi sống trong môi trường thiên nhiên, hoặc trong nhiều môi trường phòng thí nghiệm đặc biệt, là đặc biệt mẫn cảm với các ức chế thứ sinh (secondary stresses). Các ức chế này làm cho vi sinh vật tuy sống nhưng không có thể tạo thành khuẩn lạc trên các môi trường đặc bình thường vẫn dùng để nuôi cấy chúng. Để xác định được sự sinh trưởng của các vi sinh vật này Postgate đưa ra một phương pháp thực nghiệm gọi là thí nghiệm vi hoạt tính Postgate (Postgate Microviability Assay). Trong thí nghiệm này đem vi sinh vật nuôi cấy trên lớp mặt thạch mỏng dưới lá kính (coverslip), làm cho chúng không qua được giai đoạn sinh trưởng đơn bào mà chỉ biến đổi hình thái tế bào, coi đó là biểu hiện tín hiệu sống (life sign)

Từ đó, nhiều nhà nghiên cứu phát triển các phương pháp hiển vi mẫn cảm và phương pháp chất đồng vị để xác định sự tồn tại và ý nghĩa của dạng vi khuẩn sống nhưng không nuôi cấy được. Chảng hạn dùng kháng thể huỳnh quang và thuốc nhuộm acridine orange để dánh giá mức độ số lượng; hoặc là dùng phương pháp số lượng khả năng tối đa (MPN-most probable number)...Việc sử dụng chỉ số giải phóng hoạt tính phóng xạ của vật chất tế bào cũng được dùng để xác định ảnh hưởng của hiệu ứng ức chế đối với vi sinh vật. Các phương pháp do Postgate đề ra là rất quan trọng. Nhiều nghiên cứu cho thấy có khi một số vi khuẩn như Escherichia coli, Vibrio cholerae, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes, Enterococcus faecalis mất năng lực sinh trưởng trên các môi trường phòng thí nghiệm theo các kỹ thuật nuôi cấy tiêu chuẩn, nhưng chúng vẫn giữ vai trò gây bệnh truyền nhiễm.

Tình trạng một quần thể hỗn hợp trong môi trường thiên nhiên là rất phức tạp. Thông thường chỉ có khoảng 1-10% các tế bào là có thể hình thành khuẩn lạc. Trong tương lai có thể phải tìm ra các môi trường nuôi cấy thích hợp hơn đối với các vi sinh vật còn chưa được biết đến. Hiện nay người ta đã sử dụng kỹ thuật PCR và phân tích ARN của tiểu thể ribosome để đánh giá tính đa dạng của quần thể các vi sinh vật chưa nuôi cấy được.

14.5.3. Cảm ứng mật độ và các quần thể vi sinh vật

Từ nhiều thập kỷ nay, các nhà vi sinh vật học vẫn nghĩ rằng quần thể vi sinh vật là tập hợp của các cá thể riêng biệt, sinh trưởng và hoạt động độc lập với nhau. Tuy nhiên gần đây người ta đã phát hiện thấy nhiều vi khuẩn có khả năng giao tiếp và hoạt động hợp tác với nhau. Một trong những cách cơ bản để vi sinh vật hợp tác được với nhau đó là cảm ứng mật độ hay còn lại là sự tự cảm ứng. Đó là hiện tượng trong đó vi sinh vật tự điều chỉnh mật độ thông qua quá trình cảm nhận hàm lượng các phân tử tín hiệu, đôi khi gọi là các chất tự cảm ứng (autoinducer) bởi vì chúng có thể kích thích tế bào tiết ra chúng. Nồng độ các phân tử tín hiệu tăng lên cùng với sự tăng lên của số lượng vi khuẩn trong quần thể cho đến khi đạt đến ngưỡng đặc trưng (đối với quần thể đó) và ra tín hiệu cho vi khuẩn rằng mật độ quần thể đã đến mức tới hạn hay còn gọi là "quorum". Vi khuẩn lúc đó sẽ bắt đầu biểu hiện các gen phụ thuộc mật độ tế bào tới hạn nhằm điều chỉnh mật độ tế bào. Cảm ứng mật độ đã được phát hiện ở cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương.

Cảm ứng mật độ có ý nghĩa quan trọng với vi sinh vật. Có thể lấy ví dụ về sự sinh tổng hợp và giải phóng các enzyme ngoại bào. Nếu các enzyme này chỉ được giải phóng nhờ một số ít vi khuẩn, chúng sẽ bị khuếch tán và không phát huy được tác dụng do bị pha loãng. Với cách điều khiển bằng cảm ứng mật độ, vi khuẩn sẽ đạt đến mật độ quần thể lớn trước khi chúng giải phóng enzyme và kết quả là hàm lượng enzyme đủ lớn để phát huy tác dụng. Đó chính là lợi thế của vi sinh vật trong cơ thể vật chủ cũng như trong các môi trường đất, nước. Nếu vi sinh vật gây bệnh có thể đạt được đến nồng độ đủ lớn tại một điểm nào đó trên cơ thể vật chủ trước khi sản sinh các nhân tố độc lực và xâm nhập được vào các mô vật chủ, chúng sẽ có cơ hội lớn hơn trong việc làm mất tác dụng khả năng tự vệ của vật chủ và do đó có thể lan ra toàn bộ cơ thể vật chủ. Điều này giải thích một kiểu khác của cảm ứng mật độ. Dường như cảm ứng mật độ rất quan trọng đối với nhiều vi sinh vật trong việc thiết lập mối quan hệ cộng sinh hay ký sinh đối với vật chủ.

Cảm ứng mật độ được phát hiện đầu tiên và tìm hiểu rõ nhất ở vi khuẩn Gram âm. Các tín hiệu thường gặp nhất ở vi khuẩn Gram âm là acyl homoserine lactones (HSLs). Đó là các phân tử nhỏ được cấu tạo bởi chuỗi acyl từ 4 đến 14 C liên kết với homoserine lactone (hình 14.19). Chuỗi acyl này có thể có nhóm keto hay nhóm ở vị trí C thứ 3. Các phân tử Acyl HSLs khuếch tán vào các tế bào đích (target cell) (hình 14.19). Khi đạt đến hàm lượng đủ lớn, các phân tử Acyl HSLs sẽ bám vào các protein thụ thể đặc biệt (R) và gây ra sự thay đổi cấu trúc protein. Thông thường khi phức hệ HSLs-protein được hoạt hóa, chúng có tác dụng như chất cảm ứng, chúng bám vào các điểm đích trên ADN và kích thích sự phiên mã của các gen nhạy cảm với nồng độ tế bào tới hạn. Các gen cần thiết để tổng hợp HSL cũng được tạo ra thường xuyên, do đó nhiều chất tự cảm ứng được tổng hợp và giải phóng.

Hình 14.19: Cảm ứng mật độ ở vi khuẩn Gram âm.

(Theo sách của Prescott,Harley và Klein).

(a) Cấu trúc chung của acyl homoserine lactone, chất được biết đến như là tín hiệu cảm ứng mật độ (điều chỉnh mật độ tế bào) hay còn gọi là chất tự cảm ứng.

(b) Lược đồ minh họa cách hoạt động của cảm ứng mật độ ở nhều vi khuẩn gram âm. Các protein thụ thể hoạt động với vai trò chất cảm ứng (inducer) được ký hiệu bằng chữ R. Đường kẻ gãy nét biểu thị acyl HSL synthase không phải lúc nào cũng được tạo ra tương ứng với các chất tự cảm ứng.

Ở vi khuẩn Gram âm, rất nhiều quá trình nhạy cảm với các tín hiệu acyl HSL và cảm ứng mật độ. Một số ví dụ đã được nghiên cứu kỹ đó là (1) sự sản sinh chất phát quang sinh học (bioluminescence) bởi Vibrio fischeri, (2) Pseudomonas aeruginosa tổng hợp và giải phóng các yếu tố gây bệnh, (3) Sự chuyển các yếu tố di truyền nhờ quá trình tiếp hợp ở Agrobacterium tumefaciens, và (4) Sự sản xuất kháng sinh ở Erwinia carotovora và Pseudomonas aureofaciens.

Vi khuẩn Gram dương cũng điều hòa hoạt động bằng cảm ứng mật độ, thông thường bằng tín hiệu là các oligopeptide. Các ví dụ điển hình đó là sự tiếp hợp ở Enterococcus faecalis, kích thích khả năng tải nạp ADN (competence induction) ở Streptococcus pneumoniae, sự kích thích tạo bào tử ở Bacillus subtilis, và sự sản sinh rất nhiều độc tố và các yếu tố gây bệnh ở Staphylococcus aureus. Cảm ứng mật độ thậm chí kích thích sự phát triển khuẩn ty khí sinh và tạo streptomycin ở Streptomyces griseus. Đối với trường hợp của Streptomyces griseus thì có lẽ tín hiệu là g-butyrolaton chứ không phải là oligopeptide.

Chức năng quan trọng nữa đáng quan tâm của cảm ứng mật độ đó là sự đẩy mạnh việc tạo màng sinh học (biofilm) bởi vi khuẩn gây bệnh Pseudomonas aeruginosa, và có thể nó đóng vai trò quan trọng trong bệnh xơ hóa u nang (crystic fibrosis). Sự tạo màng sinh học rất có ý nghĩa đối với vi sinh vật gây bệnh vì nó bảo vệ vi khuẩn khỏi sự tấn công của kháng sinh và các chất tẩy rửa. Sự điều chỉnh mật độ tế bào có thể rất hiệu quả bên trong màng sinh học do hàm lượng acyl HSL ít bị pha loãng và có thể tăng lên nhanh chóng. Trong điều kiện này, hai loại vi khuẩn khác nhau có thể kích thích nhau bằng cách sản xuất ra các tín hiệu tương tự nhau, đó là trường hợp màng sinh học có chứa các vi khuẩn gây bệnh P. aeruginosa và Burkhoderia cepacia.

Cảm ứng mật độ là một ví dụ về sự hoạt động đa tế bào trong đó các cá thể giao tiếp và hợp tác hoạt động như là một đơn vị thống nhất. Các ví dụ khác về hoạt động phức hợp như trên đó là sự hình thành các dạng khuẩn lạc và sự hình thành thể quả ở Niêm vi khuẩn (Myxobacteria).

Bài 17 Khái niệm chung về trao đổi chất ở Vi sinh vật

16.1. NĂNG LƯỢNG

16.1.1. Năng lượng và công

Có thể định nghĩa một cách đơn giản nhất năng lượng là khả năng tạo nên công hoặc gây nên những biến đổi đặc biệt. Do đó, tất cả các quá trình lý, hoá là kết quả của việc sử dụng hoặc vận động của năng lượng. Tế bào sống thực hiện ba loại công chủ yếu, tất cả đều cần thiết cho các quá trình sống.

• Công hoá học, bao gồm việc tổng hợp các phân tử sinh học phức tạp từ các tiền chất đơn giản hơn. Năng lượng ở đây được dùng để nâng cao tính phức tạp phân tử của tế bào.

• Công vận chuyển, cần năng lượng để hấp thu các chất dinh dưỡng, loại bỏ các chất thải và duy trì các cân bằng ion.

Như ta biết, nhiều phân tử chất dinh dưỡng bên ngoài môi trường phải đi vào tế bào mặc dù nồng độ nội bào của các chất này thường cao hơn ngoại bào nghĩa là ngược với gradien điện hoá. Với các chất thải và các chất độc hại cần phải được loại bỏ khỏi tế bào, tình hình cũng diễn ra tương tự.

• Công cơ học, có lẽ là loại công quen thuộc nhất trong ba loại công. Năng lượng ở đây cần cho việc thay đổi vị trí vật lý của các cơ thể, các tế bào và các cấu trúc bên trong tế bào. Hầu hết năng lượng sinh học bắt nguồn từ ánh sáng mặt trời khả kiến chiếu lên bề mặt trái đất. Quang năng được hấp thu bởi các sinh vật quang dưỡng trong quá trình quang hợp nhờ chất diệp lục và các sắc tố khác sau đó chuyển thành hoá năng. Trái với sinh vật quang dưỡng, nhiều vi khuẩn hoá tự dưỡng vô cơ (chemolithoautotrophs) lại thu được năng lượng nhờ oxy hoá các chất vô cơ. Hoá năng từ quang hợp và hoá dưỡng vô cơ sau đó có thể được các sinh vật quang tự dưỡng vô cơ và hoá tự dưỡng vô cơ sử dụng để chuyển CO2 thành các phân tử sinh học như Glucose (Hình 16.1).

•

Hình 16.1: Dòng carbon và năng lượng trong một hệ sinh thái

(Theo: Prescott và cs, 2005)

Các phân tử phức tạp do các cơ thể tự dưỡng tổng hợp (cả thực vật và vi sinh vật) được dùng làm nguồn carbon cho các sinh vật hoá dị dưỡng và các sinh vật tiêu thụ khác vốn sử dụng các phân tử hữu cơ phức tạp làm nguồn vật chất và năng lượng để xây dựng nên các cấu trúc tế bào của riêng mình (trên thực tế các sinh vật tự dưỡng cũng sử dụng các phân tử hữu cơ phức tạp). Các sinh vật hoá dị dưỡng thường sử dụng O2 làm chất nhận electron khi oxy hoá Glucose và các phân tử hữu cơ khác thành CO2. Trong quá trình này - được gọi là hô hấp hiếu khí - O2 đóng vai trò là chất nhận electron cuối cùng và bị khử thành nước. Quá trình trên giải phóng ra nhiều năng lượng. Do đó trong hệ sinh thái năng lượng được hấp thu bởi các cơ thể quang tự dưỡng và hoá tự dưỡng vô cơ. Sau đó, một phần năng lượng này được chuyền cho các cơ thể hoá dị dưỡng khi chúng sử dụng các chất dinh dưỡng bắt nguồn từ bọn tự dưỡng (Hình 16.1). CO2 tạo thành trong hô hấp hiếu khí có thể lại được lắp vào các phân tử hữu cơ phức tạp trong quang hợp và hoá tự dưỡng vô cơ. Rõ ràng, dòng carbon và năng lượng trong hệ sinh thái có liên quan mật thiết với nhau.

Các tế bào phải vận chuyển năng lượng một cách có hiệu quả từ bộ máy sản xuất năng lượng tới các hệ thống thực hiện công. Nghĩa là, chúng cần có một đồng tiền chung về năng lượng để tiêu dùng, đó là Adenosine 5'- triPhosphate tức ATP (hình 16.2).

Hình 16.2. Adenosine triPhosphate và Adenosine diPhosphate.

(Theo Prescott, Harley và Klein, 2005)

Hình 16.3: Chu trình năng lượng của tế bào.

Khi ATP phân giải thành Adenosine diPhosphate (ADP) và ortoPhosphate (Pi) năng lượng giải phóng ra sẽ được dùng để thực hiện công hữu ích. Sau đó, năng lượng từ quang hợp, hô hấp hiếu khí, hô hấp kỵ khí và lên men lại được dùng để tái tổng hợp ATP từ ADP và Pi trong chu trình năng lượng của tế bào (Hình 16.3).

ATP được tạo thành từ năng lượng cung cấp bởi hô hấp hiếu khí, hô hấp kị khí, lên men và quang hợp. Sự phân giải của ATP thành ADP và Phosphate (Pi) giúp cho việc sản ra công hóa học, công vận chuyển và công cơ học.

16.1.2. Các định luật về nhiệt động học

Để hiểu được năng lượng tạo thành ra sao và ATP hoạt động như thế nào với vai trò là đồng tiền năng lượng ta cần nắm được một số nguyên lý cơ bản của nhiệt động học. Nhiệt động học phân tích những thay đổi về năng lượng trong một tổ hợp vật thể (ví dụ: một tế bào hay một cây) được gọi là một hệ thống. Mọi vật thể khác trong tự nhiên được gọi là môi trường xung quanh. Nhiệt động học tập trung vào sự sai khác năng lượng giữa trạng thái ban đầu và trạng thái cuối cùng của một hệ thống mà không quan tâm đến tốc độ của quá trình. Chẳng hạn, nếu một xoong nước được đun đến sôi thì, về nhiệt động học, chỉ điều kiện nước lúc ban đầu và khi sôi là quan trọng, còn việc nước được đun nhanh chậm ra sao và được đun trên loại bếp lò nào thì không cần chú ý. Trong nhiệt động học không thể không đề cập đến hai định luật quan trọng sau đây.

Theo định luật thứ nhất, năng lượng không thể được tạo ra hoặc mất đi. Tổng năng lượng trong tự nhiên là hằng số mặc dù có thể được phân bố lại. Chẳng hạn, trong các phản ứng hoá học, thường diễn ra sự trao đổi năng lượng (Ví dụ, nhiệt được thoát ra ở các phản ứng ngoại nhiệt và được hấp thu trong các phản ứng nội nhiệt) nhưng những sự trao đổi nhiệt này không trái với định luật trên.

Để xác định lượng nhiệt được sử dụng trong hoặc thoát ra từ một phản ứng nào đó người ta dùng hai loại đơn vị năng lượng: một calo (cal) là lượng nhiệt năng cần để tăng nhiệt độ của một gam nước từ 14,5 đến 15,50C. Lượng nhiệt cũng có thể được biểu hiện bằng joule (joule, J) là đơn vị của công. 1 cal của nhiệt tương đương với 4,1840 J của công. 1000 cal hay 1 kilocalo (kcal) là lượng nhiệt đủ đun sôi khoảng 1,9ml nước. 1 kilojoule (kj) là lượng nhiệt đủ đun sôi khoảng 0,44 ml nước hoặc giúp cho một người nặng 70 kg leo lên được 35 bậc. Joule thường được các nhà hoá học và vật lý học sử dụng, còn các nhà sinh học lại quen sử dụng calo khi nói về năng lượng. Vì vậy, calo cũng được sử dụng ở đây khi những sự thay đổi năng lượng được đề cập.

Mặc dù năng lượng được bảo tồn trong tự nhiên nhưng định luật thứ nhất của nhiệt động học không giải thích được nhiều quá trình vật lý và hoá học. Hãy lấy một ví dụ đơn giản để làm sáng tỏ điều nói trên.

Hình 16.4: Sự bành trướng của khí từ xylanh chứa đầy khí sang xylanh rỗng khí.

(Theo Prescott, Harley và Klein, 2005)

Giả dụ, ta nối một xylanh đầy khí với một xylanh rỗng khí bằng bằng một ống chứa 1 van (Hình 16.4). Nếu ta mở van khí sẽ từ xylanh đầy tràn sang xylanh rỗng cho đến khi khí áp cân bằng ở 2 xylanh. Năng lượng không chỉ được phân bố lại, nhưng cũng được bảo tồn. Sự bành trướng của khí được giải thích bằng định luật thứ hai của nhiệt động học và một trạng thái vật chất được gọi là entropi. Có thể xem entropi là đại lượng đo tính hỗn độn hoặc mất trật tự của một hệ thống. Tính hỗn độn của một hệ thống càng lớn thì entropi của hệ thống cũng càng lớn. Định luật thứ hai nói rằng các quá trình vật lý và hoá học diễn ra theo cách sao cho tính hỗn độn hoặc mất trật tự của cả hệ thống và môi trường xung quanh tăng tới cực đại có thể. Khí bao giờ cũng sẽ bành trướng sang xylanh trống.

16.1.3. Năng lượng tự do và các phản ứng

Các định luật thứ nhất và thứ hai có thể kết hợp trong một phương trình chung liên kết những thay đổi trong năng lượng có thể diễn ra trong các phản ứng hoá học và các quá trình khác.

∆G = ∆H - T.∆S

∆G là sự thay đổi trong năng lượng tự do, ∆H là sự thay đổi trong entalpi (enthalpi).T là nhiệt độ Kelvin (0C + 273) và ∆S là sự thay đổi trong entropi (entropy) diễn ra trong phản ứng. Sự thay đổi trong entalpi là sự thay đổi trong nhiệt lượng. Các phản ứng trong tế bào diễn ra ở điều kiện áp suất và thể tích không thay đổi. Do đó sự thay đổi trong entalpi sẽ tương tự như sự thay đổi trong năng lượng tổng cộng trong phản ứng. Sự thay đổi năng lượng tự do là nhiệt lượng trong một hệ thống có khả năng sinh công ở nhiệt độ và áp suất không thay đổi. Vì vậy, sự thay đổi trong entropi là đại lượng đo tỉ lệ của sự thay đổi năng lượng tổng cộng mà hệ thống không thể sử dụng để thực hiện công. Sự thay đổi của năng lượng tự do và của entropi không phụ thuộc vào việc hệ thống diễn ra như thế nào từ lúc bắt đầu tới khi kết thúc. Ở nhiệt độ và áp suất không đổi một phản ứng sẽ xảy ra ngẫu nhiên nếu năng lượng tự do của hệ thống giảm đi trong phản ứng, hay nói theo cách khác, nếu ∆G là âm. Từ phương trình trên suy ra là một phản ứng với sự thay đổi lớn, dương tính trong entropi sẽ thường có xu hướng có giá trị ∆G âm và vì vậy xảy ra ngẫu nhiên. Một sự giảm trong entropi sẽ có xu hướng làm cho ∆G dương tính hơn và phản ứng ít thuận lợi.

Hình 16.5: ∆Go' và cân bằng. Quan hệ của ∆Go' với sự cân bằng của các phản ứng. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005)

Sự thay đổi trong năng lượng tự do có quan hệ xác định, cụ thể đối với hướng của các phản ứng hoá học. Ta hãy xét phản ứng đơn giản sau đây:

A + B C + D

Nếu được hỗn hợp các phân tử A và B sẽ kết hợp với nhau tạo thành các sản phẩm C và D. Cuối cùng C và D sẽ trở nên đậm đặc đủ để kết hợp với nhau và tạo thành A và B với cùng tốc độ như khi chúng được tạo thành từ A và B. Phản ứng bây giờ ở trạng thái cân bằng: tốc độ theo hai hướng là như nhau và không có sự thay đổi rõ rệt nào diễn ra trong nồng độ của các chất phản ứng và các sản phẩm. Tình hình trên được mô tả là hằng số cân bằng (Keq) liên kết nồng độ cân bằng của các sản phẩm và cơ chất với nhau:

Nếu hằng số cân bằng lớn hơn 1 các sản phẩm sẽ có nồng độ lớn hơn các chất phản ứng và phản ứng có xu hướng diễn ra đến cùng (Hình 16.5).

Hằng số cân bằng của một phản ứng liên quan trực tiếp với sự thay đổi trong năng lượng tự do của phản ứng. Khi được xác định ở các điều kiện tiêu chuẩn quy định chặt chẽ về nồng độ, áp suất, pH và nhiệt độ thì sự thay đổi năng lượng tự do cho một quá trình được gọi là sự thay đổi năng lượng tự do tiêu chuẩn (∆Go). Nếu giữ ở pH 7,0 (gần với pH của tế bào sống) sự thay đổi năng lượng tự do tiêu chuẩn sẽ được chỉ bởi ký hiệu ∆Go'. Sự thay đồi trong năng lượng tự do tiêu chuẩn có thể được xem là lượng năng lượng cực đại mà hệ thống có thể thực hiện công hữu ích ở các điều kiện tiêu chuẩn. Việc sử dụng các giá trị ∆Go' cho phép ta so sánh các phản ứng mà không cần quan tâm tới những thay đổi trong ∆G, do những sai khác trong các điều kiện môi trường. Quan hệ giữa ∆Go' và Keq được thể hiện qua quá trình sau:

∆Go' = -2,303RTlgKeq.

R là hằng số khí (1,9872 cal/mol hoặc 8,3145 J/mol) và T là nhiệt độ tuyệt đối. Từ phương trình trên rút ra khi ∆Go' âm hằng số cân bằng sẽ lớn hơn 1, phản ứng sẽ diễn ra đến cùng và được gọi là phản ứng thoát nhiệt (Hình 16.5). Trong một phản ứng thu nhiệt ∆Go' là dương và hằng số cân bằng nhỏ hơn 1. Điều đó có nghĩa là phản ứng không thuận lợi và ít sản phẩm được tạo thành ở các điều kiện tiêu chuẩn. Cần nhớ rằng giá trị ∆Go' chỉ cho ta biết phản ứng nằm ở đâu khi cân bằng chứ không nói lên phản ứng đạt được cân bằng nhanh chậm ra sao.

16.1.4. Vai trò của ATP trong trao đổi chất

Nhiều phản ứng trong tế bào là thu nhiệt, khó diễn ra hoàn toàn nếu không có sự giúp đỡ từ bên ngoài. Một trong các vai trò của ATP là hướng các phản ứng nói trên xảy ra được triệt để hơn. ATP là một phân tử cao năng nghĩa là nó có thể bị thuỷ phân hầu như hoàn toàn thành ADP và Pi với một ∆Go' khoảng -7,3kcal/mol.

ATP + H2O ADP + Pi

Với ATP thuật ngữ phân tử cao năng không có nghĩa là một lượng lớn năng lượng được dự trữ bên trong một liên kết đặc biệt của ATP mà chỉ đơn giản chỉ ra rằng việc loại bỏ nhánh Phosphate tận cùng diễn ra với sự thay đổi năng lượng tự do chuẩn là âm, lớn hoặc phản ứng là thoát nhiệt mạnh. Nói cách khác ATP có thế mạnh chuyền nhóm Phosphate và dễ dàng chuyền Phosphate cho nước. Thế chuyền nhóm Phosphate được quy định là âm của ∆Go' đối với việc loại bỏ thuỷ phân Phosphate. Một phân tử có thế chuyền nhóm cao hơn sẽ chuyển Phosphate cho phân tử có thế thấp hơn.

Như vậy ATP thích hợp khá lý tưởng đối với vai trò là đồng tiền năng lượng. ATP được tạo thành trong các quá trình hấp thu và sản sinh năng lượng như quang hợp, lên men và hô hấp hiếu khí. Đứng về kinh tế của tế bào sự phân giải ATP thải nhiệt liên kết với các phản ứng thu nhiệt khác nhau giúp cho các phản ứng này được hoàn thành (Hình 16.6). Nói cách khác ATP liên kết các phản ứng sinh năng lượng với các phản ứng sử dụng năng lượng.

16.1.5. Các phản ứng oxy hoá - khử và các chất mang electron

Sự thay đổi năng lượng tự do không chỉ liên quan tới cân bằng của các phản ứng hoá học thông thường mà còn tới cân bằng của các phản ứng oxy hoá-khử. Việc giải phóng năng lượng thường bao gồm các phản ứng oxy hoá-khử là các phản ứng trong đó các electron được chuyển từ chất cho (hoặc chất khử) tới chất nhận electron (hoặc chất oxy hoá). Theo quy ước một phản ứng như vậy sẽ được viết với chất cho nằm ở phía bên phải của chất nhận cùng với số (n) electron (e-) được chuyển:

Chất nhận + ne- Chất cho

Hình 16.6. ATP như một tác nhân liên kết

Việc sử dụng ATP để tạo thành các phản ứng nội năng là thuận lợi hơn. ATP được tạo thành bởi các phản ứng ngoại năng, sau đó được dùng để hướng dẫn các phản ứng nội năng.

(Theo Prescott, Harley và Klein, 2005)

Cặp chất nhận và chất cho được gọi là cặp redox (Bảng 16.1). Khi một chất nhận nhận các electron nó sẽ trở thành chất cho của cặp. Hằng số cân bằng đối với phản ứng được gọi là thế khử chuẩn (Eo) và là đại lượng đo xu hướng mất electron của chất khử. Tiêu chuẩn tham khảo dùng cho các thế khử là hệ thống hydro với

(thế khử ở pH 7,0) là -0,42V hoặc -420mV.

2H+ + 2e- H2

Trong phản ứng này mỗi nguyên tử hydrogen cung cấp một proton (H+) và một electron (e-).

Thế khử có ý nghĩa cụ thể. Các cặp redox với thế khử âm hơn sẽ chuyền electron cho các cặp với thế khử dương hơn và ái lực lớn hơn đối với các electron. Do đó các electron sẽ có xu hướng di chuyển từ các chất khử ở chóp của bảng 16.1 đến các chất oxy hoá ở đáy vì chúng có thế dương hơn. Bằng mắt thường, điều này có thể được thể hiện ở dạng của một tháp electron trong đó các thế khử âm nhất là ở chóp (hình 16.7).

Bảng 16.1: Các cặp oxy hóa - khử chọn lọc quan trọng về sinh học.

(Theo: Prescott và cs, 2005)

Cặp oxy hóa khử E'o (Volt)a

2H+ + 2e- H2

Ferredoxin(Fe3+) + e- Ferredoxin (Fe2+)

NAD(P)+ + H+ + 2e- NADP(H)

S + 2H+ + 2e- H2S

Acetaldehyd + 2H+ + 2e- Ethanol

Pyruvate- + 2H+ + 2e- Lactate2-

FAD + 2H+ + 2e- FADH2

Oxaloacetat2- + 2H+ + 2e- Malate2-

Fumarate2- + 2H+ + 2e- Succinate2-

Cytochrome b (Fe3+) + e- Cytochrome b (Fe2-)

Ubiquinone + 2H+ + 2e- Ubiquinone H2

Cytochrome c (Fe3+) + e- Cytochrome c (Fe2+)

NO3- + 2H+ + 2e- NO2- + H2O

NO2- + 8H+ + 6e- NH4+ + 2H2O

Fe3+ + e- Fe2+

O2 + 4H+ + 4e- 2H2O

- 0,42

- 0,42

- 0,32

- 0,274

- 0,197

- 0,185

- 0,18b

- 0,166

0,031

0,075

0,10

0,254

0,421

0,44

0,771

0,815

a/ là thế khử chuẩn ở pH 7,0

b/ Giá trị đối với FAD/FADH2 ứng dụng cho cofactor tự do vì nó có thể thay đổi đáng kể khi liên kết với 1 apoenzyme

c/ Giá trị đối với Fe tự do không phải Fe gắn với protein (ví dụ các Cytochrome).

Các electron di chuyển từ các chất cho tới các chất nhận xuôi theo gradien điện thế hoặc rơi xuống tháp đến các điện thế dương hơn. Ta hãy xem trường hợp của chất mang electron NAD+ (nicotinamide adenine - dinucleotide). Cặp NAD+/NADH có rất âm, và vì vậy có thể cho electron tới nhiều chất nhận kể cả O2.

Hình 16.7. Sự di chuyển của electron và các thế khử.

Tháp electron thẳng đứng có các thế khử âm nhất ở đỉnh. Các electron chuyển dịch ngẫu nhiên từ các chất cho cao hơn trên tháp (các thế hiệu âm hơn) tới các chất nhận thấp hơn trên tháp (các thế hiệu dương hơn). Nghĩa là, chất cho trên tháp bao giờ cũng cao hơn chất nhận. Chẳng hạn NADH sẽ chuyền các electron tới oxy và tạo thành nước trong quá trình. Một số chất cho và chất nhận điển hình được ghi ở bên trái và thế oxy hóa khử của chúng được cho trong ngoặc đơn. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005)

NAD+ + 2H+ + 2e- NADH + H+ = -0,32V

O2 + 2H+ + 2e- H2O = +0,82V

Vì NAD+/NADH âm hơn O2/H2O các electron sẽ di chưyển từ NADH (chất khử) tới O2 (chất oxy hoá) như ở hình 16.7.

NADH + H+ + O2 H2O + NAD+

Khi các electron di chuyển từ một chất khử tới một chất nhận với một thế oxy hoá - khử dương hơn năng lượng tự do sẽ được giải phóng. ∆Go' của phản ứng liên quan trực tiếp tới mức độ sai khác giữa thế khử của hai cặp (∆E'o). ∆E'o càng lớn thì năng lượng tự do thoát ra cũng càng lớn như chỉ ra bởi phương trình sau: ∆G'o= -nF∆E'o.

Ở đây n là số electron được chuyển và F là hằng số Faraday (23,062 cal/mol-von hoặc 96,494 J/mol-von). Với mỗi thay đổi 0,1V trong ∆ sẽ có sự thay đổi 4,6 kcal tương ứng trong ∆ và Keq trong các phản ứng hoá học khác nghĩa là hằng số cân bằng càng lớn thì ∆ cũng càng lớn. Sự khác nhau trong thế khử giữa NAD+/NADH và O2/H2O là 1,14V, một giá trị ∆ lớn. Trong hô hấp hiếu khí khi các electron di chuyển từ NADH tới O2 một lượng lớn năng lượng tự do được dùng để tổng hợp ATP (Hình 16.8)

NADH + H+ + 1/2O2 NAD+ + H2O ∆ = 52,6 kcal.mol-1

Khi các electron di chuyển từ các thế khử âm đến các thế khử dương năng lượng sẽ được giải phóng; trái lại, khi các electron di chuyển từ các điện thế dương hơn đến các điện thế âm hơn năng lượng sẽ cần để đẩy các electron theo hướng ngược lại như diễn ra trong quang hợp (Hình 16.8), ở đây quang năng được thu nhận và được dùng để đẩy các electron từ nước tới chất mang electron nicotinamide dinucleotide Phosphate (NADP+).

Như hình 16.1 đã chỉ dẫn các sinh vật quang hợp thu nhận và sử dụng quang năng để vận chuyển các electron từ nước (và các chất cho electron khác như H2S) đến các chất nhận electron như NADP+ có các thế khử âm hơn. Sau đó các electron này có thể di chuyển trở lại tới các chất nhận dương hơn và cung cấp năng lượng để tạo thành ATP trong quang hợp. Các cơ thể quang tự dưỡng sử dụng ATP và NADPH để tổng hợp các phân tử phức tạp từ CO2. Các sinh vật hóa dị dưỡng cũng sử dụng năng lượng giải phóng ra trong sự vận chuyển của các electron nhờ sự oxy hoá các chất dinh dưỡng phức tạp trong hô hấp để tạo thành NADH. Sau đó NADH chuyền các electron cho O2 và năng lượng thoát ra trong sự vận chuyển electron được giữ lại ở dạng ATP. Năng lượng từ ánh sáng mặt trời được sử dụng bởi tất cả các sinh vật chính vì mối quan hệ này giữa dòng electron và năng lượng.

Hình 16.8: Dòng năng luợng trong trao đổi chất

Những ví dụ của mối quan hệ giữa dòng electron và năng luợng trong trao đổi chất. Oxy và NADP+ được dùng làm chất nhận electron lần lượt từ NADH và nước. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005)

Hình 16.9: Cấu trúc và chức năng của NAD+.

(a) Cấu trúc của NAD và NADP. NADP khác với NAD ở chỗ có thêm 1 Phosphate trên một trong các đường ribose; (b) NAD có thể nhận các electron và 1 hydro từ cơ chất khử (SH2). Các electron và hydro này được mang trên vòng nicotinamide. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005)

Sự vận chuyển electron có ý nghĩa quan trọng trong hô hấp hiếu khí, hô hấp kỵ khí, hoá dưỡng vô cơ và quang hợp. Sự vận chuyển electron trong tế bào cần sự tham gia của các chất mang như NAD+ và NADP+, cả hai chất này đều có thể vận chuyển electron giữa các vị trí khác nhau. Vòng nicotinamide của NAD+ và NADP+ (Hình 16.9) tiếp nhận hai electron này và một proton từ một chất cho, còn proton thứ hai được tách ra.

Hình 16.10: Cấu trúc và chức năng của FAD

Vitamin riboflavin bao gồm vòng isoalloxazine và đường ribose gắn vào. FMN là riboflavin Phosphate. Phần của vòng trực tiếp tham gia vào các phản ứng oxy hóa khử là phần có màu. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005)

Một số chất mang electron khác có vai trò trong trao đổi chất của vi sinh vật cũng được nêu trong bảng 16.1; các chất này mang electron theo các cách khác nhau. Flavin-adenine dinucleotide (NAD) và flavin-mononucleotide (FMN) mang 2 electron và 2 proton trên hệ thống vòng phức tạp (Hình 16.10).

Các protein chứa FAD và FMN thường được gọi là flavoprotein. Coenzyme Q (CoQ) hoặc Ubiquinone là một quinon vận chuyển các electron và các H+ trong nhiều chuỗi vận chuyển electron hô hấp (Hình 16.11).

Các cytochrome và một số chất mang khác sử dụng các nguyên tử sắt để vận chuyển electron qua các phản ứng oxy hoá - khử thuận nghịch:

Fe3+ (sắt ferric) Fe2+ (sắt ferrous)

Trong cytochrome các nguyên tử sắt này là một phần của nhóm hem (Hình 16.12) hoặc của các vòng sắt - porphyrin tương tự khác.

Hình 16.11. Cấu trúc và chức năng của Coenzyme Q hoặc Ubiquinone

Chiều dài của chuỗi bên thay đổi tùy theo cơ thể với n = 6 đến n = 10. (Theo Prescott và cs, 2005)

Các chuỗi vận chuyển electron hô hấp thường chứa cytochrome bao gồm một protein và một vòng sắt - porphyrin. Một số protein mang electron chứa sắt thiếu nhóm hem và được gọi là các protein sắt không - hem. Ferredoxin (Fd) là một protein sắt không-hem hoạt động trong việc vận chuyển electron quang hợp và một số quá trình vận chuyển electron khác. Mặc dù nguyên tử sắt ở chúng không gắn với nhóm hem nhưng chúng vẫn thực hiện được các phản ứng oxy hoá. Cần chú ý rằng trong số các phân tử tham gia vào chuỗi vận chuyển electron nói trên, ở mỗi thời điểm, một số mang hai electron (như NAD, FAD và CoQ), số khác (như các cytochrome và các protein sắt không-hem) chỉ mang một electron. Sự khác nhau trong số lượng electron được vận chuyển có ý nghĩa rất quan trọng trong hoạt động của các chuỗi vận chuyển electron.

Hình 16.12: Cấu trúc của Hem

Hem bao gồm 1 vòng porphyrin gắn với 1 nguyên tử sắt. Đây là thành phần không-protein của nhiều Cytochrome . Nguyên tử sắt luân phiên tiếp nhận và giải phóng 1 electron. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005)

16.2. ENZYME

Như đã nói ở trên một phản ứng thoát nhiệt là một phản ứng có ∆Go' âm và hằng số cân bằng lớn hơn 1 và có thể diễn ra triệt để nghĩa là về phía bên phải của phương trình. Tuy nhiên, người ta thường có thể hỗn hợp các chất phản ứng của một phản ứng thoát nhiệt mà không thấy kết quả rõ ràng mặc dù các sản phẩm có thể được tạo thành. Chính enzyme đóng vai trò trong các phản ứng này.

16.2.1. Cấu trúc và phân loại các enzyme

Enzyme là các chất xúc tác có bản chất protein, có tính đặc hiệu cao đối với phản ứng xúc tác và với các phân tử chịu xúc tác. Chất xúc tác là một chất làm tăng tốc độ của một phản ứng hoá học mà bản thân không bị thay đổi. Do đó enzyme thúc đẩy các phản ứng của tế bào. Các phân tử phản ứng được gọi là cơ chất và các chất tạo thành được gọi là sản phẩm. Nhiều enzyme là các protein thuần khiết, nhưng cũng không ít enzyme gồm hai thành phần: thành phần protein (gọi là apoenzyme) và phần không - protein (gọi là cofactor); cả hai cần cho hoạt tính xúc tác và enzyme gồm cả hai thành phần trên được gọi là holoenzyme. Cofactor được gọi là nhóm thêm (prosthetic group) nếu gắn chặt vào apoenzyme. Nhưng thường thì cofactor gắn lỏng lẻo với apoenzyme, thậm chí có thể phân li khỏi protein enzyme sau khi các sản phẩm đã được tạo thành và mang một trong các sản phẩm này đến một enzyme khác. Cofactor gắn lỏng lẻo nói trên được gọi là coenzyme. Chẳng hạn, NAD+ là một coenzyme mang các electron bên trong tế bào. Nhiều vitamin mà con người cần đóng vai trò là các coenzyme hoặc là tiền chất (precursor) của các coenzyme. Niacin được lắp vào NAD+ và riboflavin được lắp vào FAD. Các ion kim loại cũng có thể liên kết với các apoenzyme và tác dụng như các cofactor.

Mặc dù tế bào chứa một số lượng lớn và rất đa dạng các enzyme nhưng chúng có thể được xếp vào một trong 6 nhóm (Bảng 16.2). Tên của các enzyme thường được đặt theo tên cơ chất mà chúng tác dụng lên và loại phản ứng được xúc tác. Ví dụ, Lactate dehydrogenase (LDH) loại bỏ hydrogen khỏi Lactate:

Lactate + NAD+ Pyruvate + NADH + H+

Lactate dehydrogenase cũng có thể được đặt tên đầy đủ và chi tiết hơn là L-Lactate: NAD oxydoreductase. Tên này mô tả các cơ chất và loại phản ứng chính xác hơn.

Bảng 16.2. Phân loại enzyme

(Theo Prescott, Harley và Klein, 2005)

Loại enzyme Phản ứng do enzyme xúc tác Ví dụ phản ứng

Oxydoreductase Các phản ứng oxy hóa khử Lactate dehydrogenase:

Pyruvate + NADH + H Lactate + NAD+

Transferase Các phản ứng chuyển nhóm giữa các phân tử Aspartate Carbamoyltransferase:

Aspartate + CarbamoylPhosphate

Carbamoylaspartate + Phosphate

Hydrolase Thủy phân các phân tử. Glucose-6-Phosphatease:

Glucose-6-Phosphate + H2O Glucose + Pi

Lyase Loại bỏ các nhóm để tạo thành các nối đôi hoặc bổ sung các nhóm vào nối đôi. Fumarate hydratase:

L-malate Fumarate + H2O

Isomerase Các phản ứng xúc tác đồng phân hóa. Alanine racemase:

L-alanine D-alanine

Ligase Nối 2 phân tử nhờ năng luợng của ATP (hay của các nucleoside triphosphate khác) Glutamine synthetase:

Glutamate + NH3 + ATP Glutamine + ATP + Pi

16.2.2. Cơ chế của các phản ứng enzyme

Cần nhớ rằng các enzyme tăng cường tốc độ phản ứng nhưng không làm thay đổi hằng số cân bằng. Nếu một phản ứng là thu nhiệt enzyme sẽ không chuyển dịch cân bằng và nhiều sản phẩm hơn sẽ được tạo thành. Các enzyme chỉ nâng cao tốc độ mà ở đó phản ứng diễn ra theo hướng cân bằng cuối cùng.

Để hiểu được enzyme xúc tác các phản ứng như thế nào ta hãy xem xét diễn biến của một phản ứng hoá học thải nhiệt bình thường sau đây:

A + B C + D

Khi các phân tử A và B tiếp cận nhau để phản ứng chúng sẽ tạo thành một phức hợp ở trạng thái quá độ chi cả cơ chất và sản phẩm (Hình 16.13)

Hình 16.13: Coenzyme như các chất mang

Chức năng của 1 coenzyme trong vai trò mang các chất đi khắp tế bào. Coenzyme C cùng với enzyme E1 tham gia ch uyển hóa A thành sản phẩm B. Trong quá trình phản ứng coenzyme C nhận X từ cơ chất A và có thể chuyển X sang cơ chất P trong phản ứng 2. Kết quả là coenzyme lại trở về dạng ban đẩu để sẵn sàng tiếp nhận 1X khác. Coenzyme không chỉ tham gia vào 2 phản ứng mà còn vận chuyển X đi khắp tế bào. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005)

Năng lượng hoạt hoá là cần nhằm mang các phân tử phản ứng tiếp xúc với nhau theo một cách chính xác để đạt được trạng thái quá độ (hay chuyển tiếp). Phức hợp ở trạng thái quá độ có thể phân ly để tạo thành các sản phẩm C và D. Sự khác nhau trong mức độ năng lượng tự do giữa các chất phản ứng và các sản phẩm là ∆Go'. Vì vậy, trong ví dụ nêu trên cân bằng sẽ nằm về phía các sản phẩm vì ∆Go' là âm (nghĩa là các sản phẩm ở mức năng lượng thấp hơn cơ chất). Trong hình 16.13 rõ ràng A và B không thể chuyển hoá thành C và D nếu chúng không được cung cấp một lượng năng lượng tương đương với năng lượng hoạt hoá. Enzyme thúc đẩy các phản ứng bằng cách hạ thấp năng lượng hoạt hoá. Do đó nhiều phân tử cơ chất hơn sẽ có năng lượng đầy đủ để tiếp cận nhau và tạo thành sản phẩm. Mặc dù hằng số cân bằng (hoặc ∆Go') không thay đổi nhưng cân bằng sẽ đạt được nhanh hơn khi có mặt enzyme do năng lượng hoạt hoá giảm.

Hình 16.14: Enzyme hạ thấp năng luợng hoạt hóa

Trong tiến trình của 1 phản ứng hóa học nêu trên A và B được chuyển thành C và D. Phức hợp chuyển tiếp được biểu thị bởi AB* và năng luợng hoạt hóa cần để đạt được trạng thái này bởi Ea. Đường đỏ biểu thị tiến trình của phản ứng trong sự có mặt của 1 enzyme. Cần chú ý, năng luợng hoạt hóa trong phản ứng có enzyme xúc tác thấp hơn rất nhiều. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005)

Sở dĩ enzyme có khả năng hạ thấp năng lượng hoạt hoá của các phản ứng vì chúng mang các cơ chất lại gần nhau tại một điểm đặc biệt gọi là vị trí hoạt động hoặc vị trí xúc tác để tạo thành phức hợp enzyme - cơ chất (Hình 16.15 và 16.16). Sự tương tác giữa cơ chất và enzyme có thể diễn ra theo hai con đường:

1. Enzyme có hình dạng cố định, khớp với hình dạng của cơ chất giúp cho cơ chất liên kết chính xác và thuận lợi cho phản ứng diễn ra.

2. Enzyme thay đổi hình dạng khi gắn với cơ chất tạo điều kiện cho vị trí xúc tác bao quanh và khớp chính xác với cơ chất.

Cơ chế diễn ra theo con đường thứ nhất được gọi là mô hình "ổ khoá và chìa khoá" (lock - and - key model). Theo con đường thứ hai cơ chế được gọi là mô hình "khớp cảm ứng" (induced fit). Mô hình này được ứng dụng cho hexokinase và nhiều enzyme khác (Hình 16.16).

Hình 16.15. Chức năng của enzyme. Sự tạo thành phức hợp enzyme-cơ chất và chuyển hóa phức hợp thành 1 sản phẩm. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005)

Việc tạo thành phức hợp enzyme - cơ chất có thể hạ thấp năng lượng hoạt hoá theo một số cách. Chẳng hạn, bằng cách mang các cơ chất lại gần nhau tại vị trí xúc tác, trên thực tế, enzyme đã làm tăng nồng độ của chúng và thúc đẩy phản ứng. Tuy nhiên, một enzyme không chỉ đơn giản làm đậm đặc nồng độ các cơ chất của chúng mà còn liên kết các cơ chất sao cho các cơ chất này hướng chính xác với nhau để tạo thành phức hợp ở trạng thái quá độ. Một sự định hướng như vậy sẽ hạ thấp lượng năng lượng mà các cơ chất cần để đạt được trạng thái quá độ. Các hoạt tính này và các hoạt tính khác của vị trí xúc tác đã tăng cường phản ứng hàng trăm nghìn lần bất kể vi sinh vật sinh trưởng giữa 200C và khoảng 1130C. Những nhiệt độ này không đủ cao để giúp cho hầu hết các phản ứng hữu cơ trong sự vắng mặt của enzyme, hơn nữa các tế bào không thể sống sót ở những nhiệt độ cao dùng bởi một nhà hoá học hữu cơ trong các quá trình tổng hợp hữu cơ thường ngày. Enzyme giúp cho sự sống tồn tại bằng cách thúc đẩy các phản ứng đặc biệt ở nhiệt độ thấp.

Hình 16.16. Một ví dụ về sự tạo thành phức hợp enzyme-cơ chất

a) Mô hình đầy đủ của hexokinase nấm men và cơ chất Glucose (màu tía). Vị trí hoạt động trong khe tạo thành bởi thùy nhỏ của enzyme (màu lục) và thùy lớn (màu xám). (b) Khi Glucose liên kết để tạo thành phức hợp enzyme-cơ chất hexokinase thay đổi hình dạng và bao quanh cỏ chất. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005)

16.2.3. Tác động của môi trường lên hoạt tính enzyme

Hoạt tính enzyme thay đổi rõ rệt với sự thay đổi của các yếu tố môi trường mà một trong các yếu tố quan trọng nhất là nồng độ cơ chất. Như ta đã biết, nồng độ các cơ chất bên trong tế bào thường thấp. Ở nồng độ cơ chất rất thấp enzyme chậm tạo thành sản phẩm do ít khi được tiếp xúc với phân tử cơ chất. Nếu có mặt nhiều phân tử cơ chất hơn enzyme sẽ liên kết cơ chất thường xuyên hơn và tốc độ phản ứng (thường được thể hiện như tốc độ tạo thành sản phẩm) cũng lớn hơn ở nồng độ cơ chất thấp hơn. Do đó tốc độ của một phản ứng do enzyme xúc tác tăng lên theo nồng độ cơ chất (Hình 16.17).

Tuy nhiên nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chất thì tốc độ phản ứng cũng không tăng nữa vì các phân tử enzyme đã bão hoà cơ chất và đang chuyển hoá cơ chất thành sản phẩm với tốc độ cực đại (Vmax). Đường cong của nồng độ cơ chất bây giờ sẽ là đường hyperbole (Hình 16.17). Để biết được nồng độ cơ chất mà một enzyme cần để hoạt động thích hợp người ta thường dùng hằng số Michaelis (Km). Đây là nồng độ cơ chất enzyme cần để thực hiện được một nửa tốc độ cực đại và được dùng như một đại lượng đo ái lực thực sự của một enzyme đối với cơ chất. Giá trị Km càng thấp có ý nghĩa là nồng độ cơ chất mà enzyme xúc tác phản ứng cũng càng thấp.Hoạt tính enzyme cũng thay đổi theo sự thay đổi của pH và nhiệt độ (hình 16.18).

Hình 16.17. Động học Michaelis-Menten

Velocity= tốc độ, Substrate concentration: nồng độ cơ chất

Sự phụ thuộc của hoạt tính enzyme vào nồng độ cơ chất. Đường cong cơ chất ở đây khớp với phương trình Michaelis-Menten cho trong hình; phương trình này liên kết tốc độ phản ứng (v) với nồng độ cơ chất (S) khi sử dụng tốc độ cực đại và hằng số Michaelis (Km). Km = nồng độ cơ chất enzyme cần để hoạt động ở nửa tốc độ cực đại. Vmax = tốc độ tạo thành sản phẩm khi enzyme được bão hòa cơ chất và hoạt động nhanh tối đa. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005)

Mỗi enzyme hoạt động mạnh nhất ở một pH thích hợp nhất. Khi pH chệch xa khỏi giá trị tối thích hoạt tính của enzyme sẽ giảm đi và enzyme có thể bị hư hại. Với nhiệt độ enzyme cũng có giá trị tối thích cho hoạt tính cực đại. Nếu nhiệt độ tăng quá cao so với giá trị tối thích cấu trúc của enzyme sẽ bị huỷ hoại và enzyme mất hoạt tính. Hiện tượng biến tính (denaturation) này của enzyme có thể là hậu quả của các giá trị quá độ (tột cùng) của pH và nhiệt độ hoặc các yếu tố khác. Các giá trị tối thích của pH và nhiệt độ của các enzyme vi sinh vật thường phản ánh pH và nhiệt độ nơi sống của chúng. Do đó, ta dễ hiểu, các vi khuẩn sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ cao thường có các enzyme với nhiệt độ tối thích cao và độ bền nhiệt độ lớn.

Hình 16.18: pH, nhiệt độ và hoạt tính enzyme

Sự thay đổi hoạt tính enzyme cùng với những thay đổi trong pH và nhiệt độ. Phạm vi pH và nhiệt độ ở đây chỉ là tượng trưng. Các enzyme khác nhau về vị trí của điểm tối thích và hình dạng của các đường cong pH và nhiệt độ. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005)

16.2.4. Sự kìm hãm enzyme

Nhiều hoá chất là độc đối vi sinh vật và những chất độc mạnh nhất chính là những chất kìm hãm enzyme. Một chất kìm hãm cạnh tranh trực tiếp cạnh tranh với cơ chất ở vị trí xúc tác của một enzyme và ngăn cản enzyme tạo thành sản phẩm. Chẳng hạn, succinate dehydrogenase là enzyme xúc tác sự oxy hoá succinate thành fumarate trong chu trình Krebs. Acid malonic có cấu trúc tương tự succinate do đó là chất kìm hãm cạnh tranh của enzyme nói trên. Sau khi liên kết vào enzyme malonat không bị oxy hoá và việc tạo thành fumarate không diễn ra. Các chất kìm hãm cạnh tranh thường chi với các cơ chất bình thường nhưng không thể bị chuyển hoá thành các sản phẩm.

Hình 16.19: Kìm hãm cạnh tranh của succinate-dehydrogenase

Acid malonic có cấu trúc tương tự acid succinic do đó là chất kìm hãm cạnh tranh của enzyme nói trên. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005)

Các chất kìm hãm cạnh tranh được sử dụng để điều trị nhiều bệnh do vi sinh vật. Chẳng hạn các thuốc sulfa như sulfanilamit chi với p-aminobenzoat là một phân tử dùng trong việc tạo thành coenzyme acid folic. Các thuốc cạnh tranh với p-aminobenzoat đối với vị trí xúc tác của một enzyme tham gia tổng hợp acid folic do đó ngăn cản sự tạo thành acid folic và kìm hãm sinh trưởng của vi khuẩn. Cơ thể người không chịu tác dụng của thuốc do không có khả năng tổng hợp acid folic và phải thu nhận acid này từ thức ăn.

16.3. TÍNH CHẤT VÀ Ý NGHĨA CỦA VIỆC ĐIỀU CHỈNH TRAO ĐỔI CHẤT

Bộ máy điều chỉnh có vai trò cực kỳ phức tạp và khó khăn. Các con đường cần phải điều chỉnh và phối hợp có hiệu quả sao cho tất cả các thành phần của tế bào đều có mặt với số lượng thích hợp, chính xác. Hơn nữa tế bào vi sinh vật phải có khả năng đáp ứng rất kịp thời với những thay đổi của môi trường bằng cách sử dụng các chất dinh dưỡng hiện có và bằng cách bật mở các con đường dị hoá mới khi có mặt các chất dinh dưỡng khác. Vì tất cả các thành phần hoá học của một tế bào thường không tồn tại trong môi trường, do đó vi sinh vật cũng phải tổng hợp chúng và phải thay đổi hoạt tính sinh tổng hợp đáp ứng với những thay đổi trong việc sử dụng chất dinh dưỡng. Thành phần hoá học của môi trường bao quanh tế bào thường xuyên thay đổi, do đó các quá trình điều chỉnh này cũng phải năng động và phải liên tục đáp ứng với các điều kiện thay đổi.

Việc điều chỉnh là cần thiết cho tế bào vi sinh vật duy trì được năng lượng, vật chất và cân bằng trao đổi chất. Nếu một nguồn năng lượng đặc biệt không có mặt, các enzyme cần cho việc sử dụng nguồn năng lượng này là không cần thiết và việc tổng hợp chúng tiếp tục sẽ là một sự tiêu phí C, N và năng lượng. Cũng tương tự như vậy, sẽ là rất vô ích đối với vi sinh vật nếu chúng tổng hợp các enzyme cần cho việc tạo thành một sản phẩm cuối cùng nào đó khi sản phẩm này đã có mặt với số lượng đầy đủ. Như vậy, cả dị hoá và đồng hoá đều được điều chỉnh theo cách sao cho hiệu quả của hoạt động đạt được tối đa.

Có thể thấy rõ xu hướng duy trì cân bằng và bảo tồn năng lượng của vật chất trong sự đáp ứng điều chỉnh ở vi khuẩn E. coli... Khi sinh trưởng trong một môi trường rất đơn giản chỉ chứa glucose là nguồn C và nguồn năng lượng vi khuẩn sẽ tổng hợp các thành phần mà tế bào cần với số lượng cân bằng (chẳng hạn acid amin tryptophan). Việc bổ sung một sản phẩm sinh tổng hợp cuối cùng vào môi trường sẽ dẫn đến kìm hãm ngay lập tức con đường tổng hợp sản phẩm cuối cùng nói trên. Việc tổng hợp các enzyme của con đường cũng sẽ bị ngừng hoặc chậm lại. Nếu chuyển E. coli sang môi trường chỉ chứa lactose, vi khuẩn sẽ tổng hợp các enzyme cần cho sự chuyển hoá đường này. Trái lại, khi sinh trưởng trong môi trường chứa cả glucose và lactose E. coli sẽ sử dụng glucose đầu tiên vì đây là loại đường đơn giúp cho sinh trưởng của vi khuẩn diễn ra nhanh nhất chỉ sau khi glucose đã cạn kiệt, lactose mới được sử dụng.

Dòng carbon chuyển hoá qua con đường có thể được điều chỉnh theo ba cách chủ yếu:

1. Tập trung các chất trao đổi và các enzyme trong những phần khác nhau của tế bào, từ đó ảnh hưởng đến hoạt tính của con đường,

2. Các enzyme quan trọng thường được kích thích hoặc bị kìm hãm trực tiếp nhằm thay đổi nhanh hoạt tính của con đường,

3. Số lượng các phân tử enzyme cũng có thể được điều hoà. Các phân tử chất xúc tác có mặt càng nhiều thì hoạt tính của con đường càng lớn. Ở vi khuẩn, việc điều chỉnh thường chịu tác dụng ở mức độ phiên âm. Việc điều hoà tổng hợp mRNA chậm hơn việc điều chỉnh trực tiếp hoạt tính enzyme nhưng tiết kiệm được nhiều năng lượng và nguyên liệu vì các enzyme không được tổng hợp khi không cần thiết.

Hai cơ chế 1 và 2 sẽ được trình bày ở đây, đó là: khu trú trao đổi chất và điều hoà hoạt tính enzyme.

16.4. KHU TRÚ TRAO ĐỔI CHẤT (Metabolic Channeling)

Một trong các cơ chế khu trú trao đổi chất phổ biến nhất là sự chia khoang (compartmentation) nghĩa là sự phân bố biệt hoá các enzyme và các chất trao đổi trong các cấu trúc tế bào tách biệt hoặc các bào quan có màng bao bọc. Chẳng hạn, sự oxy hoá acid béo gặp bên trong ti thể nhưng tổng hợp acid béo lại diễn ra trong tế bào chất. Chu chất ở vi khuẩn cũng có thể được xem là một ví dụ của sự chia khoang. Sự chia khoang tạo điều kiện cho việc hoạt động và điều chỉnh đồng thời nhưng tách biệt của các con đường có thể được phối hợp nhờ sự điều chỉnh việc vận chuyển các chất trao đổi và các coenzyme giữa các khoang của tế bào. Giả dụ, có hai con đường tồn tại trong các khoang tế bào khác nhau nhưng đều cần NAD+ cho hoạt động. Sự phân bố NAD+ giữa hai khoang sẽ quyết định hoạt tính tương đối của các con đường cạnh tranh này và con đường nào chiếm dư thừa NAD+ sẽ có lợi thế hơn.

Sự chia khoang cũng gặp bên trong các khoang như nền tế bào chất. Nền (matrix) là vật thể đông đặc, có cấu trúc gồm nhiều khoang nhỏ. Ở sinh vật nhân thật nền cũng được chia nhỏ bởi lưới nội chất (endoplasmic reticulum) và bộ khung tế bào (cytoskeleton). Trong một môi trường như vậy các chất trao đổi và các coenzyme không khuếch tán nhanh và các gradien chất trao đổi sẽ được thiết lập gần các enzyme hoặc các hệ thống enzyme cục bộ. Điều này diễn ra vì các enzyme ở một vị trí đặc biệt chuyển hoá các chất thành sản phẩm dẫn đến giảm nồng độ của một hoặc nhiều chất trao đổi này và tăng nồng độ của một hoặc nhiều chất trao đổi khác. Chẳng hạn, nồng độ sản phẩm sẽ cao ở gần enzyme và thấp dần theo khoảng cách tăng lên tính từ enzyme.

Sự khu trú có thể tạo ra những thay đổi rõ rệt trong nồng độ chất trao đổi và vì vậy ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt tính enzyme. Nồng độ cơ chất, nói chung, thường ở vào khoảng 10-3 - 10-6M/l, thậm chí thấp hơn, nghĩa là có thể ở trong cùng phạm vi như nồng độ enzyme và bằng hoặc nhỏ hơn hằng số Michaelis (Km) của nhiều enzyme. Dưới các điều kiện như vậy nồng độ cơ chất của một enzyme có thể điều hoà hoạt tính của chất xúc tác vì nồng độ cơ chất là ở trong phần tăng lên của đường cong hyperbole của sự bão hoà cơ chất (Hình 16.20).

Hình 16.20: Điều hòa hoạt tính enzyme bởi nồng độ cơ chất

Trong hình là đường cong bão hòa enzyme-cơ chất với hằng số Michaelis (Km) và tốc độ tương đương với ½ tốc độ cực đại (Vmax). Tốc độ ban đầu của phản ứng (v) được dựng đồ thị đối với nồng độ cơ chất. Tốc độ cực đại là tốc độ lớn nhất đạt được với một số lượng enzyme cố định dưới những điều kiện xác định. Khi nồng độ cơ chất bằng hoặc nhỏ hơn Km hoạt tính enzyme sẽ thay đổi hầu như tuyến tính với nồng độ cơ chất. Giả dụ, nồng độ cơ chất tăng từ mức độ A tới mức độ B. Vì những nồng độ này đều ở trong phạm vi của Km nên hoạt tính enzyme tăng lên rõ rệt. Sự giảm nồng độ từ B đến A sẽ hạ thấp tốc độ tạo thành sản phẩm. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005)

Khi nồng độ cơ chất tăng, cơ chất sẽ được chuyển thành sản phẩm nhanh hơn; nồng độ cơ chất giảm đương nhiên dẫn đến hoạt tính enzyme thấp hơn. Nếu 2 enzyme ở hai con đường khác nhau cùng sử dụng một chất trao đổi chúng có thể trực tiếp cạnh tranh chất này, con đường thắng trong cuộc cạnh tranh này, nghĩa là con đường với enzyme có giá trị Km thấp nhất đối với chất trao đổi, sẽ hoạt động gần như hoàn toàn thống trị. Do đó sự khu trú bên trong một khoang tế bào có thể điều chỉnh và phối hợp trao đổi chất thông qua những biến đổi trong nồng độ chất trao đổi và nồng độ coenzyme.

16.5. ĐIỀU HÒA HOẠT TÍNH ENZYME

Hoạt động của nhiều con đường trao đổi chất có thể được điều hoà nhờ việc điều chỉnh hoạt tính của các enzyme điều chỉnh. Mục này mô tả các enzyme nói trên và đề cập vai trò của chúng trong việc điều chỉnh hoạt tính của con đường.

16.5.1. Điều chỉnh dị lập thể

Các enzyme điều chỉnh thường là các enzyme dị lập thể (allosteric enzymes). Hoạt tính của một enzyme dị lập thể bị thay đổi bởi một phân tử nhỏ gọi là effector (effector, chất tác động) hoặc modulator (modulator, chất điều biến). Effector liên kết thuận nghịch nhờ lực không - cộng hoá trị vào một vị trí điều chỉnh (regulatory site) tách biệt khỏi vị trí xúc tác (catalytic site) và gây ra sự thay đổi trong hình dạng hoặc hình thể của enzyme (Hình 16.21). Hoạt tính của vị trí xúc tác do đó bị thay đổi. Một effector dương làm tăng hoạt tính enzyme, một effector âm, trái lại, làm giảm hoạt tính hoặc kìm hãm enzyme. Những thay đổi như vậy trong hoạt tính thường bắt nguồn từ những biến đổi trong ái lực biểu kiến của enzyme đối với cơ chất, tuy nhiên những thay đổi trong tốc độ cực đại cũng có thể diễn ra.

Hình 16.21: Điều chỉnh dị lập thể

Cấu trúc và chức năng của 1 enzyme dị lập thể. Trong hình bên effector hoặc modulator (chất điều biến) trước hết gắn vào 1 vị trí điều hòa tách biệt và làm thay đổi hình thể enzyme dẫn đến sự thay đổi hình dạng của vị trí hoạt động. Vị trí hoạt động giờ có thể liên kết cơ chất hiệu quả hơn. Ở đây effector là dương tính vì nó kích thích sự liên kết cơ chất và hoạt tính xúc tác. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005)

Hình 16.22: Sự điều chỉnh ACTase

Phản ứng Aspartate- carbamoyltransferase và vai trò của enzyme này trong việc điều chỉnh sinh tổng hợp pyrimidine. Sản phẩm cuối cùng CTP kìm hãm hoạt tính của ACTase (-) còn ATP lại hoạt hóa enzyme (+). Cacbamoyl Phosphate synthetase cũng bị kìm hãm bởi các sản phẩm cuối cùng của con đường như UMP. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005)

Các đặc tính động học của enzyme không - điều chỉnh chứng minh rằng hằng số Michaelis (Km) là nồng độ cơ chất cần cho một enzyme hoạt động ở tốc độ bằng nửa tốc độ cực đại. Hằng số này chỉ ứng dụng cho các đường cong bão hoà cơ chất hyperbole mà không cho các đường cong xích-ma thường gặp với các enzyme dị lập thể (Hình 16.23). Nồng độ cơ chất cần cho một nửa tốc độ cực đại với các enzyme dị lập thể có đường cong cơ chất xích-ma được gọi là giá trị [S]0,5 hoặc K0,5.

Một trong các enzyme điều chỉnh dị lập thể được nghiên cứu kỹ nhất đó là Aspartate-carbamoyltransferase (ACTase) ở E. coli. Enzyme xúc tác sự ngưng tụ của cacbamoylphosphate với aspartate tạo thành cacbamoylaspartate (Hình 16.22).

ACTase xúc tác phản ứng quyết định tốc độ của con đường sinh tổng hợp pyrimidine ở E. coli. Đường cong cơ chất bão hoà là xích-ma khi nồng độ của một trong hai cơ chất thay đổi (Hình 16.23)

Hình 16.23: Động học của Aspartate carbamoyltransferase ở E. coli

CTP là 1 effector âm làm tăng giá trị K0,5, còn ATP là 1 effector dương, hạ thấp K0,5. Vmax vẫn là hằng số. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005)

Enzyme có trên một vị trí hoạt động và sự liên kết của một phân tử cơ chất vào một vị trí hoạt động sẽ kích thích sự liên kết của cơ chất vào các vị trí khác. Hơn nữa, cytidine triphosphate (CTP), một sản phẩm cuối cùng của sinh tổng hợp pyrimidine, kìm hãm enzyme, trái lại ATP (purine) lại hoạt hoá enzyme. Cả hai effector thay đổi giá trị K0,5 của enzyme nhưng không thay đổi tốc độ cực đại của enzyme. GTP kìm hãm bằng cách nâng cao K0,5 hoặc chuyển dịch đường cong bão hoà cơ chất lên các giá trị cao hơn. Điều này cho phép enzyme hoạt động chậm hơn ở một nồng độ cơ chất đặc biệt khi CTP có mặt. ATP hoạt hoá bằng cách chuyển đường cong tới các giá trị nồng độ cơ chất thấp hơn khiến cho enzyme hoạt động cực đại qua một phạm vi nồng độ cơ chất rộng lớn. Do đó, khi con đường hoạt động tới mức nồng độ CTP tăng quá cao hoạt tính ACTase sẽ giảm và tốc độ tạo thành sản phẩm cuối cùng bị chậm lại. Trái lại, khi nồng độ sản phẩm cuối cùng ATP tăng lên so với CTP, ATP sẽ kích thích tổng hợp CTP thông qua tác dụng lên ACTase.

Aspartate carbamoyltransferase ở E. coli cung cấp một ví dụ rõ rệt về các vị trí điều chỉnh và vị trí xúc tác riêng rẽ trong các enzyme dị lập thể. Enzyme là một protein lớn gồm 2 dưới đơn vị xúc tác và 3 dưới đơn vị điều chỉnh (Hình 16.24a). Các dưới đơn vị xúc tác chỉ chứa các vị trí xúc tác và không chịu ảnh hưởng bởi CTP và ATP. Các dưới đơn vị điều chỉnh không xúc tác phản ứng nhưng có các vị trí điều chỉnh liên kết CTP và ATP. Khi liên kết vào enzyme hoàn toàn các effector này gây ra những thay đổi về hình thể trong các dưới-đơn vị điều chỉnh, sau đó trong các dưới đơn vị xúc tác và các vị trí xúc tác. Enzyme có thể thay đổi thuận nghịch giữa một dạng T ít hoạt động và một dạng R hoạt động hơn (Hình 16.24 b, c). Do đó vị trí điều chỉnh ảnh hưởng đến vị trí xúc tác ở khoảng cách khoảng 6,0 nm.

Hình 16.24: Cấu trúc và điều chỉnh của Aspartate carbamoyltransferase ở E. coli. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005)

16.5.2. Cải biến cộng hoá trị các enzyme

Các enzyme cũng có thể được kích thích hoặc bị kìm hãm thông qua sự cải biến cộng hoá trị thuận nghịch. Thông thường điều này diễn ra do việc thêm và loại bỏ một nhóm đặc biệt, nghĩa là một dạng của enzyme được hoạt động hơn một dạng khác. Chẳng hạn, glycogen phosphorylase của mốc bánh mì Neurospora crassa được gọi là phosphorylase a khi ở dạng phosphoryl hoá và phosphorylase b khi ở dạng bị loại bỏ Phosphate (Hình 16.25). Phosphorylase b là bất hoạt vì chất hoạt hoá AMP mà nó cần thường không có mặt ở mức độ đủ cao. Dạng phosphoryl hoá của phosphorylase a hoạt động ngay khi không có mặt AMP. Glycogen phosphorylase được kích thích thông qua việc phosphoryl hóa phosphorylase b thành phosphorylase a. Việc gắn nhánh Phosphate làm thay đổi hình thể của enzyme chuyển nó thành dạng hoạt động. Phản ứng phosphoryl hoá và loại bỏ Phosphate được xúc tác bởi các enzyme riêng rẽ và các enzyme này cũng được điều chỉnh.

Hình 16.25: Sự cải biến cộng hóa trị thuận nghịch của glycogen phosphorylase. Phosphorylase a là dạng hoạt động được tổng hợp bởi phosphoryl hóa và bị bất hoạt khi Phosphate bị loại bỏ do thủy phân để tạo thành phosphorylase b bất hoạt. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005)

Các enzyme cũng có thể được điều chỉnh nhờ liên kết với các nhóm khác Phosphate. Một trong các enzyme được nghiên cứu chi tiết nhất đó là Glutamine synthetase ở E. coli. Đây là một enzyme lớn, phức tạp tồn tại ở hai dạng. Khi một nhánh acid adenylic liên kết với một trong 12 dưới-đơn vị của enzyme tạo thành một enzyme adenyl hoá, glutamine synthetase hoạt động yếu. Việc loại bỏ các nhóm AMP tạo ra glutamine synthetase đã mất adenyl hoạt động hơn và glutamine được tổng hợp. Hệ thống glutamine synthetase khác hệ thống phosphorylase ở hai điểm: 1) AMP được dùng như tác nhân cải biến; 2) Dạng cải biến của Glutamine synthetase kém hoạt động. Glutamine synthetase cũng được điều chỉnh dị lập thể.

Việc sử dụng cải biến cộng hoá trị để điều chỉnh hoạt tính enzyme có một số ưu điểm. Các enzyme có thể chuyển hoá qua lại thường cũng là các enzyme dị lập thể. Vì mỗi dạng có thể đáp ứng khác nhau với các effector dị lập thể nên các hệ thống enzyme cải biến cộng hoá trị có khả năng đáp ứng với nhiều chất kích thích hơn trong các con đường thay đổi và phức tạp. Cũng có thể được điều chỉnh là các enzyme xúc tác những cải biến cộng hoá trị, bổ sung vào hệ thống một mức độ điều chỉnh thứ hai.

16.5.3. Kìm hãm phản hồi hoặc kìm hãm bởi sản phẩm cuối cùng (Feedback inhibition)

Như đã nói ở phần trên, tốc độ của nhiều con đường trao đổi chất được điều chỉnh thông qua sự điều khiển hoạt tính của các enzyme điều chỉnh. Mỗi con đường có ít nhất một enzyme dẫn-tốc độ (pacemaker) xúc tác phản ứng chậm nhất hoặc hạn chế tốc độ trong con đường. Vì các phản ứng khác diễn ra nhanh hơn phản ứng dẫn-tốc độ do đó những thay đổi trong hoạt tính của enzyme này trực tiếp ảnh hưởng đến tốc độ của con đường. Thông thường, bước thứ nhất trong một con đường là một phản ứng dẫn tốc độ xúc tác bởi một enzyme điều chỉnh. Sản phẩm cuối cùng của con đường thường kìm hãm enzyme điều chỉnh này. Quá trình nói trên được gọi là sự kìm hãm bởi sản phẩm cuối cùng. Kiểu kìm hãm này bảo đảm cho sự tạo thành cân bằng của sản phẩm cuối cùng của một con đường. Nếu tích luỹ với nồng độ quá cao sản phẩm cuối cùng sẽ kìm hãm enzyme điều chỉnh và làm giảm tốc độ tổng hợp của chính sản phẩm này. Khi nồng độ của sản phẩm cuối cùng giảm, hoạt tính của con đường lại tăng và nhiều sản phẩm hơn được tạo thành. Sự kìm hãm bởi sản phẩm cuối cùng, nhờ vậy, đã tự động phối hợp việc cung cấp theo nhu cầu của sản phẩm này. Aspartate carbamoyltransferase là một ví dụ điển hình của sự kìm hãm bởi sản phẩm một con đường sinh tổng hợp thường phân nhánh tạo thành trên một sản phẩm cuối cùng. Trong tình hình như vậy việc tổng hợp các sản phẩm cuối cùng của con đường phải được phối hợp một cách chính xác. Không thể để một sản phẩm cuối cùng này có mặt dư thừa trong khi một sản phẩm cuối cùng khác lại thiếu. Sự phân nhánh các con đường sinh tổng hợp thường tạo nên sự cân bằng giữa các sản phẩm cuối cùng qua việc sử dụng các enzyme điều chỉnh ở các điểm phân nhánh (Hình 16.26).

Khi có mặt ở nồng độ dư thừa một sản phẩm cuối cùng thường kìm hãm enzyme ở điểm phân nhánh trên chuỗi dẫn đến tạo thành sản phẩm này, nhờ vậy mà điều chỉnh việc tổng hợp của chính sản phẩm đó nhưng không ảnh hưởng đến tổng hợp các sản phẩm khác. Hình 16.26 cũng cho thấy cả 2 sản phẩm cũng kìm hãm enzyme mở đầu trong con đường. Sự dư thừa của một sản phẩm làm chậm dòng C đi vào cả con đường trong khi kìm hãm enzyme thích hợp ở điểm phân nhánh. Vì sự phân nhánh không hoạt động cần ít C do đó sự kìm hãm bởi sản phẩm cuối cùng của enzyme dẫn tốc độ ban đầu giúp cho sự điều hoà giữa cung và cầu ở các con đường phân nhánh. Việc điều chỉnh ở các con đường phân nhánh nhiều thường được thực hiện phức tạp hơn do sự có mặt của các izoenzyme tức là những enzyme khác nhau nhưng xúc tác cùng một phản ứng. Bước đầu dẫn tốc độ ban đầu có thể do một số izoenzyme xúc tác, mỗi izoenzyme chịu sự điều hoà riêng rẽ và độc lập. Trong tình hình như vậy, sự dư thừa của một sản phẩm cuối cùng sẽ làm giảm hoạt tính của con đường nhưng không hoàn toàn kìm hãm chức năng của con đường vì một số izoenzyme vẫn còn hoạt động.

Hình 16.26: Kìm hãm phản hồi

Trên hình là sự kìm hãm phản hồi trong 1 con đường phân nhánh với 2 sản phẩm cuối cùng. Các enzyme ở điểm phân nhánh xúc tác sự chuyển hóa chất trung gian E thành F và G được điều chỉnh bởi kìm hãm phản hồi. Các sản phẩm P và Q cũng kìm hãm phản ứng mở đầu trong con đường. Tín hiệu ① chỉ ra rằng P hoặc Q kìm hãm enzyme xúc tác bước tiếp theo tín hiệu. (Theo Prescott, Harley và Klein, 2005)

Chương 17.

GIẢI PHÓNG VÀ BẢO TOÀN NĂNG

LƯỢNG Ở VI SINH VẬT

Biên soạn: Nguyễn Đình Quyến, Nguyễn Lân Dũng

17.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ TRAO ĐỔI CHẤT

Sau khi đã đề cập đến các nguyên tắc cơ bản của nhiệt động học, chu trình năng

lượng và vai trò của ATP như đồng tiền năng lượng, bản chất và chức năng của các

enzyme cũng như việc điều chỉnh hoạt tính enzyme trong chương này chúng ta sẽ bàn về

trao đổi chất. Trao đổi chất là tổng số các phản ứng hóa học diễn ra bên trong tế bào nhờ

có dòng năng lượng và sự tham gia của các enzyme. Trao đổi chất có thể được chia thành

hai phần chủ yếu: dị hoá (catabolism) và đồng hoá (anabolism). Trong dị hoá các phân tử

lớn hơn và phức tạp hơn bị bẻ vỡ thành các phân tử nhỏ hơn và đơn giản hơn đồng thời

năng lượng được giải phóng. Một phần năng lượng này được giữ lại và tạo thành công,

phần còn lại thoát ra ở dạng nhiệt. Sau đó, năng lượng giữ lại có thể được dùng trong

đồng hoá là giai đoạn sau của trao đổi chất. Đồng hoá là việc tổng hợp các phân tử phức

tạp từ các phân tử đơn giản hơn và cần năng lượng. Quá trình đồng hoá sử dụng năng

lượng để làm tăng trật tự của một hệ thống.

Mặc dù việc phân chia trao đổi chất thành hai phần chủ yếu là tiện lợi và được sử

dụng phổ biến, tuy nhiên, cần nhớ rằng, không phải tất cả các quá trình sản sinh năng

lượng đều phù hợp với định nghĩa nói trên về sự dị hoá nếu như định nghĩa này không

được mở rộng bao gồm cả các quá trình không có sự phân giải các phân tử hữu cơ phức

tạp. Theo nghĩa rộng hơn các vi sinh vật thường sử dụng một trong ba nguồn năng lượng.

Vi sinh vật quang dưỡng thu nhận năng lượng bức xạ từ mặt trời (Hình 17.1). Vi sinh vật

hoá dưỡng hữu cơ oxy hoá các phân tử hữu cơ để giải phóng năng lượng, trái lại các vi

sinh vật hoá dưỡng vô cơ lại sử dụng các chất dinh dưỡng vô cơ làm nguồn năng lượng.

QUANG DƯỠNG HÓA DƯỠNG HỮU CƠ

Oxy hóa

hợp chất

HÓA DƯỠNG VÔ CƠ Chất hữu cơ Chất hữu

Chất hữu

cơ khử

hữu cơ khử cơ oxy hóa

Hóa năng

Công

Hình 17.1: Các nguồn năng luợng được sử dụng bởi vi sinh vật

Hầu hết vi sinh vật sử dụng 1 trong 3 nguồn năng luợng. Các vi sinh vật quang dưỡng thu nhận năng luợng bức xạ từ mặt trời nhờ các sắc tố như bacteriocholorophyll và cholorophyll. Các vi sinh vật hóa dưỡng oxy hóa các chất dinh dưỡng hữu cơ và vô cơ khử để giải phóng và thu nhận năng luợng. Hóa năng dẫn xuất từ 3 nguồn này sẽ được dùng để sản ra công. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Vi sinh vật không chỉ khác nhau về nguồn năng lượng mà còn khác nhau về các chất nhận electron được sử dụng ở các cơ thể hoá dưỡng (Hình 17.2).

Các chất nhận electron gồm ba loại chính. Trong lên men cơ chất mang năng lượng bị

oxy hoá và phân giải không có sự tham gia của một chất nhận electron từ bên ngoài hoặc

có nguồn gốc từ bên ngoài. Thông thường con đường dị hoá sản ra một chất trung gian

như Pyruvate tác dụng như chất nhận electron. Nói chung, lên men diễn ra trong điều

kiện kỵ khí nhưng đôi khi cũng được thực hiện ngày khi có mặt oxy. Dĩ nhiên, trao đổi

chất sản sinh năng lượng cũng có thể sử dụng các chất nhận electron từ bên ngoài hoặc có

nguồn gốc từ bên ngoài. Quá trình trao đổi chất này được gọi là hô hấp (respiration) và

được chia làm hai loại khác nhau: 1. Hô hấp hiếu khí: chất nhận electron cuối cùng là

oxy; 2. Hô hấp kỵ khí: chất nhận electron có nguồn gốc khác nhau từ bên ngoài. Chất

nhận electron trong hô hấp kỵ khí phổ biến nhất là chất vô cơ (chẳng hạn, NO3-, SO42+,

CO2, Fe3+, SeO42-...) nhưng đôi khi cũng là chất hữu cơ (như fumarat). Trong hô hấp

thường có sự tham gia của một chuỗi vận chuyển electron. Năng lượng thu được trong

lên men và hô hấp rất khác nhau. Chất nhận electron trong lên men có cùng trạng thái

oxy hoá như chất dinh dưỡng ban đầu và không có sự oxy hoá hoàn toàn chất dinh

dưỡng. Do đó chỉ một lượng nhỏ năng lượng được tạo thành. Chất nhận electron trong

các quá trình hô hấp có thế khử dương hơn nhiều so với cơ chất, do đó trong hô hấp năng

lượng được giải phóng nhiều hơn đáng kể. Trong hô hấp hiếu khí cũng như kỵ khí ATP

được tạo thành nhờ hoạt động của chuỗi vận chuyển electron. Các electron tham gia trong

chuỗi có thể thu được từ các chất dinh dưỡng vô cơ và năng lượng có thể bắt nguồn từ sự

oxy hoá các phân tử vô cơ hơn là từ các chất dinh dưỡng hữu cơ. Khả năng này gặp ở

một số vi sinh vật nhân nguyên thuỷ gọi là vi sinh vật hoá dưỡng vô cơ.

Chất cho e- hữu cơ Chất cho e- vô cơ

Lên men Hô hấp Hô hấp kị Hóa tự dưỡng

hiếu khí khí

Chất nhận

electron hữu cơ

nội sinh

Hình 17.2: Các kiểu giải phóng năng luợng

Lên men là quá trình giải phóng năng luợng trong đó một chất cho electron hữu cơ

chuyền các electron cho một chất nhận nội sinh thường là một chất trung gian bắt nguồn từ sự phân giải chất dinh dưỡng. Trong hô hấp, các electron được chuyền cho một chất nhận từ bên ngoài (ngoại sinh) như O2 (hô hấp hiếu khí) hay NO3-, SO42- (hô hấp kị khí). Các hợp chất khử vô cơ cũng có thể được dùng như các chất cho electron trong việc tạo thành năng luợng (sự hóa dưỡng vô cơ). (Theo: Prescott và cs, 2005)

Cũng cần nhớ rằng những định nghĩa về lên men, hô hấp hiếu khí và hô hấp kỵ khí

nói trên hơi khác với những định nghĩa dùng bởi các nhà sinh học và sinh hoá học. Lên

men cũng có thể được định nghĩa như là một quá trình sinh năng lượng trong đó các phân

tử hữu cơ được đồng thời dùng làm chất cho và chất nhận electron. Hô hấp là một quá

trình sinh năng lượng trong đó chất nhận là một phân tử vô cơ như oxy (hô hấp hiếu khí)

hay một chất vô cơ (hô hấp kỵ khí). Vì vi sinh vật rất linh hoạt và thay đổi trong trao đổi

năng lượng nên những định nghĩa nói trên chừng nào rộng hơn sẽ được dùng ở đây.

Giai đoạn 1

Giai đoạn 2

Giai đoạn 3

Chu trình acid

tricarboxylic

Chuỗi vận

chuyển

Hình 17.3: Ba giai đoạn của sự dị hóa

Sơ đồ tổng quát của sự dị hóa hiếu khí trong 1 vi sinh vật hóa dị dưỡng hữu cơ chỉ ra 3 giai đoạn trong quá trình này và vị trí trung tâm của chu trình acid tricarboxylic. Mặc dù có nhiều protein, polisaccarid và lipit nhưng chúng bị phân giải chỉ qua hoạt tính của 1 vài con đường trao đổi chất phổ biến. Chú ý, các đường ... ở đây chỉ dòng các electron mang bởi NADH và FADH2 tới chuỗi vận chuyển electron. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Trao đổi chất trong điều kiện hiếu khí có thể được chia thành 3 giai đoạn (Hình

17.3). Trong giai đoạn thứ nhất của sự dị hoá các phân tử chất dinh dưỡng lớn hơn

(protein, polisaccarid và lipit) bị thuỷ phân hoặc bị phân giải theo kiểu khác thành các

phần nhỏ hơn. Các phản ứng hoá học diễn ra trong giai đoạn này không sản sinh nhiều

năng lượng. Các acid amin, monosaccarid, acid béo, glycerol và các sản phNm khác của

giai đoạn này bị phân giải theo kiểu khác thành một số phân tử đơn giản hơn trong giai

đoạn hai như Acetyl-coenzyme A, Pyruvate và các chất trung gian của chu trình acid

tricarboxylic. Giai đoạn thứ hai có thể hoạt động trong điều kiện hiếu khí cũng như kỵ

khí và thường tạo thành một số ATP cũng như N ADH và/hoặc FADH2. Cuối cùng carbon

trong chất dinh dưỡng được chuyển vào chu trình acid tricarboxylic trong giai đoạn ba

của sự dị hoá và các phân tử được oxy hoá hoàn toàn thành CO2 đồng thời với sự tạo

thành ATP, N ADH và FADH2. Chu trình hoạt động hiếu khí và giải phóng nhiều năng

lượng. Phần lớn ATP bắt nguồn từ chu trình acid tricarboxylic (và các phản ứng của giai

đoạn 2) là do sự oxy hoá của N ADH và FADH2 nhờ chuỗi vận chuyển electron. Oxy

hoặc đôi khi, một phân tử vô cơ khác là chất nhận electron cuối cùng.

Mặc dù sơ đồ trình bày trên đã được đơn giản hoá đi nhiều nhưng vẫn thuận tiện

cho việc phân tích mô hình tổng quát của sự dị hoá. Cần chú ý rằng, vi sinh vật bắt đầu

với rất nhiều phân tử và ở mỗi giai đoạn số lượng và sự đa dạng của chúng bị giảm đi.

Nghĩa là, các phân tử chất dinh dưỡng được chuyển thành các chất trung gian trao đổi

chất với số lượng liên tục nhỏ hơn cho tới khi, cuối cùng, chúng đi vào chu trình acid

tricarboxylic một con đường chung thường phân giải nhiều phân tử tương tự, chẳng hạn

nhiều loại đường khác nhau. Các con đường trao đổi chất này bao gồm các phản ứng do

enzyme xúc tác được sắp xếp sao cho sản phNm của phản ứng này sẽ dùng làm cơ chất

cho phản ứng sau. Sự tồn tại của một số con đường dị hoá chung, mỗi con đường phân

giải nhiều chất dinh dưỡng, sẽ tăng rõ rệt hiệu quả trao đổi chất nhờ tránh được nhu cầu

đối với một số lượng lớn các con đường kém linh hoạt về trao đổi chất. Các vi sinh vật

thể hiện tính đa dạng về dinh dưỡng chính là trong pha dị hoá. Hầu hết các con đường

sinh tổng hợp ở vi sinh vật và ở các sinh vật bậc cao là khá chi nhau. Tính độc đáo của

trao đổi chất ở vi sinh vật là sự đa dạng các nguồn tạo thành ATP và N ADH (Hình 17.1

và 17.2).

Các hidrat carbon và các chất dinh dưỡng khác đảm nhiệm hai chức năng trong trao đổi chất của các vi sinh vật dị dưỡng:

1. Bị oxy hoá để giải phóng năng lượng.

2. Cung cấp các khối carbon hoặc khối xây dựng dùng cho tổng hợp các thành phần của tế bào mới.

Mặc dù nhiều con đường đồng hoá và dị hoá tách riêng nhau nhưng có một số con đường là lưỡng hoá (amphibolic) hoạt động cả trong đồng hoá và dị hoá. Hai trong số các con đường quan trọng nhất là đường phân và chu trình acid tricarboxylic. Hầu hết các phản ứng trong hai con đường này đều thuận nghịch dễ dàng và có thể được dùng để tổng hợp và phân giải các phân tử. Một số bước dị hoá một chiều được đi vòng trong sinh tổng hợp với các enzyme đặc biệt xúc tác phản ứng ngược lại (Hình 17.4).

Sự dị Sự đồng

hóa hóa

Hình 17.4: Con đường lưỡng hóa

Đây là sơ đồ của 1 con đường lưỡng hóa, chẳng hạn đường phân. Cần chú ý, sự chuyển hóa qua lại của các chất trung gian F và G được xúc tác bởi 2 enzyme riêng biệt: E1 hoạt động theo hướng phân giải và E2 theo hướng tổng hợp. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Chẳng hạn, enzyme fructo-bisphosphatease xúc tác ngược chiều với bước

phosphorusfructokinase khi glucose được tổng hợp từ Pyruvate. Sự tồn tại của hai

enzyme riêng rẽ, enzyme này xúc tác phản ứng ngược chiều với enzyme kia cho phép

chức năng dị hoá và đồng hoá của các con đường nói trên được điều chỉnh độc lập.

17.2. SỰ PHÂN GIẢI GLUCOSE THÀNH PYRUVATE

Vi sinh vật sử dụng một số con đường trao đổi chất để chuyển hoá glucose và các

đường khác. Do tính đa dạng về trao đổi chất như vậy mà trao đổi chất của chúng thường

rắc rối. Để tránh những rắc rối có thể xảy ra các con đường vi sinh vật phân giải đường

thành Pyruvate và các chất trung gian tương tự sẽ được tập trung vào ba con đường:

đường phân, con đường pentose-phosphate và con đường Entner - Doudoroff. Tiếp theo đó, các con đường phân giải Pyruvate hiếu khí và kỵ khí sẽ được đề cập. Để đơn giản, cấu trúc hoá học của các chất trung gian trong trao đổi chất sẽ không được dùng trong sơ đồ của con đường.

17.2.1. Con đường đường phân (con đường Embden-Meyerhof)

Đây là con đường phổ biến nhất dùng phân giải glucose thành pyruvate trong giai đoạn hai của dị hoá. Đường phân gặp ở tất cả các nhóm chủ yếu của vi sinh vật và hoạt động trong sự có mặt cũng như vắng mặt của oxy. Quá trình này diễn ra trong phần nền tế bào chất của cơ thể nhận nguyên thuỷ và nhân thật

Đường phân có thể được chia thành hai phần (Hình 17.5). Trong chặng mở đầu 6-

carbon glucose được phosphoryl hoá hai lần, cuối cùng được chuyển thành fructo-1,6-

bisphosphate. Các đường khác thường nhập vào con đường đường phân thông qua việc

chuyển hoá thành gluco-6-phosphate hoặc fructo-6-phosphate. Chặng mở đầu này không

sinh năng lượng, trái lại phải tiêu thụ hai phân tử ATP cho một phân tử glucose. Tuy

nhiên, nhờ việc gắn phosphate vào mỗi đầu của đường mà các phosphate này sẽ được

dùng để tạo thành ATP.

Chặng 3-carbon của đường phân bắt đầu khi enzyme fructo-1,6-bisphosphate

aldolase xúc tác phân giải fructo-1,6-bisphosphate thành hai nửa, mỗi nửa đều chứa nhóm

phosphate. Một trong các sản phNm là glyceraldehyde-3-phosphate được chuyển trực tiếp

thành Pyruvate trong quá trình gồm 5 bước. Sản phNm thứ hai là dihydroxyacetone-

phosphate có thể dễ dàng chuyển thành glyceraldehyde-3-phosphate, do đó cả hai nửa

của fructo-1,6-bisphosphate đều được sử dụng trong chặng 3-carbon. Trước hết,

glyceraldehyde-3-phosphate bị oxy hoá nhờ N AD+ là chất nhận electron, đồng thời một

nhóm phosphate được gắn vào để tạo thành 1,3-bisphosphate glycerate là một phân tử

cao năng. Sau đó phosphate cao năng ở carbon 1 được chuyển cho ADP và xuất hiện

ATP. Việc tổng hợp ATP nói trên được gọi là phosphoryl hoá ở mức độ cơ chất vì quá

trình phosphoryl hoá ADP liên kết với sự phân giải ngoại năng của một phân tử cơ chất

cao năng.

Một quá trình tương tự tạo thành một phân tử ATP thứ hai cũng nhờ phosphoryl hoá ở mức độ cơ chất. N hóm phosphate trên 3-phosphorusglycerate được chuyển sang carbon 2 và 2-phosphorusglycerate bị loại nước để tạo thành một phân tử cao năng thứ hai là phosphorusenol pyruvate. Phân tử này chuyển nhóm phosphate sang ADP tạo thành một ATP thứ hai và pyruvate là sản phNm cuối cùng của con đường.

Hình 17.5: Con đường đường phân

Trong hình là con đường đường phân phân giải glucose thành Pyruvate. 2 giai đoạn của con đường và các sản phẩm được trình bày ở đây. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Con đường đường phân phân giải một glucose thành 2 pyruvate qua chuỗi phản ứng mô tả như trên. ATP và N ADH cũng được tạo thành. Sản lượng của ATP và N ADH có thể tính được khi xem xét hai chặng riêng rẽ. Trong chặng 6-carbon hai ATP được dùng để tạo thành fructo-1,6-bisphosphate. Vì 2 glyceraldehyde-3-phosphate xuất hiện từ một glucose (1 từ dihydroxyacetone-phosphate) chặng 3-carbon tạo thành 4 ATP và 2 N ADH từ 1 glucose. N ếu trừ ATP dùng trong chặng 6-carbon ta sẽ được sản lượng thực là 2 ATP/glucose. Do đó sự phân giải glucose thành pyruvate trong đường phân có thể được biểu thị trong phương trình đơn giản sau:

Glucose + 2ADP + 2Pi + 2N AD+  2 Pyruvate + 2ATP + 2N ADH + 2H+

17.2.2. Con đường pentose-phosphate (con đường hexo-monophosphate)

Con đường này có thể được dùng đồng thời với con đường đường phân và con đường Entner - Doudoroff, diễn ra trong điều kiện hiếu khí cũng như kỵ khí và có vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp cũng như trong phân giải.

Con đường pentose-phosphate bắt đầu với việc oxy hoá gluco-6-phosphate thành

6-phosphorus-gluconat, tiếp theo là oxy hoá 6-phosphorusgluconat thành ribulo-5-

phosphate và CO2 (Hình 17.6).

N ADPH được tạo thành trong các phản ứng oxy hoá nói trên. Sau đó ribulo-5-

phosphate được chuyển thành một hỗn hợp gồm các đường phosphate 3 đến 7-carbon.

Hai enzyme đặc trưng của con đường đóng vai trò trung tâm trong những sự chuyển hoá

này là: 1) Transketolase xúc tác chuyển nhóm ketol 2 carbon và 2) Transaldolase xúc tác

chuyển nhóm 3-carbon từ sedoheptulo - 7 - phosphate với glyceraldehyde-3-phosphate

(Hình 17.7). Kết quả chung là 3 gluco-6-phosphate được chuyển thành 2 fructo-6-

phosphate, glyceraldehyde-3-phosphate và 3 phân tử CO2 theo phương trình sau:

3 gluco-6-phosphate + 6N ADP+ + 3H2O  2 fructo-6-phosphate + glyceraldehyde-3-phosphate + 3CO2 + 6 N ADPH + 6H+

Các chất trung gian nói trên được sử dụng trong hai con đường. Fructo-6-

phosphate có thể được chuyển trở lại thành gluco-6-phosphate, còn glyceraldehyde-3-

phosphate được chuyển thành Pyruvate bởi các enzyme của đường phân. Glyceraldehyde-3-phosphate cũng có thể trở lại con đường pentose-phosphate qua việc tạo thành gluco-6-phosphate. Điều này dẫn đến sự phân giải hoàn toàn gluco-6-phosphate thành CO2 và tạo thành một lượng lớn N ADPH:

Gluco-6-phosphate + 12N ADP+ + 7H2O  6 CO2 + 12N ADPH + 12H+ + Pi

Con đường pentose-phosphate có một số chức năng dị hoá và đồng hoá, chẳng

hạn:

1. N ADPH từ con đường pentose-phosphate được dùng làm nguồn electron cho việc khử các phân tử trong sinh tổng hợp.

2. Con đường tổng hợp các đường 4-carbon và 5-carbon dùng vào một số mục

đích. Đường 4-carbon erytro-4-phosphate được dùng để tổng hợp các acid amin thơm và

vitamin B6 (piridoxal). Ribo-5-phosphate là thành phần chủ yếu của các acid nucleic và

ribulo-1,5-diphosphate là chất nhận CO2 đầu tiên trong quang hợp. Tuy nhiên, khi một vi

sinh vật đang sinh trưởng trên một nguồn carbon là pentosese, con đường cũng có thể

cung cấp carbon cho việc tổng hợp hexose (glucose cần cho việc tổng hợp peptidoglican).

=

Hình 17.6: Con đường pentose-phosphate

Ở đây, 3 phân tử gluco-6-phosphate được chuyển hóa thành 2 fructo-6-phosphate và

glyceraldehyde-3-phosphate. Fructo 6-phosphate được chuyển hóa trở lại thành gluco-6-

phosphate. Glyceraldehyde-3-phosphate có thể được chuyển thành Pyruvate hay kết hợp với 1 phân tử dihydroxyacetone-phosphate (từ glyceraldehyde-3-phosphate tạo thành ở vòng thứ 2 của con đường) để sản ra fructo-6-phosphate. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Hình 17.7. Transketolase và transaldolase

Trong hình là các phản ứng xúc tác bởi 2 enzyme này. (Theo: Prescott và cs, 2005)

3. Các chất trung gian trong con đường pentose-phosphate có thể được dùng để tạo

thành ATP. Glyceraldehyde-3-phosphate từ con đường có thể đi vào chặng 3-carbon của

con đường đường phân và được chuyển thành ATP và Pyruvate. Pyruvate có thể bị oxy

hoá trong chu trình acid tricarboxylic để cung cấp nhiều năng lượng hơn. N goài ra, một

phần N ADPH có thể được chuyển thành N ADH để sản ra ATP khi N ADH bị oxy hoá

trong chuỗi vận chuyển electron. Vì các đường 5-carbon là những chất trung gian trong

con đường do đó con đường pentose-phosphate có thể được dùng để chuyển hoá

pentosese cũng như hexose.

Mặc dù có thể là nguồn năng lượng đối với nhiều vi sinh vật nhưng con đường

pentose-phosphate thường có vai trò quan trọng hơn trong sinh tổng hợp. Hơn nữa, tuy cả

hai con đường đường phân và pentose-phosphate đều sử dụng gluco-6-P nhưng mức độ

hoạt động của mỗi con đường tùy thuộc vào trạng thái sinh trưởng của tế bào. Trong giai đoạn sinh trưởng mạnh mẽ nhất 2 con đường được sử dụng với tỉ lệ 2:1 (EM: pentose-P). Tuy nhiên khi sinh trưởng chậm lại năng lực sinh tổng hợp cũng giảm theo, đồng thời N ADPH cũng như các phosphate đường C5 và C4 cần ít hơn khiến cho tỉ lệ giữa hai con đường bây giờ trở thành 10:1 thậm chí 20:1.

17.2.3. Con đường Entner-Doudoroff

Mặc dù đường phân là con đường phổ biến nhất dùng chuyển hoá các hexose thành pyruvate nhưng một con đường khác, tương tự cũng đã được phát hiện. Con đường Entner-Doudoroff mở đầu với các phản ứng chi như con đường pentose-phosphate tức là tạo thành gluco-6-phosphate và 6-phosphorus-gluconat (Hình 17.8).

Hình 17.8: Con đường Entner-Doudoroff

Thứ tự từ glyceraldehyde-3-phosphate tới Pyruvate được xúc tác bởi các enzyme chung

cho con đường đường phân. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Tuy nhiên, sau đó 6-phosphorus-gluconat không bị oxy tiếp mà bị loại nước tạo thành 2-keto-3-deoxy-6-phosphorusgluconat (KDPG) là chất trung gian chủ yếu trong con đường này. KDPG sẽ bị phân giải bởi KDPG aldolase thành Pyruvate và glyceraldehyde-3-phosphate. Glyceraldehyde-3-phosphate được chuyển thành pyruvate ở phần cuối của con đường đường phân. Con đường Entner-Doudoroff phân giải glucose thành pyruvate, 1 ATP, 1 N ADH và 1 N ADPH.

Hầu hết vi khuNn sử dụng các con đường đường phân và pentose-phosphate nhưng

một số lại sử dụng con đường Entner-Doudoroff thay cho đường phân. Con đường

Entner-Doudoroff thường gặp ở các chi Pseudomonas, Rhizobium, Azotobacter, Agrobacterium và một vài chi vi khuNn gram âm khác. Trong số các vi khuNn gram dương mới chỉ phát hiện Enterococcus faecalis sử dụng con đường nói trên.

Do con đường Entner-Doudoroff không tạo thành các phosphate đường C5 và C4 nên tế bào vẫn cần sự hoạt động đồng thời của cả con đường pentose-P.

Thử nghiệm đối với khả năng oxi hóa glucose bởi con đường Entner-Doudoroff đôi khi được sử dụng để xác định Pseudomonas trong phòng thí nghiệm lâm sàng.

17.3. LÊN MEN

Khi vắng mặt hô hấp hiếu khí hoặc kỵ khí N ADH không bị oxy hoá bởi chuỗi vận

chuyển electron do thiếu chất nhận electron từ bên ngoài. Tuy nhiên, N ADH tạo thành

trong con đường đường phân vẫn cần phải được oxy hoá trở lại thành N AD+. N ếu N AD+

không được tái tạo việc oxy hoá glyceraldehyde-3-phosphate sẽ không diễn ra và đường

phân sẽ ngừng hoạt động. Vì vậy chức năng chủ yếu của lên men là tái sản N AD+ cho

đường phân. Để khắc phục tình trạng trên nhiều vi sinh vật đã giảm hoặc làm ngừng hoạt

tính của enzyme pyruvate dehydrogenase và sử dụng pyruvate hay một trong các chất dẫn

xuất của pyruvate như chất nhận electron và hydro nhằm tái oxy hoá N ADH trong một

quá trình lên men (Hình 17.9). Ở đây chỉ giới thiệu một số quá trình lên men thường gặp

nhất. Trong lên men vi sinh vật cần chú ý hai điểm: 1) N ADH được oxy hoá thành N AD+

và 2) chất nhận electron thường là pyruvate hoặc một chất dẫn xuất từ pyruvate. Trong

lên men cơ chất bị oxy hoá một phần, ATP chỉ được tạo thành bởi phosphoryl hoá ở mức

độ cơ chất và O2 là không cần thiết.

N hiều nấm và một số vi khuNn, tảo và động vật nguyên sinh lên men đường thành

etanol và CO2 trong một quá trình gọi là lên men etylic. Pyruvate bị loại CO2 thành

Acetaldehyd, sau đó Acetaldehyd bị khử thành etanol nhờ sự xúc tác của alcohol-

dehydrogenase với N ADH là chất cho electron (Hình 17.10, số 2). Quá trình lên men thứ

hai gọi là lên men lactic còn gặp phổ biến hơn. Đây là sự khử Pyruvate thành lactat (Hình

17.10, số 1). Lên men lactic diễn ra ở vi khuNn (vi khuNn lactic, Bacillus), tảo (Chlorella), một số mốc nước, động vật nguyên sinh thậm chí ở cả cơ xương của động vật. Các vi sinh vật lên men lactic có thể được chia thành hai nhóm: nhóm lên men lactic đồng hình sử dụng con đường đường phân và trực tiếp khử hầu hết pyruvate thành lactat nhờ sự xúc tác của enzyme lactat dehydrogenase; nhóm lên men lactic dị hình tạo thành một lượng lớn các sản phNm không phải lactat, trong đó nhiều loài tạo thành lactat, etanol và CO2 qua con đường phosphorusketolase.

Đường phân

Các con

đường lên

Hình 17.9: Oxy hóa lại NADH trong lên men

NADH từ đường phân được oxy hóa lại nhờ được dùng để khử pyruvate hay 1 chất dẫn xuất của pyruvate (X). Kết quả là xuất hiện lactat hoặc sản phẩm khử Y. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Lên men etylic và lên men lactic là hai quá trình lên men rất có ích cho con người. Lên men etylic do nấm men được dùng để sản xuất các loại đồ uống có chứa cồn; CO2 thoát ra từ quá trình lên men này có tác dụng làm nở bột mì. Mặc dù có thể gây hư hỏng thực phNm nhưng lên men lactic được dùng phổ biến để muối dưa, cà, sản xuất sữa chua, nem chua, ủ chua thức ăn cho gia súc.

N hiều vi khuNn, đặc biệt là các cá thể trong họ Enterobacteriaceae có thể chuyển hoá Pyruvate thành acid formic và các sản phNm khác trong một quá trình đôi khi được gọi là lên men formic (Hình 17.10, số 5). N hờ formic - hydroliase (là phức hợp gồm ít nhất hai enzyme) acid formic có thể bị phân giải thành H2 và CO2:

HCOOH  CO2 + H2

Hình 17.10: Một số quá trình lên men phổ biến ở vi sinh vật

Để cho đơn giản ở đây chỉ giới thiệu các quá trình lên men Pyruvate; trên thực tế nhiều

phân tử hữu cơ khác cũng có thể được lên men. Hầu hết các quá trình lên men này đã được đơn

giản hóa bằng cách loại bỏ 1 hoặc nhiều bước và các chất trung gian. (Theo: Prescott và cs,

2005)

1. Vi khuẩn acid lactic (Streptococcus, Lactobacillus, Bacillus)

2. Nấm men, Zymomonas

3. Vi khuẩn acid propionic (Propionibacterium)

4. Enterobacter, Serratia, Bacillus

5. Vi khuẩn đường ruột (Escherichia, Enterobacter, Salmonella, Proteus).

6. Clostridium

Có hai loại lên men formic. Lên men acid hỗn hợp cho sản phNm là etanol và một

hỗn hợp các acid đặc biệt là acetic, lactic, succinic và formic (bảng 17.2).N ếu formic

hydroliase có mặt acid formic sẽ bị phân giải thành H2 và CO2. Dạng lên men này gặp ở

Escherichia, Salmonella, Proteus và một số chi khác. Lên men butandiol đặc trưng ở các chi Enterobacter, Serratia, Erwinia và một số loài của Bacillus (Hình 17.10, số 4). Pyruvate được chuyển hoá thành acetoin, sau đó acetoin bị khử thành 2,3-butandiol với N ADH. Một lượng lớn etanol cũng được tạo thành cùng với những lượng nhỏ các acid gặp trong lên men acid hỗn hợp.

Bảng 17.1: Các sản phẩm lên men acid hỗn hợp ở E. coli. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Lên men formic rất có ích trong việc xác định các cá thể của họ Enterobacteriaceae. Các vi khuNn lên men butandiol có thể được phân biệt với các vi khuNn lên men acid hỗn hợp ở ba điểm sau:

1. Thử nghiệm (test) Voges-Proskauer là một phương pháp so màu dùng phát hiện tiền chất acetoin của butandiol (Hình 17.10). Thử nghiệm này chỉ dương tính với các vi khuNn lên men butandiol.

2. Các vi khuNn lên men acid hỗn hợp tạo thành các sản phNm acid nhiều hơn 4 lần các sản phNm trung tính, trong khi các vi khuNn lên men butandiol tạo thành các sản phNm trung tính là chủ yếu. Do đó các vi khuNn lên men acid hỗn hợp acid hoá rất rõ rệt môi trường nuôi cấy. Đây là cơ sở của thử nghiệm đỏ metil (methyl red). Thử nghiệm là dương tính chỉ với lên men acid hỗn hợp vì pH giảm xuống dưới 4,4 và màu của chất chỉ thị chuyển từ vàng sang đỏ.

3. CO2 và H2 xuất hiện đẳng lượng do hoạt tính của formic-hydroliase trong lên

men acid hỗn hợp. Các vi khuNn lên men butandiol tạo thành dư thừa CO2 và tỉ lệ CO2/H2

xấp xỉ 5:1.

Các vi khuNn lên men formic đôi khi tạo thành ATP trong việc tái oxy hoá N ADH. Chúng sử dụng Acetyl-CoA để tổng hợp Acetyl-phosphate sau đó nhóm phosphate này được chuyển đến ADP.

Acetyl-CoA + Pi  CoA.SH + Acetyl-P Acetyl-P + ADP  Acetat + ATP

Các vi sinh vật tiến hành các quá trình lên men khác với các quá trình nói trên. Động vật nguyên sinh và nấm thường lên men đường thành lactat, etanol, glycerol, succinat, format, acetat, butandiol và các sản phNm bổ sung.

Hình 17.11: Phản ứng Stickland

Alanin bị oxy hóa thành acetat và glixin được dùng để oxy hóa lại NADH sản ra trong sự

phân giải alanin. Lên men cũng tạo thành ATP. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Các chất không phải đường cũng được lên men bởi vi sinh vật. Chẳng hạn, một số

loài của chi Clostridium thường lên men các hỗn hợp acid amin. Các clostridia phân giải

protein như các vi khuNn gây bệnh. C. sporogenes và C. botulinum thực hiện phản ứng

Stickland trong đó một acid amin bị oxy hoá trong khi một acid amin thứ hai tác dụng

như chất nhận electron. Phản ứng Stickland điển hình là phản ứng trong đó alanin bị oxy

hoá và glixin bị khử để tạo thành acetat, CO2 và N H3. ATP được sản ra từ Acetyl-P nhờ

phosphoryl hoá ở mức độ cơ chất và kiểu lên men này rất thích hợp cho các vi khuNn khi

sinh trưởng trong môi trường kỵ khí giàu protein. Phản ứng Stickland được dùng để oxy hoá một số acid amin như: alanin, leucin, isoleucin, valin, phenylalanin, tryptophan và histamin. Các acid amin khác như glicin, glutamate, threonine, arginin và cả alanin cũng được vi khuNn lên men nhưng theo cơ chế khác. N goài đường và acid amin các acid hữu cơ như acetat, lactat, propionat và citrat cũng được lên men. Một số quá trình lên men nói trên có ý nghĩa rất quan trọng trong thực tế chẳng hạn citrat có thể được chuyển thành diacetyl tạo cho sữa lên men hương vị thơm ngon.

17.4. CHU TRÌNH ACID TRICARBOXYLIC

Mặc dù một phần năng lượng có thể thu được từ sự phân giải glucose thành pyruvate qua các con đường nói trên nhưng phần lớn năng lượng lại được giải phóng khi pyruvate bị phân giải hiếu khí thành CO2 trong giai đoạn 3 của sự dị hoá.

Phức hợp đa enzyme pyruvate dehydrogenase trước hết oxy hoá pyruvate thành CO2 và acetyl - CoA cũng là một phân tử cao năng bao gồm coenzyme A và acid acetic nối với nhau qua liên kết cao năng tiol este (Hình 17.12).

Acetyl-CoA xuất hiện từ sự phân giải của nhiều hidrat carbon, lipit và các acid

amin (hình 17.3) có thể bị phân giải tiếp trong chu trình Acid tricarboxylic (TCA) hoặc

cũng gọi là chu trình Krebs. Cơ chất đối với chu trình TCA là Acetyl-CoA (Hình 17.12).

Khi xem xét chu trình này ta cần chú ý đến các chất trung gian, các sản phNm và hoá học

của mỗi chặng. Trong phản ứng thứ nhất Acetyl-CoA kết hợp với Oxaloacetate (chất

trung gian 4C) thành citrat và mở đầu chặng 6C. Citrat (chứa 3 gốc COOH) được sắp xếp

lại tạo thành izocitrat. Sau đó izocitrat bị oxy hoá và loại carboxyl hai lần sản ra -

ketoglutarat rồi succinyl-CoA. Ở chặng này 2N ADH được tạo thành và 2C bị tách khỏi chu trình như CO2 (Chú ý: Ở vi khuNn phản ứng izocitrat  -ketoglutarat sử dụng N ADP+). Vì 2C được bổ sung ở dạng Acetyl-CoA lúc ban đầu nên cân bằng được duy trì và không có carbon nào bị mất. Bây giờ chu trình đi vào giai đoạn 4C trong đó qua hai bước oxy hoá xuất hiện một FADH2 và một N ADH. N goài ra, GTP (một phân tử cao năng tương đương ATP) được tạo thành từ succinyl-CoA nhờ phosphoryl hoá ở mức độ cơ chất. Cuối cùng 0xaloacetat được tái tạo và sẵn sàng kết hợp với một phân tử acetylCoA khác. Từ hình 5.12 nhận thấy chu trình TCA sản ra 2 CO2, 3 N ADH, 1 FADH2 và 1GTP đối với mỗi phân tử Acetyl-CoA bị oxy hoá.

6 carbon

4 carbon

5

carbon

Hình 17.12: Chu trình acid tricarboxylic

Chu trình có thể được chia thành 3 giai đoạn dựa vào số lượng các chất trung gian. 3 giai đoạn được tách riêng bởi 2 phản ứng loại carboxyl. (phản ứng trong đó nhóm carboxyl bị mất đi ở dạng CO2. Phức hệ Pyruvate-dehydrogenase tạo thành Acetyl-CoA qua oxy hóa Pyruvate. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Đứng về mặt chức năng có thể xem chu trình TCA là con đường oxy hoá AcetylCoA thành CO2. Ở đây, bước đầu tiên là việc gắn nhóm acetyl vào chất mang acetyl tức là oxaloacetate để tào thành citrat. Bước thứ hai bắt đầu với citrat và kết thúc với việc tạo thành succinyl-CoA. Ở đây, phần mang acetyl của citrat mất đi 2C khi bị oxy hoá để cho 2CO2. Bước thứ ba và bước cuối cùng chuyển succinyl-CoA trở lại oxal-acetat (chất mang acetyl) rồi chất này lại kết hợp với một nhóm acetyl khác.

Các enzyme của chu trình TCA gặp phổ biến trong vi sinh vật. Chu trình hoàn

toàn hoạt động ở nhiều vi khuNn hiếu khí, động vật nguyên sinh sống tự do, hầu hết tảo

và nấm. Điều này là dễ hiểu vì chu trình là nguồn năng lượng rất quan trọng. Tuy nhiên,

E. coli kị khí không bắt buộc không sử dụng chu trình đầy đủ trong điều kiện kị khí hay

khi nồng độ glucose cao nhưng sử dụng chu trình đầy đủ trong những trường hợp khác.

Mặc dù thiếu chu trình hoàn chỉnh nhưng E. coli thường vẫn có hầu hết các enzyme của TCA vì một trong các chức năng chủ yếu của chu trình này là cung cấp bộ khung carbon dùng cho sinh tổng hợp.

17.5. SỰ VẬN CHUYỂN ELECTRON VÀ PHOSPHORYL HÓA OXY HÓA

Khi một phân tử glucose bị oxy hoá thành 6 phân tử CO2 qua con đường đường phân và chu trình TCA chỉ khoảng 4 phân tử ATP được tạo thành, còn hầu hết ATP thu được là từ sự oxy hoá N ADH và FADH2 trong chuỗi vận chuyển electron.

17.5.1. Chuỗi vận chuyển electron

Chuỗi vận chuyển electron được nghiên cứu kỹ nhất là chuỗi ở ti thể. Chuỗi bao gồm một dãy các chất mang electron hoạt động phối hợp với nhau để vận chuyển electron từ các chất cho như N ADH và FADH2 tới các chất nhận như O2 (Hình 17.13).

Phức hệ I

Phức hệ

III

Phức hệ

II

Phức

hệ IV

Vị trí gần trong chuỗi

Hình 17.13: Chuỗi vận chuyển electron ti thể

Các chất mang quan trọng hơn được sắp xếp theo thể khử và thứ tự tương đối chính xác.

Trong ti thể chúng được tổ chức thành 4 phức hợp liên kết với nhau bởi CoQ và Cytochrome c.

Các electron di chuyển từ NADH và succinat xuôi theo gradien thế khử tới oxy. (Theo: Prescott

và cs, 2005)

Các electron di chuyển từ các chất mang với thế khử âm hơn tới các chất mang với

thế khử dương hơn, cuối cùng kết hợp với O2 và H+ tạo thành nước. Các electron vận

chuyển xuôi theo gradien thế năng tương tự như nước chảy xuôi qua một dãy thác ghềnh.

Sự khác nhau trong thế khử giữa O2 và N ADH là lớn, khoảng 1,14V giúp cho việc giải

phóng một lượng lớn năng lượng. Sự thay đổi thế năng ở một số điểm trong chuỗi đủ lớn

để cung cấp năng lượng cho việc tạo thành ATP tương tự như năng lượng từ thác nước

chảy xuống các bánh xe dùng để sản xuất điện. Chuỗi vận chuyển electron đã phân tách

toàn bộ năng lượng thoát ra thành các bước nhỏ. Một phần năng lượng giải phóng được

bảo tồn ở dạng ATP. Việc vận chuyển electron ở những bước này có thể tạo ra các

gradien proton và gradien điện tích. Sau đó các gradien này có thể hướng dẫn tổng hợp

ATP.

Khoang giữa màng

Chất nền

Hình 17.14: Giả thuyết hóa thẩm thấu áp dụng vào ti thể

Trong sơ đồ các chất mang được tổ chức không đối xứng bên trong màng trong sao cho các proton di chuyển qua màng trong khi các electron được chuyển dọc theo chuỗi. Việc giải phóng proton vào khoang giữa các màng diễn ra khi các electron được chuyển từ các chất mang như FMN và CoQ (vận chuyển cả electron và proton) tới các thành phần như các protein sắt không-hem (các protein FeS) và các Cytochrome a tới O2. CoQ vận chuyển các electron từ các phức hợp I và II đến phức hợp III. Cytochrome c vận chuyển các electron giữa các phức hợp III và IV. Số lượng proton di chuyển qua màng ở mỗi vị trí đối với một cặp electron được vận chuyển vẫn còn chưa chắc chắn nhưng có lẽ ít nhất 10 proton phải di chuyển ra phía ngoài trong quá trình oxy hóa NADH. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Các chất mang trong chuỗi vận chuyển electron nằm bên trong màng trong của ti

thể hoặc màng sinh chất ở vi khuNn. Sở dĩ vậy vì: (1) Các chất này cần ở sát gần nhau để

thuận tiện cho việc chuyền các electron cho nhau; (2) Mục đích của chuỗi là bơm H+ qua

màng để tạo thành gradient H+, do đó nếu không có màng cũng sẽ không có gradient. Hệ

thống ti thể được sắp xếp thành 4 phức hợp các chất mang, mỗi phức hợp có thể vận chuyển một phần của các electron của con đường tới O2 (Hình 17.14). Coenzyme Q và Cytochrome c liên kết các phức hợp với nhau.

Quá trình nhờ đó năng lượng từ sự vận chuyển electron được dùng để tổng hợp ATP được gọi là phosphoryl hoá oxy hoá. Do đó cứ 3 phân tử ATP có thể được tạo thành từ ADP và Pi mỗi khi một cặp electron chuyển từ N ADH tới một nguyên tử của O2. Điều này cũng chi như nói tỉ lệ của phosphorus đối với oxy (P/O) là bằng 3. Vì các electron từ FADH2 chỉ đi qua hai điểm phosphoryl hoá oxy hoá nên tỉ lệ P/O cực đại đối với FADH2 là 2. Ở ti thể tỉ lệ P/O thực sự có thể nhỏ hơn 3 và 2.

Mặc dù một số chuỗi hô hấp ở vi khuNn tương tự như ở ti thể nhưng nói chung

chúng rất khác. Chẳng hạn các chất mang electron (ví dụ các Cytochrome) thường không

chi nhau và các chuỗi ở vi khuNn có thể phân nhánh mạnh mẽ. Các electron thường có thể

đi vào chuỗi ở một số điểm và rời khỏi chuỗi qua một số oxydase tận cùng. Các chuỗi ở

vi khuNn cũng có thể ngắn hơn và có tỉ lệ P/O thấp hơn các chuỗi ở ti thể. N hư vậy, các

chuỗi vận chuyển electron ở sinh vật nhân nguyên thuỷ và sinh vật nhân thật khác nhau

trong chi tiết về cấu trúc mặc dù chúng đều hoạt động theo các nguyên tắc cơ bản chi

nhau.

N hững sự khác nhau trong chuỗi vận chuyển electron thể hiện rõ rệt ở E. coli và

Paracoccus denitrificans. Hình 17.15 là sơ đồ đơn giản chuỗi vận chuyển electron ở E.

coli. Mặc dù vi khuNn này vận chuyển các electron từ N ADH tới các chất nhận và vận

chuyển các proton qua màng sinh chất nhưng chuỗi vận chuyển ở E. coli hoàn toàn khác

với ở ti thể. Chẳng hạn, chuỗi ở E. coli phân nhánh và chứa các Cytochrome rất khác

nhau. CoQ hoặc ubiquinol cung cấp các electron cho cả hai nhánh nhưng chúng hoạt

động dưới các điều kiện sinh trưởng khác nhau. N hánh Cytochrome d có ái lực rất cao

đối với oxy và hoạt động ở nồng độ oxy thấp. N hánh này hoạt động kém hiệu quả hơn

nhánh Cytochrome o vì không chủ động bơm proton. N hánh Cytochrome o có ái lực cao

trung bình đối với oxy,là một bơm proton và hoạt động ở nồng độ oxy cao hơn.

Paracoccus denitrificans là một vi khuNn đất, gram âm, kị khí không bắt buộc, có

thể sinh trưởng dị dưỡng với hàng loạt chất dinh dưỡng hoặc tự dưỡng với H2 và CO2

nhờ NO 3  là chất nhận electron. Chuỗi vận chuyển electron hiếu khí gồm 4 phức hợp chi

như ở ti thể (hình 17.16a). N goài các chất cho như N ADH, succinat vi khuNn nói trên còn

oxy hoá metanol, metylamin như nguồn carbon duy nhất cho sinh trưởng. Các electron đi

vào chuỗi ở vị trí Cytochrome c. Metanol bị oxy hoá thành formaldehit, chất này được

chuyển thành CO2 và đi vào chu trình Calvin. Khi vi khuNn sinh trưởng kỵ khí với

NO 3  là chất nhận electron chuỗi sẽ được sắp xếp hoàn toàn khác (Hình 17.16b).

Hiếu khí

thấp

Pha cân

Màng sinh

chất

Hiếu khí cao

Pha log

Hình 17.15: Hệ thống hô hấp hiếu khí ở E. coli.

NADH là nguồn electron. Ubiquinone-8 (Q) liên kết NADH-dehydrogenaza với 2 hệ thống oxydaza tận cùng. Nhánh phía trên hoạt động khi vi khuẩn ở pha ổn định và chứa ít oxy. Ít nhất 5 Cytochrome tham gia vào đây là b558, b559, b562, d và o. Nhánh phía dưới hoạt động khi E. coli sinh trưởng nhanh và nồng độ oxy cao. (Theo: Prescott và cs, 2005).

Phức hợp Cytochrome aa3 không hoạt động. Các electron từ Cytochrome c của chuỗi được chuyển tới nitrite -, oxyd nitric - và oxyd nitro reductase. N itrate reductase nhận electron từ CoQ. Số lượng proton tách khỏi màng sắp xếp theo kiểu này là không lớn nhưng nhờ vậy vi khuNn có khả năng sinh trưởng kỵ khí.

Hình 17.16: Các chuỗi vận chuyển electron ở Paracoccus denitrificans

(a) Chuỗi vận chuyển hiếu khí chi với chuỗi vận chuyển electron ở ti thể và sử dụng oxy

là chất nhận electron. Metanol và metilamin cũng có thể chuyển electron cho Cytochrome c. (b)

Chuỗi vận chuyển kị khí phân nhánh mạnh mẽ được thực hiện bởi cả các protein của màng và

các protein chu chất. Nitrate bị khử thành nitơ phân tử nhờ tác dụng phối hợp của 4 reductase

khác nhau tiếp nhận các electron từ CoQ và xit.c. Vị trí di chuyển của proton được chỉ rõ nhưng

số lượng proton bao gồm thì còn chưa chắc chắn. Ghi chú: FP= flavoprotein; MD = metanol-

dehydrogenase; Nar = nitrate reductase; Nir = nitrite reductase; Nor = oxyt nitric reductase; Nos = oxyt nitrơ reductase. (Theo: Prescott và cs, 2005)

17.5.2. Phosphoryl hoá oxy hoá

Mặc dù đã được nghiên cứu tích cực trong nhiều năm nhưng chỉ gần đây cơ chế của phosphoryl hoá oxy hoá mới được chấp nhận rộng rãi theo giả thuyết hoá thNm thấu (chemiosmosis) do nhà sinh hoá người Anh Peter Mitchell đề xuất đầu tiên vào năm 1951. Theo giả thuyết này chuỗi vận chuyển electron được sắp xếp sao cho các proton được đNy từ chất nền ti thể ra phía ngoài, còn các electron thì được vận chuyển bên trong chuỗi (hình 17.17). Sự di chuyển của proton có thể xuất phát từ các núm (loop) của chất mang (hình 17.14) hay từ tác dụng của các bơm proton đặc biệt thu được năng lượng nhờ sự vận chuyển electron. Kết quả là xuất hiện một động lực proton (proton motive force, PMF) bao gồm một gradien proton và một thế hiệu màng do sự phân bố không đều của điện tích. Khi các proton di chuyển trở lại chất nền ti thể nhờ PMF ATP sẽ được tổng hợp ngược chiều với phản ứng thuỷ phân ATP (hình 17.17).

Khoang trong

màng

Chất nền

Hình 17.17: Hóa thẩm thấu

Sơ đồ giả thuyết hóa thẩm thấu áp dụng cho chức năng của ti thể. Dòng electron từ

NADH tới oxy tạo điều kiện cho các proton di chuyển từ chất nền (matrix) ti thể tới khoang giữa

các màng. Kết quả là sự xuất hiện của các gradien proton và gradien điện tích. Khi các proton

chuyển trở lại chất nền qua phức hợp F1F0, F1 sẽ tổng hợp ATP. Ở vi khuẩn quá trình diễn ra

tương tự nhưng các proton di chuyển từ tế bào chất đến chu chất. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Ở vi khuNn cũng diễn ra quá trình tương tự: dòng electron tạo điều kiện cho các

proton di chuyển ra phía ngoài qua màng sinh chất (Hình 17.15 và 17.16) sau đó ATP

được tổng hợp khi các proton này khuếch tán trở lại tế bào. PMF cũng có thể hướng dẫn

vận chuyển các phân tử qua màng cũng như sự quay của tiên mao nghĩa là đóng vai trò

trung tâm trong sinh lý học của vi khuNn (Hình 17.18). Giả thuyết hoá thNm thấu được

chấp nhận bởi hầu hết các nhà vi sinh vật học. Việc tạo thành gradien proton và gradien

điện tích qua màng đã được chứng minh rõ rệt. Tuy nhiên, chứng cớ gradien proton là

động lực trực tiếp của phosphoryl hoá oxy hoá vẫn chưa được khẳng định. Ở một số vi

khuNn biển ưa mặn các ion natri có thể được dùng để hướng dẫn tổng hợp ATP.

Vận chuyển

electron

Động lực proton

Sự quay của tiên

mao vi khuẩn

Quang hợp

Vận chuyển

chủ động

Hình 17.18: Vai trò trung tâm của động lực proton (Proton Motive Force

Cần chú ý rằng việc vận chuyển chủ động không phải bao giờ cũng được hướng dẫn bởi PMF.

(Theo: Prescott và cs, 2005)

Hình 17.19: Cấu trúc và chức năng của ATP-synthase

(a) Các đặc tính cấu trúc chủ yếu của ATP-synthase. F1 là cấu trúc hình cầu bao gồm chủ yếu là

các dưới-đơn vị luân phiên  và ; 3 vị trí hoạt động nằm trên các dưới-đơn vị . Dưới đơn vị 

kéo dài lên trên qua trung tâm của cấu trúc hình cầu và có thể quay. Phần cuống (các dưới đơn

vị  và ) nối hình cấu với F0; F0 là phức hợp bên trong màng đóng vai trò như 1 kênh proton. F0

chứa 1 dưới đơn vị a, 2 dưới đơn vị b và 9-12 dưới đơn vị c. Nhánh stato bao gồm dưới đơn vị a,

2 dưới đơn vị b và dưới đơn vị ; nhánh stato nằm trong màng và gắn với F1. Một vòng các đưới

đơn vị c trong F0 được nối với cuống và có thể tác dụng như 1 roto và chuyển động qua 1 dưới

đơn vị của stato. Khi vòng dưới đơn vị c quay nó sẽ làm quay trục (các dưới đơn vị  ). (b) Sơ

đồ tổng hợp ATP theo cơ chế liên kết thay đổi trong đó thể cầu F1 được nhìn từ phía màng. 3 vị

trí hoạt động có thể tồn tại ở 3 hình thể khác nhau: 1 hình thể mở, bất hoạt (O) với ái lực thấp

đối với cơ chất và 1 hình thể L bất hoạt có ái lực khá lỏng lẻo đối với cơ chất và 1 hình thể chặt

hoạt động (T) có ái lực cao đối với cơ chất. Trong bước đầu tiên ADP và Pi gắn vào vị trí O.

Tiếp theo dưới đơn vị  quay 120o nhờ năng luợng có lẽ từ dòng proton di chuyển qua F0. Sự

quay này gây ra những thay đổi hình thể trong tất cả 3 dưới đơn vị dẫn đến việc giải phòng ra

ATP mới được tạo thành và việc chuyển hóa vị trí L thành 1 hình thể T hoạt động. Cuối cùng

ATP được tổng hợp ở vị trí T mới trong khi ADP và Pi lại được liên kết vào vị trí O còn trống và

mọi việc lại sẵn sàng cho sự quay tiếp của dưới đơn vị  hướng dẫn nhờ năng luợng. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Dù cơ chế nào là chính xác, việc tổng hợp ATP đều diễn ra trên F1F0 ATPase

hoặc ATP-synthase (Hình 17.19). Thành phần F1 ở ti thể có cấu trúc hình cầu gắn vào bề

mặt màng bên trong ti thể bởi một cuống, còn thành phần F0 được lắp vào màng. F1F0 -

ATPase ở vi khuNn lại nằm ở bề mặt bên trong của màng sinh chất. F0 tham gia vào việc

di chuyển của proton qua màng và việc di chuyển này qua một rãnh trong F0 có thể dùng

để hướng dẫn phosphoryl hoá oxy hoá. F1 là một phức hợp lớn chứa 3 dưới - đơn vị α

luân phiên với 3 dưới - đơn vị . Dưới - đơn vị γ kéo dài từ phức hợp α3β3 xuống phía

dưới. Dưới - đơn vị này bao gồm một phần của cuống và tương tác với F0. Dưới - đơn vị

δ cũng nằm ở phần cuống. Phần lớn dưới - đơn vị γ gặp ở trung tâm của F1 được bao

quanh bởi các dưới - đơn vị  và . Dưới - đơn vị  quay nhanh theo hướng trái chiều

kim đồng hồ bên trong phức hợp α3β3 tựa như trục quay ô tô và gây ra những thay đổi

hình thể hướng dẫn tổng hợp ATP ở các vị trí hoạt động trên các dưới - đơn vị  (Hình

17.19b). Do đó ATP - synthase là một động cơ quay nhỏ nhất hiện biết, nhỏ hơn nhiều so với tiên mạo vi khuNn.

Ở nồng độ đủ cao nhiều hoá chất kìm hãm tổng hợp ATP trong điều kiện hiếu khí và thậm chí có thể giết chết tế bào. Các chất kìm hãm này, nói chung, có thể được phân thành hai loại. Một số ngăn cản trực tiếp việc vận chuyển electron. Chất kháng sinh pierixidin cạnh tranh với CoQ; chất kháng sinh antimixin A cản trở việc vận chuyển electron giữa các Cytochrome b và c; xianit và azit làm ngừng việc vận chuyển electron giữa Cytochrome a và O2 do chúng có cấu trúc tương tự với O2.

Một nhóm chất kìm hãm khác gọi là chất cách li (uncoupler) có tác dụng đình chỉ

tổng hợp ATP nhưng không ức chế việc vận chuyển electron. Trên thực tế, các chất cách

li cũng có thể nâng cao tốc độ di chuyển của electron. Thông thường, sự vận chuyển

electron liên kết chặt chẽ với phosphoryl hoá oxy hoá sao cho tốc độ tổng hợp ATP điều

hoà tốc độ vận chuyển electron. Tổng hợp ATP trong phosphoryl hoá oxy hoá diễn ra

càng nhanh thì chuỗi vận chuyển electron hoạt động để cung cấp năng lượng cần thiết

cũng càng nhanh. Các chất cách li tách riêng phosphoryl hoá oxy hoá khỏi vận chuyển

electron. Vì vậy, năng lượng do chuỗi thải ra sẽ ở dạng nhiệt chứ không phải ATP. N hiều

chất cách li như dinitrophenol và valinomixin có thể cho phép các ion H+, K+ và các ion

khác qua màng mà không hoạt hoá F1F0-ATPase. Kết quả là các gradien pH và ion bị phá

huỷ. Valinomixin cũng có thể liên kết trực tiếp với F1F0-ATPase và kìm hãm hoạt tính

của enzyme này.

17.5.3. Sản lượng của ATP trong đường phân và hô hấp hiếu khí

Sản lượng cực đại của ATP ở các sinh vật nhân thật trong quá trình đường phân,

chu trình TCA và vận chuyển electron có thể được tính toán dễ dàng. Sự chuyển hoá

glucose thành 2 pyruvate trong đường phân cho 2N ADH và 2 ATP. Vì 1 N ADH ở tế bào

chất có thể sản ra cực đại 2-3 ATP trong vận chuyển electron và phosphoryl hoá oxy hoá

(tỉ lệ P/O = 2 hoặc 3), tổng sản lượng ATP khi có mặt O2 của con đường phân là 6-8 phân

tử.

Bảng 17.2: Sản lượng ATP từ sự oxy hóa glucose ở tế bào nhân thật.

(Theo: Prescott và cs, 2005)

Khi O2 có mặt và chuỗi vận chuyển electron hoạt động pyruvate sẽ bị oxy hoá tiếp

thành Acetyl-CoA tức cơ chất cho chu trình TCA. Phản ứng này sản ra 2N ADH vì 2

pyruvate xuất hiện từ một glucose, do đó 6ATP nữa được tạo thành. Việc oxy hoá một

phân tử Acetyl-CoA trong chu trình TCA sản ra 1GTP (hoặc ATP), 3N ADH và 1FADH2

nghĩa là nếu 2 phân tử Acetyl - CoA bị oxy hoá trong chu trình trên thì sẽ xuất hiện 2GTP

(ATP), 6N ADH và 2FADH2. Theo bảng 9.2 việc oxy hoá N ADH và FADH2 trong chu

trình thông qua chuỗi vận chuyển electron sẽ cung cấp tối đa là 38ATP. Tuy nhiên,

những tính toán được tóm tắt và trình bày ở bảng 9.2 chỉ là lý thuyết và dựa vào tỉ lệ P/O

(số lượng ATP tạo thành khi một nguyên tử oxy bị khử bởi 2 electron trong sự vận

chuyển electron) là 3 đối với việc oxy hoá N ADH và 2 đối với việc oxy hoá FADH2.

Trên thực tế tỉ lệ P/O có lẽ vào khoảng 2,5 đối với N ADH và 1,5 đối với FADH2. N hư

vậy tổng sản lượng ATP trong điều kiện hiếu khí có thể xấp xỉ chỉ 30 hơn là 38ATP.

Vì các hệ thống vận chuyển electron ở vi khuNn thường có tỉ lệ P/O thấp hơn hệ

thống ở ti thể nên sản lượng ATP ở vi khuNn trong điều kiện hiếu khí có thể ít hơn.

Chẳng hạn, E. coli với chuỗi vận chuyển electron ngắn có tỉ lệ P/O khoảng 1,3 khi sử

dụng nhánh cytochrome bo ở nồng độ oxy cao và chỉ 0,67 khi sử dụng nhánh

Cytochrome bd (Hình 17.15) ở nồng độ oxy thấp. Trong trường hợp này việc tạo thành

ATP thay đổi tuỳ theo điều kiện môi trường. Có lẽ vì thường sống ở những nơi như

đường ruột rất giàu chất dinh dưỡng mà E. coli không cần phải tổng hợp ATP thật hiệu

quả. Chuỗi vận chuyển electron chỉ hoạt động khi E. coli sống trong môi trường nước

ngọt, hiếu khí giữa các vật chủ.

Rõ ràng, hô hấp hiếu khí hiệu quả hơn rất nhiều so với các quá trình kỵ khí không

bao gồm sự vận chuyển electron và phosphoryl hoá oxy hoá. Chẳng hạn, dưới điều kiện

kỵ khí khi N ADH không bị oxy hoá bởi chuỗi vận chuyển electron chỉ 2ATP được tạo

thành trong sự phân giải glucose thành pyruvate. Khi chuyển từ điều kiện kỵ khí sang

điều kiện hiếu khí nhiều vi sinh vật giảm mạnh mẽ tốc độ phân giải đường và chuyển

sang hô hấp hiếu khí. Đây là một hiện tượng điều chỉnh được gọi là hiệu ứng Pasteur.

Hiệu ứng này có lợi rõ ràng cho vi sinh vật vì chỉ cần phân giải một lượng đường ít hơn

mà vẫn thu được sản lượng ATP như nhau do quá trình hiếu khí đem lại hiệu quả hơn.

17.6. HÔ HẤP KỴ KHÍ

Các electron dẫn xuất từ đường và các phân tử hữu cơ khác thường được chuyển cho các chất nhận electron hữu cơ nội sinh hoặc cho O2 thông qua chuỗi vận chuyển electron (hình 17.2). Tuy nhiên nhiều vi khuNn có các chuỗi vận chuyển hoạt động với các chất nhận electron từ bên ngoài khác O2. Quá trình sản sinh năng lượng này được gọi là hô hấp kỵ khí. Các chất nhận electron chủ yếu là nitrate, sulfate và CO2 nhưng các kim loại và một số phân tử hữu cơ cũng có thể bị khử (bảng 17.3).

Một số vi khuNn có thể sử dụng nitrate làm chất nhận electron và tổng hợp ATP.

Quá trình này thường được gọi là sự khử nitrate dị hoá (dissimilatory nitratee reduction).

N itrate có thể bị khử thành nitrite bởi nitrate - reductase là enzyme thay thế Cytochromeoxydase.

!

N O3- + 2e + 2H+  N O2-+H2O

Tuy nhiên sự khử nitrate thành nitrite không phải là con đường thu nhận ATP có

hiệu lực vì để sinh trưởng vi khuNn cần một lượng lớn nitrate (1 phân tử nitrate chỉ nhận 2

electron). N itrite tạo thành lại rất độc. Vì vậy nitrate thường bị khử tiếp thành N 2 trong

quá trình gọi là phản nitrate hóa (denitrification). Mỗi nitrate sẽ nhận 5e và sản phNm sẽ

là không độc.

2 N O3- + 10e- + 12H+  N 2 + 6H2O

Phản nitrate hoá là một quá trình nhiều bước bao gồm 4 enzyme tham gia: nitrate-, nitrite-, oxyt nitric- và oxyt nitrơ-reductase.

N O3- N O2-  N O  N 2O N 2

Đáng chú ý, một trong các chất trung gian là oxyt nitric (N O). Ở động vật có vú

N O tác dụng như một chất dẫn truyền thần kinh đóng vai trò điều chỉnh huyết áp và được

các đại thực bào sử dụng để tiêu diệt vi khuNn cũng như các tế bào u. Ở vi khuNn có hai

loại nitrite reductase xúc tác sự tạo thành N O: một loại chứa các Cytochrome c và d1 (ở

Paracoccus và Pseudomonas aeruginosa) và một loại là protein chứa đồng (ở

Alcaligenes). Ở vi khuNn gram âm nitrite reductase có lẽ nằm trong chu chất. Oxyt nitric

reductase xúc tác việc tạo thành oxyt nitrơ từ N O và là một phức hợp Cytochrome bc gắn

vào màng. Phản nitrate được nghiên cứu kỹ ở vi khuNn đất, gram âm Paracoccus

denitrificans; vi khuNn này có khả năng khử nitrate thành N 2 trong điều kiện kỵ khí.

Chuỗi vận chuyển electron ở chúng chứa nitrate - reductase và oxyt nitric - reductase gắn

vào màng còn nitrite reductase và oxyt nitrơ - reductase thì tồn tại trong chu chất (Hình

17.16b). 4 enzyme sử dụng các electron từ CoQ và các Cytochrome typ c để khử nitrate và sản ra PMF.

Phản nitrate hoá gặp ở một số loài thuộc các chi Pseudomonas, Paracoccus và Bacillus. Chúng sử dụng con đường này thay cho hô hấp hiếu khí bình thường và có thể được xem là các vi khuNn kỵ khí tuỳ tiện. Khi O2 có mặt chúng thực hiện hô hấp hiếu khí (tổng hợp nitrate reductase bị kiềm chế bởi O2). Trong đất kỵ khí phản ứng nitrate hoá dẫn đến sự mất (tổn thất) nitơ của đất và ảnh hưởng xấu đến độ phì của đất.

Hai nhóm vi khuNn chủ yếu khác sử dụng hô hấp kỵ khí là các vi khuNn kỵ khí bắt

buộc. Bọn sử dụng CO2 hoặc carbonat làm chất nhận electron tận cùng được gọi là các vi

khuNn sinh metan vì chúng khử CO2 thành metan (CH4). Sulfate cũng có thể đóng vai trò

như chất nhận electron tận cùng ở vi khuNn Desulfovibrio. Sulfate bị khử thành sulfua (S2- hoặc H2S) và 8 electron được tiếp nhận.

SO42- + 8e- + 8H+  S2- + 4H2O

Bảng 17.3: Một số chất nhận electron được dùng trong hô hấp.

(Theo: Prescott và cs, 2005)

So với hô hấp hiếu khí - hô hấp kỵ khí kém hiệu quả hơn trong việc tổng hợp ATP

nghĩa là việc phosphoryl hoá oxy hoá với các chất nhận electron tận cùng là nitrate,

sulfate hoặc CO2 cho ít ATP hơn. Sản lượng ATP giảm đi bắt nguồn từ chỗ các chất nhận

electron nói trên có thể khử kém dương hơn so với O2. Sự khác nhau trong thế khử giữa

chất cho như N ADH và nitrate là nhỏ hơn sự khác nhau giữa N ADH và O2. Vì sản lượng

năng lượng trực tiếp liên quan với độ lớn của sự khác nhau trong thế khử nên ít năng

lượng hơn được cung cấp cho việc tạo thành ATP trong hô hấp kỵ khí. Tuy nhiên hô hấp

kỵ khí là có ích vì có hiệu quả hơn lên men và cho phép tổng hợp ATP nhờ vận chuyển electron và phosphoryl hoá oxy hoá trong điều kiện vắng mặt O2. Hô hấp kỵ khí chiếm ưu thế trong các đất và các bùn kỵ khí.

Thường ta quan sát sự kế tiếp của các vi sinh vật trong một môi trường khi có mặt

một số chất nhận electron. Chẳng hạn, nếu trong môi trường đặc biệt tồn tại O2, nitrate,

ion mangan, ion ferric (Fe3+), sulfate và CO2 ta sẽ thấy diễn ra thứ tự dự đoán của việc sử

dụng chất nhận electron khi có mặt một cơ chất có thể oxy hoá thích hợp với chủng quần

(population) vi sinh vật. Oxy được sử dụng trước tiên như một chất nhận electron vì nó

kìm hãm việc sử dụng nitrate bởi các vi sinh vật có khả năng hô hấp với O2 cũng như với

nitrate. Khi O2 có mặt caácvi khuNn khử sulfate và vi khuNn sinh metan bị kìm hãm vì

chúng là bọn kỵ khí bắt buộc.

Một khi O2 và nitrate bị cạn kiệt và các sản phNm lên men, kể cả hydro, được tích

luỹ thì sẽ bắt đầu diễn ra sự cạnh tranh sử dụng cac chất nhận electron khác. Mangan và

sắt sẽ được sử dụng đầu tiên, tiếp theo là sự tranh giành giữa vi khuNn sử dụng sulfate và

vi khuNn sinh metan. Sự cạnh tranh chịu ảnh hưởng bởi sản lượng năng lượng lớn hơn

thu được với sulfate là chất nhận electron. Cũng quan trọng là sự khác nhau trong ái lực

của enzyme đối với hydro vì đây là cơ chất phổ biến của cả hai nhóm vi khuNn. Vi khuNn

khử sulfate Desulfovibrio sinh trưởng nhanh và sử dụng hydro sẵn có với tốc độ nhanh

hơn Methanobacterium. Khi sulfate cạn kiện Desulfovibrio không oxy hoá hydro nữa và

nồng độ hydro tăng lên. Cuối cùng vi khuNn sinh metan chiếm ưu thế và khử CO2 thành

CH4.

17.7. SỰ PHÂN GIẢI CÁC HIDRAT CARBON VÀ CÁC POLIME DỰ TRỮ NỘI

BÀO

N goài glucose vi sinh vật có thể phân giải nhiều loại hidrat carbon. Các hidrat carbon có thể bắt nguồn từ bên ngoài tế bào hay từ những nguồn nội bào. Các bước mở đầu trong sự phân giải các hidrat carbon từ bên ngoài thường khác với các bước mở đầu sử dụng với các polime dự trữ nội bào.

17.7.1. Các hidrat carbon

Một số con đường phân giải các monosaccarid (đường đơn) như gluco-, fructo-,

manno- và galactose được trình bày ở Hình 17.20. Ba đường đơn đầu tiên được

phosphoryl hoá nhờ ATP và dễ dàng đi vào con đường đường phân. Trái lại, galactose,

sau phản ứng phosphoryl hoá mở đầu phải được chuyển thành uridin diphosphate

galactose rỗi trong một quá trình 3 bước được chuyển thành gluco-6-phosphate (hình

17.20).

Hình 17.20: Sự phân giải hydrate carbon

Trong hình là những ví dụ về các enzyme và các con đường dùng phân giải disaccarid và monosaccarid. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Các disaccarid thông thường bị phân giải thành các monosaccarid bởi ít nhất hai

cơ chế (Hình 17.20). Malto-, saccaro- và lactose có thể bị thủy phân trực tiếp thành các

đường đơn. N hiều disaccarid như malto-, xenlobio- và saccarose cũng bị phân giải bởi

sự tấn công của nhánh phosphate trên liên kết nối giữa hai đường; quá trình này được gọi

là phân giải nhờ phosphate hay gọi tắt là lân phân (phosphorolysis). Cũng như các

disaccarid các polisaccarid bị phân giải bởi cả thuỷ phân và lân phân. Vi khuNn và nấm

phân giải các polisaccarid ngoại bào nhờ tiết ra các enzyme thuỷ phân phân giải các

polisaccarid thành các phân tử nhỏ hơn, sau đó các phân tử này được đồng hoá. Tinh bột

và glicogen bị thuỷ phân bởi amilase thành glucose, maltose và các sản phNm khác.

Cellulose khó bị phân giải hơn; nhiều nấm và một số vi khuNn (vi khuNn trượt, clostridia và các xạ khuNn) tổng hợp xenlulase thuỷ phân cellulose thành cellobiose và glucose.

Một số loại thuộc chi Cytophaga phân lập từ biển có khả năng tiết ra enzyme agarase phân giải thạch. N hiều vi khuNn đất và vi khuNn gây bệnh thực vật tổng hợp enzyme phân giải pectin là polime của acid galacturonic (một dẫn xuất của galactose), acid này là một thành phần quan trọng của mô và thành tế bào thực vật.

Đáng chú ý, vi sinh vật cũng có khả năng phân giải các chất lạ (xenobiotic) rất bền

vững. Đây không phải là các chất do sinh vật tổng hợp mà làdo con người tạo ra. Chẳng

hạn các chất trừ sinh vật hại (pesticides) và các hợp chất thơm khác nhau. N hờ sử dụng

các enzyme và các con đường đặc biệt vi sinh vật chuyển hoá các chất này thành các chất

trung gian trao đổi chất bình thường sau đó tiếp tục phân giải theo con đường thông

thường. Phanerochaete chrysosporium là một loài nấm đặc biệt có khả năng phân giải

các chất lạ

17.7.2. Các polime dự trữ

Vi sinh vật thường phải sống từng thời gian dài trong điều kiện thiếu vắng chất dinh dưỡng từ bên ngoài. Trong hoàn cảnh như vậy chúng phải tiến hành phân giải các chất dự trữ nội bào như glicogen, tinh bột, poli-β-hydroxybutyrat... Glycogen và tinh bột bị phân giải nhờ các enzyme phosphorylase. Enzyme này xúc tác phản ứng lân phân dẫn tới làm ngắn chuỗi polisaccarid một glucose và sản ra gluco-1-phosphate.

(Glucose)n + Pi  (Glucose)n-1 + gluco-1-P

Glucos-1-phophate có thể đi vào con đường đường phân qua con đường gluco-6-

photphate (Hình 17.20). Poli-β-hydroxybutyrate (PHB) là một chất dự trữ quan trọng,

phổ biến và sự phân giải PHB đã được nghiên cứu kỹ ở Azotobacter. Vi khuNn này thuỷ

phân PHB thành 3-hydroxybutirat sau đó oxy hoá hydroxybutirat thành acetoacetat.

Acetoacetat được chuyển thành Acetyl-CoA và Acetyl-CoA có thể bị oxy hoá trong chu

trình TCA.

17.8. PHÂN GIẢI LIPID

Vi sinh vật thường sử dụng lipit làm nguồn năng lượng. Các triglixerit hoặc

triaxilglycerol, các este của glycerol và các acid béo (hình 17.21) là các nguồn năng

lượng phổ biến. Chúng có thể bị thuỷ phân thành glycerol và các acid béo bởi các lipase

vi sinh vật. Sau đó glycerol được phosphoryl hoá rồi được oxy hoá thành

dihydroxyacetone phosphate và bị phân giải trong con đường đường phân (hình 17.5).

Hình 17.21: Một triaxilglycerol hoặc triglixerit

Các nhóm R biểu thị các chuỗi bên là acid béo. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Các acid béo từ các triaxilglycerol và các lipit khác thường bị oxy hoá trong con đường β-oxy hoá sau khi chuyển thành các este của coenzyme A (Hình 17.22).

Hình 17.22:  - Oxy hóa acid béo. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Trong chu trình này các acid béo bị phân giải thành acetyl-CoA; Acetyl-CoA có thể đi vào chu trình TCA hay được sử dụng trong sinh tổng hợp. Mỗi vòng của chu trình sản ra Acetyl-CoA, N ADH và FADH2. N ADH và FADH2 có thể bị oxy hoá trong chuỗi vận chuyển electron tạo thành nhiều ATP hơn. Acid-CoA ngắn đi 2C lại sẵn sàng đi vào vòng tiếp theo của chu trình. Các acid béo của lipit là nguồn giàu năng lượng đối với sinh trưởng của vi sinh vật. Theo cách tương tự, một số vi sinh vật có khả năng sinh trưởng tốt trên các hydrocarbon của dầu lửa trong điều kiện hiếu khí.

Sự phân giải các axit béo giải phóng năng luợng chủ yếu ở dạng nhiệt hơn là sự

tạo thành ATP. Điều này là do sự kết hợp phản ứng tái oxi hóa của FADH2 với oxi tạo

thành H2O2. Sau đó H2O2 bị phân giải bởi catalaza cho H2O và ½O2 với sự giải phóng

nhiệt là chủ yếu. Vì vậy các vi sinh vật sinh trưởng trên axit béo và các chất có liên quan như các alkan chuỗi dài thường tạo thành lượng lớn nhiệt.

17.9. PHÂN GIẢI PROTEIN VÀ ACID AMINE

Một số vi khuNn và nấm, đặc biệt là các vi sinh vật gây bệnh, vi sinh vật làm hư

hỏng thực phNm và vi sinh vật đất, có thể sử dụng các protein làm nguồn carbon và năng

lượng. N hiều vi sinh vật khác phân giải protein và acid amin chỉ khi vắng mặt các nguồn

C như glucose và lipid. Chúng tiết ra enzyme protease thuỷ phân các protein và polipeptit

thành acid amin; các acid amin được vận chuyển vào tế bào và được phân giải.

Hình 17.23: Sự chuyển amine

Trên đây là 1 ví dụ phổ biến của sự chuyển amin. Nhóm -amino của alanin được chuyển sang chất nhận -ketoglutarat tạo thành pyruvate và glutamate. Pyruvate có thể được chuyển hóa trong chu trình acid tricarboxylic hoặc được dùng trong sinh tổng hợp. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Bước đầu tiên trong việc sử dụng acid amin là loại amin (deamination) tức là tách nhóm amin khỏi acid amin. Điều này thường được thực hiện bằng sự chuyển amin (transamination): nhóm amin được chuyển từ một acid amin sang một chất nhận là acidα-keto (Hình 17.23).

Acid hữu cơ xuất phát từ việc loại amin có thể được chuyển thành pyruvate,

Acetyl-CoA hay một chất trung gian của chu trình TCA và, cuối cùng, được oxy hoá

trong chu trình TCA để giải phóng năng lượng. Acid hữu cơ nói trên có thể được sử dụng

làm nguồn C cho việc tổng hợp các thành phần của tế bào. N itơ dư thừa do loại amin có

thể được thải ở dạng ion ammonia do đó làm cho môi trường trở nên kiềm. Đáng chú ý,

oxit trimetilamin (TMAO) là phế phNm chứa N trong trao đổi chất của cá và có công thức

(CH3)3N O. TMAO đóng vai trò trong việc tạo thành mùi "cá". Đây là dạng N dư thừa

trong sự phân giải acid amin và bị thải ra. TMAO là chất không mùi do đó không ảnh

hưởng đến mùi, vị và ngoại hình của cá tươi. Tuy nhiên một số vi khuNn sử dụng TMAO như chất nhận electron tận cùng trong hô hấp kị khí và khử TMAO thành trimetilamin (TMA) có mùi "cá" khó chịu thậm chí mũi người chỉ vài phân tử TMAO đã cảm nhận được vì việc phân giải cá do vi khuNn và việc tạo thành TMA bắt đầu ngay khi cá chết nên khi cá không có mùi là cá tươi hoặc được ướp lạnh ngay khi cá còn tươi.

17.10. OXI HÓA CÁC PHÂN TỬ HỮU CƠ

N hư đã nói ở trên, vi sinh vật có thể oxy hoá các phân tử hữu cơ như hidrat

carbon, lipit, protein và tạo thành ATP nhờ năng lượng được giải phóng. Chất nhận

electron là: (1) một phân tử hữu cơ khác nội sinh, oxy hoá hơn xuất hiện trong lên men;

(2) O2 trong hô hấp hiếu khí hoặc (3) một phân tử oxy hoá khác O2 có nguồn gốc từ bên ngoài dùng trong hô hấp kỵ khí (hình 17.2). Trong cả hô hấp hiếu khí và kỵ khí ATP đều được tạo thành do kết quả hoạt động của chuỗi vận chuyển electron. Các electron đi vào chuỗi có thể bắt nguồn từ các chất vô cơ và năng lượng có thể thu được từ sự oxy hoá các phân tử vô cơ hơn là từ các chất dinh dưỡng hữu cơ. Khả năng chỉ gặp ở một nhóm vi khuNn được gọi là hoá dưỡng vô cơ (chemolithotroph). Mỗi loài đều đòi hỏi các chất cho và chất nhận electron đặc trưng (bảng 17.4). Chất nhận electron thường là O2 nhưng cũng có thể là nitrate hoặc sulfate. Các chất cho electron phổ biến nhất là H2, các hợp chất nitơ khử, các hợp chất sulfur khử và sắt ferrơ (Fe2+).

Vi khuNn hoá dưỡng vô cơ thường là tự dưỡng và sử dụng chu trình Calvin để cố

định CO2 là nguồn carbon. Tuy nhiên một số chúng có thể sinh trưởng như vi khuNn hoá

dị dưỡng khi có mặt các hợp chất hữu cơ khử. Quá trình khử CO2 thành hidrat carbon tiêu

tốn nhiều năng lượng. Việc gắn một phân tử CO2 vào chu trình Calvin cần 3ATP và

2N ADPH.

Tuy nhiên phản ứng oxy hoá các phân tử vô cơ (bảng 17.5) cho năng lượng ít hơn

nhiều so với oxy hoá hoàn toàn glucose thành CO2; sự oxy hoá hoàn toàn này đi kèm với

sự thay đổi năng lượng tự do chuNn là - 686 kcal/mol. Tỉ lệ P/O đối với phosphoryl hoá

oxy hoá ở vi khuNn hoá dưỡng vô cơ chỉ vào khoảng 1,0 (tỉ lệ này cao hơn nhiều trong

phản ứng oxy hoá H2). Do sản lượng ATP thấp vi khuNn hoá dưỡng vô cơ phải oxy hoá

một lượng lớn chất vô cơ để sinh trưởng và sinh sản, điều này tăng cường tác động sinh

thái của chúng.

Bảng 17.4: Các vi khuẩn hóa dưỡng vô cơ tiêu biểu và các nguồn năng luợng của chúng. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Bảng 17.5: Sản lượng năng luợng từ những sự oxy hóa sử dụng bởi các vi khuẩn

hóa dưỡng vô cơ. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Phản ứng Go'(kcal/mol)a

H2 + ½ O2 H2O - 56,6

N O2- + ½ O2 N O3- - 17.4

N H4+ + 1½O2 N O2- + H2O + 2H+ - 65,0

So + 1½O2 + H2O H2SO4 - 118,5

S2O32- + 2O2 + H2O 2SO42- + 2H+ - 223.7

2Fe2+ + 2H+ + ½ O2 2Fe3+ + H2O - 11,2

a/ Go' đối với sự oxy hóa hoàn toàn của glucose thành CO2 là -686

kcal/mol.1kcal tương đương với 4,184 kJ.

Một số chi vi khuNn (bảng 17.4) có thể oxy hoá khí hydro để sản ra năng lượng vì chúng có enzyme hydrogenase xúc tác phản ứng oxy hoá hydro:

H2  2H+ +2e-

Các electron được chuyển vào chuỗi vận chuyển electron hoặc chuyển đến N AD+ tuỳ thuộc vào hydrogenase. N ếu N ADH được tạo thành nó có thể được dùng để tổng hợp ATP nhờ việc vận chuyển electron và phosphoryl hoá oxy hoá với O2 là chất nhận electron tận cùng. Tuy nhiên khi đầy đủ chất dưỡng các vi khuNn hydro nói trên lại thường sử dụng chất hữu cơ làm nguồn năng lượng.

Các vi khuNn hoá dưỡng vô cơ oxy hoá nitơ được nghiên cứu kỹ nhất là vi khuNn nitrate hoá. Đây là những vi khuNn đất và vi khuNn nước có ý nghĩa sinh thái rõ rệt. Sự oxy hoá ammonia thành nitrate phụ thuộc vào hoạt tính của ít nhất hai chi khác nhau. Chẳng hạn, Nitrosomonas và Nitrosospira oxy hoá ammonia thành nitrite:

NH + 11 O2  NO + H2O + 2H+

4 2 2

Sau đó nitrite có thể bị oxy hoá tiếp bởi Nitrobacter và Nitrococcus thành nitrate:

NO + 12 O2  NO 

2 3

Hình 17.24. Dòng electron trong chuỗi vận chuyển electron ở Nitrobacter

Nitrobacter oxy hóa nitrite và thực hiện việc vận chuyển electron bình thường để sản ra PMF

dùng cho tổng hợp ATP. (Nhánh bên phải của sơ đồ). Một phần PMF cũng được dùng để đẩy

các electron di chuyển ngược với thời gradien thế khử từ nitrite đến NAD+ (nhánh bên trái của

sơ đồ). Xit.c và 4 phức hợp tham gia vào đây là: NADH-Ubiquinone oxydoreductase (1),

ubiquinol-xit.c oxydoreductase (2), nitrite oxydase (3) và xit.aa3 oxydase (4). (Theo: Prescott và

cs, 2005)

Khi hai chi hoạt động phối hợp ammonia trong đất bị oxy hoá thành nitrate. Quá trình này được gọi là nitrate hoá (nitrification).

N ăng lượng thoát ra trong quá trình oxy hoá của cả ammonia và nitrite được dùng

để tổng hợp ATP nhờ phosphoryl hoá oxy hoá. Tuy nhiên để khử CO2 và các phân tử

khác vi sinh vật cần một nguồn electron (lực khử) cũng như một nguồn ATP. Vì amon và

nitrite có thể khử dương hơn N AD+ chúng không thể truyền trực tiếp các electron để tạo

thành N ADH và N ADPH cần thiết. N guyên nhân là vì các electron chuyển động ngẫu

nhiên chỉ từ các chất cho với thế khử âm hơn tới các chất nhận với thế khử dương hơn

(Hình 17.7). Vi khuNn oxy hoá sulfur cũng gặp phải khó khăn như trên. Cả hai nhóm vi

khuNn hoá dưỡng vô cơ đã khắc phục trở ngại này bằng cách sử dụng PMF để đảo ngược

dòng electron trong chuỗi vận chuyển electron và khử N AD+ với các electron từ các chất

cho nitơ và sulfur (hình 17.24). Vì năng lượng được dùng để tạo thành N ADH và ATP

nên sản lượng thực của ATP là rất thấp. Vi khuNn hoá dưỡng vô cơ chịu được sự kém

hiệu quả này vì chúng không có các đối thủ cạnh tranh về các nguồn năng lượng đặc

trưng.

Hình 17.25: Sự tạo thành năng luợng bởi sự oxy hóa sulfur

(a) Sulfit có thể bị oxy hóa trực tiếp để cung cấp electron cho vận chuyển electron và

phosphoryl hóa oxy hóa. (b) Sulfit cũng có thể bị oxy hóa và chuyển thành APS. Con đường này

sản ra các electron dùng cho việc vận chuyển electron và sản ra ATP nhờ phosphoryl hóa ở mức

độ cơ chất với APS. (c) Cấu trúc của adenozin - 5' - phosphorussulfate. (Theo: Prescott và cs,

2005)

Vi khuNn oxy hoá sulfur là nhóm quan trọng thứ ba trong số các vi khuNn hoá

dưỡng vô cơ. Trao đổi chất của Thiobacillus đã được nghiên cứu chi tiết nhất. Vi khuNn

2

này oxy hoá sulfur (So), sulfua hydro (H2S), tiosulfate ( S2O3  ) và các hợp chất sulfur khử

khác thành acid sulfuric, do đó chúng có ý nghĩa sinh thái rõ rệt. Đáng chú ý Thiobacillus

tổng hợp ATP nhờ phosphoryl hoá oxy hoá cũng như phosphoryl hoá ở mức độ cơ chất

bao gồm adenozin-5-phosphorussulfate (APS) là phân tử cao năng tạo thành từ sulfit và

adenozin monophosphate (Hình 17.25).

Một số vi khuNn oxy hoá sulfur rất linh hoạt trong trao đổi chất. O2 chúng tiến hành hô hấp kỵ khí và oxy hoá chất hữu cơ với sulfur là chất nhận electron.

Cũng như các vi khuNn hoá dưỡng vô cơ khác vi khuNn oxy hoá sulfur có thể sử dụng CO2 làm nguồn carbon. N ếu được cung cấp các nguồn carbon hữu cơ khử (glucose hay acid amin) nhiều loài sẽ sinh trưởng dị dưỡng.

17.11. QUANG HỢP

Chẳng hạn, Sulfolobus brierleyi và một vài vi khuNn khác có thể sinh trưởng hiếu khí nhờ oxy hoá sulfur với O2 là chất nhận electron; khi vắng mặt

Bảng 17.6: Tính đa dạng của các cơ thể quang hợp (Theo: Prescott và cs, 2005)

Cơ thể nhân thật Cơ thể nhân nguyên thủy

Thực vật bậc cao

Tảo đa bào màu lục, màu nâu và màu đỏ

Tảo đơn bào (tảo mắt, tảo giáp, tảo silic)

Vi khuNn lam

Vi khuNn sulfur màu lục, vi khuNn không sulfur màu tía, Prochloron

Vi sinh vật thu được năng lượng không chỉ từ sự oxy hoá các hợp chất vô cơ và

hữu cơ nhưng nhiều trong số chúng có thể thu nhận năng lượng ánh sáng (quang năng) và

sử dụng năng lượng này để tổng hợp ATP và N ADH hoặc N ADPH (Hình 17.1). Quá

trình trong đó quang năng được thu nhận và vận chuyển thành hoá năng gọi là quang hợp.

Thường một cơ thể quang hợp khử và cố định CO2 và đây cũng là các phản ứng nằm

trong quá trình trên. Quang hợp là một trong các quá trình trao đổi chất quan trọng nhất

trên trái đất vì hầu hết năng lượng của chúng ta tựu trung đều bắt nguồn từ năng lượng

mặt trời; năng lượng này cung cấp cho các sinh vật quang hợp ATP và N ADPH dùng

tổng hợp chất hữu cơ cần cho sinh trưởng. Các sinh vật quang hợp lại là cơ sở cho hầu

hết các chuỗi thức ăn trong sinh quyển. Quang hợp cũng có chức năng bổ sung O2 cho

con người, đây là quá trình quan trọng do nhiều cơ thể thực hiện, cả sinh vật nhân thật lẫn

nhân nguyên thuỷ (bảng 17.6). Mặc dù con người thường gán quang hợp cho các thực vật

bậc cao nhưng trên thực tế quá nửa quang hợp trên trái đất là do vi sinh vật góp phần.

N hìn chung, có thể chia quang hợp thành hai phần. Trong các phản ứng sáng

quang năng bị thu giữ và được chuyển thành hoá năng. Sau đó năng lượng này được dùng

để khử hoặc cố định CO2 và tổng hợp các thành phần của tế bào trong các phản ứng tối.

17.11.1. Phản ứng sáng ở các sinh vật nhân thật và vị khuẩn lam

Hình 17.26: Cấu trúc chlorophyll

Trong hình là cấu trúc của cholorophyll a, cholorophyll b và bacteriocholorophyll a. Chỉ 1

nhóm trong cholorophyll a bị thay đổi để sản ra cholorophyll b, trái lại để chuyển cholorophyll a

thành bacteriocholorophyll a phải cần 2 sự cải biến trong hệ thống vòng. Chuỗi bên (R) của

bacteriocholorophyll a có thể là phytil (1 chuỗi gồm 20C cũng gặp trong các cholorophyll a và

b) hay geranilgeranil (1 chuỗi bên gồm 20C tương tự phytil nhưng nhièu hơn 3 nối đôi). (Theo: Prescott và cs, 2005)

Các sinh vật quang hợp đều có các sắc tố dùng hấp phụ ánh sáng trong đó sắc tố

quan trọng nhất là cholorophyll (chất diệp lục). Đây là các vòng phẳng, lớn gồm 4 nhân

pirol thay thế bởi 1 nguyên tử magiê phối hợp với 4 nguyên tử nitơ ở trung tâm (hình

17.26). Một số cholorophyll gặp ở sinh vật nhân thật mà quan trọng nhất là cholorophyll

a và cholorophyll b (hình 17.26). Hai phân tử cholorophyll này hơi khác nhau về cấu trúc

và các đặc tính quang phổ. Khi hoà tan trong axeton cholorophyll a có đỉnh hấp thụ ánh

sáng ở 665 nm; còn cholorophyll b có đỉnh hấp thụ ở 645nm. N goài đặc tính hấp thu ánh

sáng đỏ các cholorophyll cũng hấp thu mạnh ánh sáng xanh (đỉnh hấp thu thứ hai đối với

cholorophyll a là ở 430nm). Vì các cholorophyll hấp thu chủ yếu trong vùng đỏ và xanh

do đó ánh sáng lục được truyền qua. Hậu quả là các sinh vật quang hợp có màu lục. Đuôi

dài kỵ nước gắn vào vòng cholorophyll giúp cho sắc tố này gắn vào màng là vị trí của các

phản ứng quang.

Hình 17.27: Các sắc tố phụ tiêu biểu.

Beta-caroten là 1 carotenoit gặp ở tảo và các thực vật cao cấp. Sắc tố này chứa 1

chuỗi dài của các nối đôi và nối đơn luân phiên gọi là các nối đôi tiếp hợp. Fucoxantin là 1 sắc

tố phụ của carotenoit gặp trong một số ngành tảo (Dấu chấm trong cấu trúc biểu thị 1 nguyên tử

C). Phycoxyanobilin là một ví dụ của tetrapirol đường thẳng liên kết với 1 protein để tạo thành

phycobiliprotein. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Các sắc tố quang hợp khác cũng thu giữ quang năng mà phổ biến nhất là

carotenoit. Đây là các phân tử dài thường có màu vàng nhạt có một hệ thống liên kết kép

tiếp hợp (hình 17.27). β-caroten gặp ở Prochloron và hầu hết các nhóm tảo; flucoxantin

có mặt ở khuê tảo (diatoms), tảo giáp (Dinoflagellates) và tảo nâu (Phaeophyta). Tảo đỏ

và vi khuNn lam chứa các sắc tố quang hợp gọi là phycobiliprotein bao gồm một protein liên kết với một tetrapyrol (hình 17.27). Phycoerytrin là một sắc tố đỏ có đỉnh hấp thu cực đại ở 550nm và phycocyanin là sắc tố xanh (hấp thu cực đại ở 620-640nm).

Về vai trò trong quang hợp carotenoit và phycobiliprotein thường được coi là sắc tố phụ. Mặc dù các cholorophyll không thể hấp thu quang năng một cách có hiệu quả trong vùng xanh - lục đến vàng (khoảng 470-630nm) nhưng các sắc tố phụ hấp thu ánh sáng trong vùng này và truyền năng lượng thu được đến cholorophyll. N hờ vậy chúng giúp cho quang hợp có hiệu quả hơn qua một vùng rộng hơn của chiều dài sáng. Các sắc tố phụ cũng bảo vệ vi sinh vật khỏi ánh sáng mặt trời gay gắt có thể oxy hoá và gây hư hại cho bộ máy quang hợp trong trường hợp thiếu chúng.

Các cholorophyll và sắc tố phụ được tập hợp thành từng dãy có tổ chức cao gọi là ăng-ten với chức năng tạo ra một diện tích bề mặt rộng dùng thu giữ các photon càng nhiều càng tốt. Mỗi ăngten chứa khoảng 300 phân tử cholorophyll. Quang năng được thu giữ trong một ăngten và được chuyền từ cholorophyll này sang sang cholorophyll khác cho đến khi đạt tới một cholorophyll đặc biệt ở trung tâm phản ứng; cholorophyll này trực tiếp tham gia vào việc vận chuyển electron quang hợp (hình 17.28).

Hình 17.28: Một chuỗi phản ứng quang hợp

Trung tâm phản ứng của vi khuẩn không sulfur màu tía Rhodopseudomonas viridis. Sơ đồ cận cảnh của các nhóm thêm ở trung tâm phản ứng. Trước hết 1 photon được hấp thu bởi 1 "cặp đặc biệt" của các phân tử bacteriocholorophyll a và kích hoạt chúng. Sau đó 1 electron được kích hoạt chuyển động tới phân tử bacteriopheophytin ở nhánh bên phải của hệ thống. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Ở các tế bào nhân thật và vi khuNn lam có hai loại ăngten liên két với hai hệ quang

khác nhau. Hệ quang I hấp thu ánh sáng với bước sóng dài hơn ( 680nm) và chuyền

năng lượng tới phân tử cholorophyll a đặc biệt gọi là P700. Thuật ngữ P700 có nghĩa

rằng phân tử hấp thu ánh sáng hiệu quả nhất ở chiều dài sóng 700nm. Hệ quang II hấp

thu ánh sáng ở các bước sóng ngắn hơn (680nm) và chuyền năng lượng tới cholorophyll

đặc biệt P680.

Khi ăngten của hệ quang I chuyền quang năng tới cholorophyll P700 ở trung tâm phản ứng P700 sẽ hấp thu năng lượng và được kích hoạt khiến thế khử của nó trở nên rất âm. Sau đó P700 chuyền electron được kích hoạt hoặc electron cao năng cho một chất nhận đặc biệt có lẽ là một phân tử cholorophyll a đặc biệt (A) hoặc một protein sắt -

sulfur (hình 17.29).

Hình 17.29: Quang hợp ở cây xanh

Dòng electron trong quang hợp ở thực vật bậc cao. Vi khuẩn lam và tảo nhân thật cũng tương

tự như thực vật bậc cao ở chỗ đểu có 2 hệ quang mặc dù giữa chúng có những khác nhau về chi

tiết. Các chất mang tham gia trong vận chuyển electron là ferredoxyn (Fd) và các protein FeS

khác; các Cytochrome b6, b563 và f; plastoquinon (PQ); plastoxyanin chứa đồng; pheophytin a (Pheo a); có thể cholorophyll a (A); và quinon Q chưa rõ có lẽ là plastoquinon. Cả hệ quang I (PS I) và hệ quang II (PS II) để tham gia vào quang phosphoryl hóa không vòng; chỉ PSI tham gia vào quang phosphoryl vòng. Phức hợp giải phóng oxy (OEC = oxygen evolving complex) lấy các electron từ nước chứa các ion mangan và chất Z có chức năng chuyển các electron tới trung tâm phản ứng của PSII. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Cuối cùng electron được chuyền cho ferredoxyn, sau đó có thể được di chuyển theo một trong hai hướng. Theo con đường vòng electron di chuyển qua một dãy các chất mang electron và quay trở về P700 bị oxy hoá. Con đường được gọi là vòng vì electron từ P700 lại trở về P700 sau khi đã trải qua chuỗi vận chuyển electron quang hợp. Động lực proton (PMF) được hình thành trong việc vận chuyển electron vòng trong vùng của Cytochrome b6 và được sử dụng để tổng hợp ATP. Quá trình này được gọi là quang phosphoryl hoá vòng vì các electron di chuyển theo đường vòng và ATP được tạo thành. Chỉ hệ quang I tham gia vào quá trình này.

Các electron cũng có thể di chuyển theo đường không vòng với sự tham gia của cả hai hệ quang P700 được kích hoạt và chuyền các electron tới ferredoxyn như đã nói trên. Tuy nhiên trong con đường không vòng ferredoxyn bị khử sẽ khử N ADP+ thành N ADPH (Hình 17.29). Vì các electron cung cấp cho N ADP+ không thể dùng để khử P700 bị oxy hoá nên sự tham gia của hệ quang II là cần thiết. Hệ này chuyền các electron cho P700 bị oxy hoá và sản ra ATP trong quá trình. Ăngten của hệ quang II hấp thu quang năng và kích hoạt P680, sau đó P680 khử pheophytin a. Pheophytin a chính là cholorophyll a nhưng ở đây hai nguyên tử hydro đã thay thế magiê ở trung tâm. Các electron chuyển tiếp cho Q (có lẽ là 1 plastoquinon) và xuôi theo chuỗi vận chuyển electon tới P700. Sau đó P680 bị oxy hoá nhận 1 electron từ sự oxy hoá của nước thành O2. N hư vậy các electron di chuyển suốt từ nước đến N ADP+ nhờ năng lượng từ hai hệ thống quang và ATP được tổng hợp nhờ quang phosphoryl hoá không vòng. Một ATP và 1 N ADPH có thể được tạo thành khi 2 electron di chuyển qua con đường không vòng.

Cũng như sự vận chuyển electron ở ti thể, sự vận chuyển electron trong quang hợp

diễn ra bên trong màng. Các màng dạng hạt của lục lạp chứa cả hai hệ thống và các

ăngten. Màng tilacoit thực hiện quang phosphoryl hoá không vòng nhờ cơ chế hoá thNm

thấu. Các proton di chuyển vào bên trong tilacoit trong quá trình vận chuyển electron

quang hợp và quay trở lại chất đệm (stroma) khi ATP được tạo thành. Các phiến của chất

đệm có lẽ chỉ chứa hệ quang I và đơn độc tham gia vào quang phosphoryl hoá vòng. Ở vi

khuNn lam các phản ứng quang trong quang hợp cũng nằm bên trong các màng.

Các phản ứng tối cần 3ATP và 2N ADPH để khử 1 CO2 và sử dụng CO2 để tổng hợp hidrat carbon (CH2O)

CO2 + 3ATP + 2N ADPH + 2H+ + H2O  (CH2O) + 3ADP + 3Pi + 2N ADP+

Hệ thống không vòng sản ra 1N ADPH và 1ATP đối với mỗi cặp electron, do đó 4

electron đi qua hệ thống sẽ sản ra 2N ADPH và 2ATP. Tổng cộng 8 lượng tử (quantum)

của quang năng (4 lượng tử cho một hệ quang) là cần để đNy 4 electron từ nước đến

N ADP+. Vì tỉ lệ của ATP đối với N ADPH cần cho cố định CO2 là 3:2 nên ít nhất 1ATP

nữa phải được cung cấp. Quang phosphoryl hoá vòng có lẽ hoạt động độc lập với việc

sản ra ATP thêm này. Điều này đòi hỏi sự hấp thu 2-4 lượng tử nữa. N hư vậy khoảng 10-

12 lượng tử quang năng là cần để khử và cố định một phân tử CO2 trong quang hợp.

Hình 17.30: Cơ chế quang hợp

Trên đây là minh họa màng tilacoit của lục lạp chứng minh chức năng của chuỗi vận chuyển

electron quang hợp và quang phosphoryl hóa không vòng. Chuỗi bao gồm 3 phức hợp: PSI,

phức hợp Cytochrome bf và PSII. Dòng electron hướng dẫn bởi ánh sáng bơm các proton qua

màng tilacoit và tạo ra 1 gradien điện hóa, sau đó gradien này có thể được dùng để tổng hợp

ATP. Nước là nguồn electron và phức hợp giải phóng oxy (OEC) sản ra oxy (Theo Prescott và

cs, 2005).

17.11.2. Phản ứng quang ở vi khuẩn lục và vi khuẩn tía

Vi khuNn lục và vi khuNn tía quang hợp khác với vi khuNn lam và các cơ thể quang hợp nhân thật ở một số điểm quan trọng (Bảng 17.7). Đặc biệt, vi khuNn lục và vi khuNn tía không sử dụng nước là nguồn electron hoặc tạo thành O2 trong quang hợp nghĩa là chúng tiến hành quang hợp không thải O2. Trái lại, vi khuNn lam và các sinh vật quang hợp nhân thật hầu như bao giờ cũng thải oxy (một số vi khuNn lam có thể tiến hành quang hợp không thải oxy). Trong phản ứng sáng của quang hợp ở vi khuNn tía N ADPH không được tạo thành trực tiếp.

Bảng 17.7: Đặc tính của các hệ thống quang hợp vi sinh vật. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Đặc tính Vi khuẩn màu lục và

màu tía

Sắc tố quang hợp Bacteriocholorophyll

Hệ quang II Vắng mặt

Các chất cho electron H2, H2S, S, chất hữu

quang hợp cơ

Kiểu sản sinh O2 Không thải O2

Các sản phNm sơ cấp ATP

của sự chuyển hóa

năng luợng

N guồn carbon CO2 CO2 Carbon hữu cơ

và/hoặc CO2

* Một số vi khuẩn lam có thể hoạt động không thải O2 dưới 1 số điều kiện, chẳng hạn Oscillatoria có thể sử dụng H2S làm chất cho electron thay cho H2O.

Tuy nhiên, vi khuNn lục có thể khử N AD+ trực tiếp trong phản ứng sáng. Để tổng

hợp N ADH và N ADPH vi khuNn lục và vi khuNn tía phải sử dụng các chất cho electron

như hydro, sulfua hydro, sulfur nguyên tố và các hợp chất hữu cơ là các chất có thể khử

âm hơn nước và vì vậy dễ oxy hoá hơn (nghĩa là các chất cho electron tốt hơn). Cuối

cùng, vi khuNn lục và vi khuNn tía chứa các sắc tố quang hợp hơi khác nhau gọi là

bacteriocholorophyll (Hình 17.26), nhiều trong số chúng có điểm cực đại hấp thu ở

những bước sóng dài hơn. Các bacteriocholorophyll a và b có đỉnh cực đại trong ête lần

lượt ở 775 và 790 nm. Đỉnh cực đại in vivo của bacteriocholorophyll a là khoảng 830-890

nm và của bacteriocholorophyll b là 1020-1040 nm. Sự chuyển dịch của cực đại hấp thu

vào vùng hồng ngoại như vậy sẽ giúp cho vi khuNn thích ứng tốt hơn với các ổ sinh thái.

Có 4 nhóm vi khuNn quang hợp màu lục và màu tía, mỗi nhóm đều chứa một số chi: vi khuNn sulfur (Chlorobium), vi khuNn không-sulfur màu lục (Chloroflexus), vi khuNn sulfur màu tía (Chromatium) và vi khuNn không-sulfur màu tía (Rhodospirillum, Rhodopseudomoanas).

Dòng electron

ngược

Trung tâm

phản ứng

Hình 17.31: Quang hợp ở vi khuẩn không-sulfur màu tía

Hệ thống vận chuyển electron quang hợp ở vi khuẩn không sulfur màu tía, Rhodobacter sphaeroides. Sơ đồ trên là chưa hoàn toàn và mới là giả định. Ubiquinone (Q) rất giống với CoQ.BPh là bacteriopheophytin, NAD+ và succinat (nguồn electron) được đánh dấu. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Do thiếu hệ quang II nhiều sự khác biệt gặp ở vi khuNn màu lục và màu tía. N hững

vi khuNn này không thể sử dụng nước làm chất cho electron trong sự vận chuyển electron

không vòng. Thiếu hệ quang II chúng không thể tạo thành O2 từ H2O trong quá trình

quang hợp và bị hạn chế ở quang phosphoryl hoá vòng. Trên thực tế hầu như tất cả vi

khuNn sulfur màu tía và vi khuNn sulfur màu lục là bọn kỵ khí bắt buộc. Trên hình 17.31

là sơ đồ giả định đối với chuỗi vận chuyển electron quang hợp của một vi khuNn không -

sulfur màu tía.

Khi cholorophyll P870 đặc biệt của trung tâm phản ứng bị kích hoạt nó sẽ chuyền

một electron cho bacteriopheophytin. Sau đó các electron di chuyển đến các quinon rồi

qua một chuỗi vận chuyển electron lại trở về P870 đồng thời ATP được tổng hợp. Mặc dù

cả vi khuNn lục và vi khuNn tía đều thiếu hai hệ quang nhưng vi khuNn tía có một bộ máy

quang hợp tương tự như hệ quang II, còn vi khuNn sulfur màu lục có một hệ thống tương

tự hệ quang I. Do cũng cần N ADH và N ADPH để cố định CO2 nên vi khuNn lục và vi

khuNn tía còn phải đối mặt với một vấn đề nữa. Chúng có thể tổng hợp N ADH theo ít

nhất ba con đường. N ếu vi khuNn đang sinh trưởng trong sự có mặt của H2 có thể khử âm

hơn của N AD+, hydro có thể được sử dụng trực tiếp để sản ra N ADH. Cũng như bọn hoá

dưỡng vô cơ nhiều vi khuNn tía quang hợp sử dụng PMF để đNy ngược dòng electron

trong chuỗi vận chuyển electron và chuyển các electron này từ các chất cho vô cơ hoặc

hữu cơ tới N AD+ (Hình 17.31 và 17.32). Các vi khuNn sulfur màu lục như Chlorobium có

lẽ khử N AD+ nhờ một dạng đơn giản của dòng electron quang hợp không vòng (Hình

17.33).

Hình 17.32: Sự khử NAD ở vi khuẩn màu lục và vi khuẩn màu tía.

Dòng electron ngược được sử dụng để khử NAD+. Mũi tên trong sơ đồ biểu thị 1 chuỗi vận chuyển electron chuyền ngược hướng nhờ động lực proton hoặc ATP, nghĩa là các electron di chuyển từ các chất cho với thế khử dương hơn tới 1 chất nhận (NAD+) với thế khử âm hơn. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Hình 17.33; Quang hợp ở vi khuẩn sulfur màu lục.

Hệ thống vận chuyển electron quang hợp ở vi khuẩn sulfur màu lục Chlorobium limicola. Quang năng được dùng để tổng hợp ATP nhờ quang phosphoryl hóa vòng và vận chuyển các electron từ chất cho S tới NAD+. Chuỗi vận chuyển electron chứa 1 quinon gọi là menaquinon (MK). (Theo: Prescott và cs, 2005)

Chương 18

SỬ DỤNG NĂNG LƯỢNG TRONG SINH TỔNG HỢP Ở VI SINH VẬT

Biên soạn : Nguyễn Đình Quyến, Nguyễn Lân Dũng

Như trên dã nói vi sinh vật có thể thu nhận năng lượng qua nhiều con đường. Phần lớn năng lượng này được dùng cho sinh tổng hợp hoặc đồng hoá. Trong quá trình sinh tổng hợp vi sinh vật bắt đầu với các tiền chất đơn giản như các phân tử vô cơ và các monome và kiến trúc nên các phân tử ngày càng phức tạp hơn cho tới khi xuất hiện các bào quan và các tế bào mới (Hình 18.1). Mỗi tế bào vi sinh vật phải sản xuất ra nhiều loại phân tử khác nhau; tuy nhiên, trong chương này chỉ có thể giới thiệu việc tổng hợp những thành phần tế bào quan trọng nhất.

Cấp độ tổ chức Ví dụ

Tế bào

Bào quan

Các hệ thống siêu phân tử

Các cao phân tử

Các monome hoặc các đơn vị kiến trúc

Các phân tử vô cơ

Hình 18.1: Kiến trúc của các tế bào

Sinh tổng hợp của các thành phần tế bào nhân nguyên thủy và nhân thật. Sinh tổng hợp

được tổ chức ở các cấp độ ngày càng phức tạp hơn. (Theo Prescott và cs, 2005)

Vì đồng hoá là tạo ra một trật tự và mỗi tế bào được sắp xếp ở mức độ cao, cực kỳ phức tạp, do đó sinh tổng hợp đòi hỏi nhiều năng lượng. Điều này dễ nhận thấy khi ta xem xét năng lực sinh tổng hợp của tế bào E. coli đang sinh trưởng nhanh (bảng 18.1). Mặc dù hầu hết ATP dành cho sinh tổng hợp được dùng cho tổng hợp protein, nhưng ATP cũng được dùng cho tổng hợp các thành phần khác của tế bào.

Bảng 18.1: Sinh tổng hợp ở E. coli (Theo: Prescott và cs, 2005)

Thành phần tế bào Số phân tử/tế

bàoa Các phân tử được tổng hợp/giây Các phân tử ATP

cần/giây cho tổng hợp

DNA RNA Polysaccarid Lipid

Protein 1b

15.000

39.000

15.000.000

1.700.000 0,00083

12,5

32,5

12.500

1.400 60.000

75.000

65.000

87.000

2.120.000

a/ Tính cho 1 tế bào có thể tích 2,25 m3, trọng lượng 1x10-12 g, trọng lượng khô 2,5x10-13 g và chu trình phân bào là 20 phút.

b/ Chú ý: vi khuẩn có thể chứa nhiều bản sao của ADN genom.

Năng lượng tự do cần cho sinh tổng hợp trong các tế bào trưởng thành có kích thước ổn định vì các phân tử của tế bào liên tục bị phân giải và được tổng hợp lại trong một quá trình được gọi là vòng quay (turnover). Các tế bào không bao giờ chi nhau ở từng thời điểm khác nhau. Mặc dù vòng quay của các thành phần tế bào là liên tục nhưng trao đổi chất vẫn được điều hoà cNn thận sao cho tốc độ sinh tổng hợp nói chung, được cân bằng với tốc tộ phân giải. N goài năng lượng dùng cho quay vòng các phân tử nhiều tế bào không sinh trưởng cũng sử dụng năng lượng để tổng hợp các enzyme và các chất khác giải phóng vào môi trường.

18.1. CÁC NGUYÊN TẮC ĐIỀU CHỈNH SINH TỔNG HỢP

Trao đổi chất trong sinh tổng hợp tuân theo một số nguyên tắc chung, 6 trong số các nguyên tắc này được tóm tắt dưới đây:

1. Mỗi tế bào vi sinh vật chứa một lượng lớn các protein, acid nucleic và polisaccaride. Tất cả đều là các cao phân tử tức là các polime gồm các đơn vị nhỏ hơn liên kết với nhau. Việc kiến trúc các phân tử lớn, phức tạp từ một vài đơn vị cấu trúc đơn giản hoặc monome tiết kiệm được nhiều dự trữ di truyền, nguyên liệu cho sinh tổng hợp và năng lượng. Ta hãy xem xét tổng hợp protein để hiểu rõ vấn đề này. Các protein, bất kể có kích thước, hình dạng hoặc chức năng như thế nào, đều được tạo thành chỉ bởi 20 amino acid thông thường nối với nhau nhờ liên kết peptide. Các protein khác nhau đơn giản chỉ là do có thứ tự amino acid khác nhau nhưng không phải là các amino acid mới và khác. Giả dụ, nếu các protein được tạo thành không phải bằng 20 mà bằng 40 amino acid khác nhau, tế bào sẽ phải cần các enzyme để sản xuất ra các amino acid nhiều gấp đôi (hoặc phải nhận được các acid bổ sung từ thức ăn). Các enzyme bổ sung đòi hỏi phải có các gen và tế bào lại phải đầu tư thêm nguyên liệu và năng lượng cho việc tổng hợp các gen, các enzyme và các amino acid bổ sung này. Rõ ràng, việc sử dụng một vài monome nối với nhau bởi một liên kết cộng hoá trị duy nhất khiến cho việc tổng hợp các cao phân tử trở thành một quá trình rất có hiệu quả. Hầu như tất cả các cấu trúc tế bào đều được kiến trúc chủ yếu bởi khoảng 30 tiền chất nhỏ.

2. Tế bào thường tiết kiệm các nguyên vật liệu và năng lượng bằng cách sử dụng các enzyme dùng cho cả dị hoá và đồng hoá. Chẳng hạn, hầu hết các enzyme đường phân đều tham gia tổng hợp và phân giải glucose se.

3. Mặc dù nhiều enzyme trong các con đường lưỡng hoá hoạt động trong cả phân giải và tổng hợp nhưng một số bước lại được xúc tác bởi hai enzyme khác nhau: một xúc tác phản ứng theo hướng phân giải và một theo hướng tổng hợp (Hình 18.2). Vì vậy, các con đường dị hoá và đồng hoá không bao giờ chi nhau mặc dù có nhiều enzyme chung. Việc sử dụng các enzyme riêng rẽ theo hai hướng ở một bước đơn độc cho phép điều chỉnh dị hoá và đồng hoá một cách độc lập. Cần nhớ rằng việc điều chỉnh đồng hoá hơi khác với điều chỉnh dị hoá. Cả hai con đường đều có thể điều chỉnh được bởi sản phNm cuối cùng cũng như bởi nồng độ ATP, ADP, AMP và N AD+. Tuy nhiên, trong các con đường đồng hoá việc điều chỉnh bởi sản phNm cuối cùng, nói chung, có vai trò quan trọng hơn.

4. Để tổng hợp các phân tử một cách hiệu quả các con đường đồng hoá phải hoạt động không thuận nghịch theo hướng sinh tổng hợp. Tế bào có thể thực hiện điều này bằng cách liên kết một số phản ứng sinh tổng hợp với sự phân giải ATP

và các nucleoside triphosphate khác. Khi hai quá trình này được liên kết năng lượng tự do thoát ra trong sự phân giải nucleoside triphosphate sẽ hướng dẫn phản ứng sinh tổng hợp hoàn thành.

5.Ở các vi sinh vật nhân thật các con đường sinh tổng hợp thường diễn ra bên trong các khoang tế bào khác với các con đường phân giải tương ứng. Chẳng hạn, sinh tổng hợp acid béo gặp trong tế bào chất trong khi sự oxy hoá acid béo được thực hiện bên trong ti thể. Sự phân khoang tạo điều kiện cho các con đường hoạt động đồng thời không phụ thuộc vào nhau.

Sự đồng hóa

Sự lưỡng hóa

Hình 18.2: Một con đường sinh tổng hợp giả thuyết.

Các con đường liên kết G với X, Y và Z hoàn toàn là đồng hóa vì chúng chỉ được dùng để tổng hợp các sản phẩm cuối cùng. Con đường từ A đến G là lưỡng hóa, nghĩa là có cả chức năng dị hóa và đồng hóa. Hầu hết các phản ứng được dùng trong cả 2 vai trò; tuy nhiên, sự chuyển hóa qua lại của C và D được xúc tác bởi 2 enzyme riêng biệt, E1 (dị hóa) và E2 (đồng hóa). (Nguồn Prescott và cs, 2005)

6.Cuối cùng, các con đường đồng hoá và dị hoá thường sử dụng các cofactor khác nhau. Các phản ứng oxy hoá trong phân giải, nói chung, sản ra N ADH là một cơ chất cho vận chuyển electron. Trái lại, khi một chất cho electron là cần cho sinh tổng hợp thì N ADPH chứ không phải N ADH thường đảm nhiệm chức năng này. Trao đổi chất của acid béo cung cấp ví dụ thứ hai. Các phân tử acyl-CoA của acid béo bị oxy hoá để sản ra năng lượng trong khi tổng hợp acid béo có sự tham gia của các tioeste của protein mang nhánh acyl.

Sau khi các cao phân tử đã được kiến trúc từ các tiền chất đơn giản hơn chúng sẽ được tập hợp thành các cấu trúc lớn hơn, phức tạp hơn như các hệ thống siêu phân tử và các bào quan (Hình 18.1). Các cao phân tử thường chứa thông tin cần thiết để tạo thành một cách ngẫu nhiên trong một quá trình gọi là tự tập hợp. Chẳng hạn, riboxom là những tập hợp lớn gồm nhiều protein và các phân tử acid ribonucleic nhưng chúng được tạo thành nhờ sự tập hợp của các thành phần không cần có sự tham gia của các yếu tố bổ sung.

18.2. CỐ ĐNNH QUANG HỢP CO2

Mặc dù hầu hết vi sinh vật có thể cố định CO2 ít nhất là trong các phản ứng bổ sung tuy nhiên chỉ các cơ thể tự dưỡng mới có khả năng sử dụng CO2 làm nguồn carbon duy nhất hoặc chủ yếu. Sự khử và cố định CO2 đòi hỏi nhiều năng lượng. Các cơ thể tự dưỡng thường thu năng lượng nhờ sự hấp thu ánh sáng trong quang hợp nhưng một số nhận được năng lượng từ phản ứng oxy hoá các chất cho electron vô cơ khử. Sự cố định CO2 tự dưỡng có ý nghĩa quyết định đối với sự sống trên trái đất vì nó cung cấp chất hữu cơ cho các cơ thể dị dưỡng.

Vi sinh vật có thể cố định CO2 hoặc chuyển phân tử vô cơ này thành carbon hữu cơ và đồng hoá nó theo ba con đường chủ yếu. Hầu như tất cả các vi sinh vật tự dưỡng đều cố định CO2 qua con đường trao đổi chất đặc biệt được gọi là chu trình Calvin (cũng gọi là chu trình Calvin-Benson hoặc chu trình pentose- phosphate khử). Mặc dù hoạt động trong các cơ thể quang hợp có nhân thật và hầu hết cơ thể quang hợp có nhân nguyên thuỷ nhưng chu trình Calvin lại vắng mặt ở Archaea (Cổ khuNn), một số vi khuNn kỵ khí bắt buộc và một số vi khuNn hiếu khí. N hững vi khuNn này thường sử dụng một trong hai con đường khác. Một số archaea (Thermoproteus, Sulfolobus) và các vi khuNn Chlorobium và Desulfobacter sử dụng con đường acid tricarboxylic khử. Ở các vi khuNn sinh metan, vi khuNn khử sulfate và các vi khuNn sinh acetate (các vi khuNn tạo thành acetate từ CO2 trong quá trình lên men) lại tồn tại con đường Acetyl-CoA.

Chu trình Calvin gặp trong chất nền (stroma) của lục lạp của các vi sinh vật nhân thật tự dưỡng. Vi khuNn lam, một số vi khuNn nitrate hoá và các thiobacilli chứa các thể vùi, đa diện gọi là cacboxysom. Cacboxysom chứa enzyme ribulo-

1,5-bisphosphate carboxylase, có thể là vị trí cố định CO2 hoặc vị trí dự trữ

carboxylase và các protein khác. Có thể chia chu trình Calvin thành 3 pha:

carboxyl hoá, khử và tái sản. Sơ đồ chung của chu trình được giới thiệu ở hình

18.4.

18.2.1. Pha carboxyl hoá (carboxylation phase)

Sự cố định CO2 được xúc tác bởi enzyme ribulo-1,5-bisphosphate- carboxylase hoặc oxygenase (rubisco) (Hình 18.3) xúc tác việc gắn CO2 vào ribulo-1,5-bisphosphate (RuBP) tạo thành 2 phân tử 3-phosphorus-glycerat (PGA).

Hình 18.3: Phản ứng ribulo-1,5-bisphosphate carboxylase

Enzyme xúc tác bổ sung CO2 vào ribulo-1,5-bisphosphate tạo thành 1 chất trung gian không bền, sau đó chất này bị phân giải thành 2 phân tử 3-phosphorusglycerat. (Theo: Prescott và cs,

2005)

18.2.2. Pha khử (reduction phase)

Tiếp theo, PGA bị khử thành glyceraldehyde-3-phosphate. Sự khử được xúc tác bởi 2 enzyme, thực chất là sự đảo nghịch một phần của con đường đường phân mặc dù glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase khác với enzyme đường phân trong việc sử dụng N ADP+ thay cho N AD+ (hình 18.4).

18.2.3. Pha tái sinh (regeneration phase)

Trong pha này RuBP được tái sản và sản ra các hidrat-carbon như glyceraldehyde-3-phosphate, fructose za và glucose (Hình 18.4). Phần này của chu trình chi với con đường pentose-phosphate và bao gồm các phản ứng của trans- ketolase và transaldolase. Chu trình được hoàn thành khi phosphorusribulokinase tái tạo RuBP.Để tổng hợp fructose -6-phosphate hoặc glucose -6-phosphate từ CO2 chu trình phải hoạt động 6 lần để sản ra hexose cần thiết và tái tạo 6 phân tử RuBP.

6RuBP + 6CO2  12PGA  6RuBP + Fructose -6-P

Việc cố định một CO2 thành chất hữu cơ cần 3ATP và 2N ADPH. Glucose

được tạo thành từ CO2 theo phương trình sau:

6CO2 + 18ATP + 12N ADPH + 12H+ + 12H2O  glucose + 18ADP + 18Pi +

12N ADP+

PHA CARBOXYL HÓA

PHA KHỬ

PHA TÁI TẠO

Hình 18.4: Chu trình Calvin

Trên đây là sơ đồ vắn tắt của chu trình chỉ với các pha carboxyl hóa và khử được trình bày chi tiết. 3 ribulo-1,5-bisphosphate được carboxyl hóa tạo thành sáu 3-phosphorusglycerat trong pha carboxyl hóa. Các chất này được chuyển hóa thành 6 glycerat-3-phosphate rồi có thể thành dihydroxyacetone phosphate (DHAP) 5 trong số 6 triose (glyceraldehyde phosphate và

dihydroxyacetone phosphate) được dùng để tạo lại 3 ribulo-1,5-bisphosphate trong pha tái sản. Triose còn lại được dùng trong sinh tổng hợp. Những con số trong ngoặc đơn ở bên phải phía dưới chỉ ra dòng carbon này. (Theo: Prescott và cs, 2005)

ATP và N ADPH được cung cấp bởi các phản ứng sáng quang hợp hay bởi sự oxy hoá các phân tử vô cơ ở các vi khuNn hoá tự dưỡng. Sau đó các đường tạo thành trong chu trình Calvin có thể được dùng để tổng hợp các phân tử cần thiết khác.

18.3. TỔNG HỢP CÁC ĐƯỜNG VÀ POLISACCHARIDE

N hiều vi sinh vật không có khả năng quang hợp và là các cơ thể dị dưỡng phải tổng hợp đường từ các phân tử hữu cơ khử thay cho từ CO2.

Hình 18.5: Sự tái tạo đường

Con đường tái tạo đường găp ở nhiều vi sinh vật. Tên của 4 enzyme gặp trong đường phân được đóng khung. Các bước đường phân cũng được biểu thị để so sánh.(Theo: Prescott và cs, 2005)

Việc tổng hợp glucose từ các tiền chất không phải hidrat carbon được gọi là sự tái tạo đường (glucose neogenesis). Mặc dù con đường tái tạo đường không chi con đường đường phân nhưng chúng có 7 enzyme chung (Hình 18.5).

Ba bước đường phân sau đây là không thuận nghịch trong tế bào: 1) Chuyển hoá phosphorusenolPyruvate thành pyruvate; 2) tạo thành fructose -1,6- bisphosphate từ fructose -6-phosphate và 3) phosphoryl hoá glucose. Các bước này phải đi vòng khi con đường hoạt động theo hướng sinh tổng hợp. Chẳng hạn, sự tạo thành fructose -1,6-bisphosphate bởi phosphorusfructose kinase được đảo nghịch bởi enzyme fructose -bisphosphatease, enzyme này loại bỏ nhờ thuỷ phân một phosphate từ fructose -bisphosphate. Thông thường ít nhất hai enzyme tham gia vào việc chuyển hoá pyruvate thành phosphorusenol pyruvate (đảo nghịch bước pyruvate kinase).

Từ hình 18.5 có thể thấy con đường tổng hợp fructose za tương tự như con đường tổng hợp glucose se. Một khi glucose và fructose za đã được tạo thành các đường phổ biến khác cũng được sản sinh. Chẳng hạn, mannose được hình thành trực tiếp từ fructose za qua một sự sắp xếp lại đơn giản:

Fructose -6-phosphate Mannose-6-phosphate

Một số đường được tổng hợp trong khi liên kết với một nucleoside diphosphate. Đường nucleoside diphosphate quan trọng nhất là uridine diphosphate glucose (UDPG). Glucose được hoạt hoá nhờ gắn với pyrophosphate của uridine diphosphate qua phản ứng với uridine triphosphate (Hình 18.6).

Hình 18.6: Uridine diphosphate glucose (Theo: Prescott và cs, 2005)

Phần UDP của HDPG được các enzyme nhận ra và mang glucose đi khắp tế bào dùng tham gia vào các phản ứng hệt như ADP mang phosphate ở dạng ATP. UDP-galactose được tổng hợp từ UDPG qua việc sắp xếp lại của một nhóm hydroxyl. Một enzyme khác xúc tác việc tổng hợp UDP - acid glucuronic qua việc oxy hoá UDPG (hình 18.7).

Hình 18.7: Uridine diphosphate galactose và tổng hợp glucuronate

Trên hình là việc tổng hợp UDP-galactose và UDP-acid glucuronic từ UDP-glucose se. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Các đường nucleoside diphosphate cũng đóng vai trò chủ chốt trong việc tổng hợp các polisaccaride như tinh bột và glycogen. Cũng lại ở đây, sinh tổng hợp

không đơn giản chỉ là sự đảo ngược trực tiếp của phân giải. Sự phân giải glycogen và tinh bột diễn ra qua sự thuỷ phân để tạo thành các đường tự do hay qua việc gắn thêm nhánh phosphate vào các polime này để sản ra glucose -1-phosphate. Các đường nucleoside diphosphate không tham gia vào quá trình trên. Trái lại trong việc tổng hợp glycogen và tinh bột ở vi khuNn và tảo adenosine diphosphate glucose được tạo thành từ glucose -1-phosphate và sau đó chuyển glucose vào cuối chuỗi glycogen và chuỗi tinh bột:

ATP + Glucose -1-phosphate  ADP-glucose + PPi

(Glucose se)n + ADP-glucose  (Glucose se)n+1 + ADP

Các đường nucleoside diphosphate cũng tham gia vào việc tổng hợp các phân tử phức tạp như thành tế bào vi khuNn.

18.4. SỰ ĐỒNG HÓA PHOSPHORUS, LƯU HUỲNH (SULFUR) VÀ NITƠ

(NITROGEN) VÔ CƠ

N goài carbon và oxy vi sinh vật cũng cần một lượng phosphorus, sulfur và nitrogen cho sinh tổng hợp. Mỗi nguyên tố nói trên được đồng hoá hoặc được cố định thành các phân tử hữu cơ qua các con đường khác nhau.

18.4.1. Sự đồng hoá phosphorus

Phosphorus gặp trong các acid nucleic, protein, phospholipid, ATP và các coenzyme như N ADP. N guồn phosphorus phổ biến nhất là các este của phosphate vô cơ và phosphate hữu cơ. Phosphate vô cơ được cố định qua việc tạo thành ATP thông qua một trong ba con đường: 1) quang phosphoryl hoá; 2) phosphoryl hoá oxy hoá và 3) phosphoryl hoá ở mức độ cơ chất.

Đường phân cung cấp một ví dụ của con đường thứ ba. Phosphate được gắn với glyceraldehyde-3-phosphate tạo thành 1,3-bisphosphorusglycerat, sau đó chất này được dùng để tổng hợp ATP.

Glyceraldehyde-3-phosphate + Pi + N AD+  1,3-bisphosphorusglycerat + N ADH

+ H+

1,3-bisphosphorusglycerat + ADP  3-phosphorusglycerat + ATP

Vi sinh vật có thể thu nhận các phosphate hữu cơ từ môi trường bao quanh ở dạng hoà tan hay dạng hạt. Các este của phosphate hữu cơ thường bị thuỷ phân bởi các phosphatease và tách ra phosphate vô cơ. Vi khuNn gram âm chứa các

phosphatease trong khoang chu chất nằm giữa thành tế bào và màng sinh chất;vì vậy sau khi được giải phóng phosphate được hấp thu trực tiếp qua màng. Động vật nguyên sinh, trái lại, có thể sử dụng trực tiếp các phosphate hữu cơ sau khi ăn hoặc thuỷ phân chúng trong lyzosom và tiêu thụ phosphate.

18.4.2. Sự đồng hoá sulfur

Sulfur cần cho việc tổng hợp amino acid (cystein và methionine) và một số coenzyme (coenzyme A, tiamine-pyrophosphate và biotin) và có thể thu được từ hai nguồn. N hiều vi sinh vật sử dụng cystein và methionine dẫn xuất từ các nguồn bên ngoài hoặc từ dự trữ amino acid nội bào. N goài ra, sulfate có thể cung cấp sulfur cho sinh tổng hợp. N guyên tử sulfur trong sulfate oxy hoá hơn nguyên tử sulfur trong cystein và các phân tử hữu cơ khác, do đó sulfate phải bị khử trước khi có thể được đồng hoá. Quá trình này được gọi là sự khử sulfate đồng hoá để phân biệt với sự khử sulfate dị hoá diễn ra khi sulfate tác dụng như chất nhận electron trong hô hấp kỵ khí.

Sự khử sulfate đồng hoá đòi hỏi phải hoạt hoá sulfate qua việc tạo thành phosphoadenosine-5'-phosphosulfate (Hình 18.8) tiếp theo là sự khử sulfate. Đây là một quá trình phức tạp (Hình 18.9) trong đó sulfate trước hết bị khử thành sulfit

( 2

SO3

) sau đó thành H2S. Cystein có thể được tổng hợp từ sulfua hydro qua hai

con đường.

Hình 18.8: Phosphorusadenosin 5'-phosphorussulfate (PAPS). Theo: Prescott và cs, 2005)

Hình 18.9: Con đường khử sulfate (Theo: Prescott và cs, 2005)

N ấm có thể kết hợp H2S với serine tạo thành cystein nhưng nhiều vi khuNn lại gắn H2S với O-Acetylserine (quá trình 1 và 2, lần lượt)

(1) H2S + Serine Cystein + H2O

Acetyl-

CoA

H2S

Acetat

(2) CSeArine O-Acetylserine Cystein

Một khi được tạo thành cystein có thể được dùng để tổng hợp các hợp chất hữu cơ khác có chứa sulfur.

18.4.3. Sự đồng hoá nitrogen

Do là thành phần chủ yếu của các protein, acid nucleic, coenzyme và nhiều thành phần khác nên năng lực đồng hoá nitrogen của tế bào là cực kỳ quan trọng. Mặc dù khí quyển giàu khí nitrogen nhưng chỉ một số ít vi khuNn có thể khử khí này và sử dụng làm nguồn nitrogen. Còn hầu hết vi sinh vật có khả năng đồng hoá ammonia hoặc nitrate.

Sự đồng hoá ammonia

N itrogen của ammonia có thể được chuyển hoá thành chất hữu cơ tương đối dễ dàng và trực tiếp vì nitrogen ở đây gặp trong trạng thái khử hơn các dạng khác

của nitrogen vô cơ. Một số vi sinh vật tổng hợp amino acid alanine trong một phản

ứng amine hoá khử xúc tác bởi alanine-dehydrogenase:

 + + +

Pyruvate + N H4

+ N ADH (N ADPH) + H

alanine + N AD (N ADP ) + H2O

Hình 18.10: Con đường đồng hóa ammonia. Sự đồng hóa ammonia nhờ glutamate.dehydrogenase (GDH) và transaminease. Các GDH phụ thuộc NADP hoặc NAD có thể tham gia vào đây. Con đường này hoạt động mạnh nhất ở những nồng độ ammonia cao ( Theo Prescott và cs, 2005)

Con đường chủ yếu đồng hoá ammonia là tạo thành glutamate từ α- ketoglutarate (một chất trung gian của chu trình TCA). N hiều vi khuNn và nấm sử dụng glutamate-dehydrogenase khi nồng độ ammonia cao:

 + + +

α -ketoglutarate + N H4 + N ADPH (N ADH) + H

Glutamate + N ADP

(N AD ) + H2O

Việc sử dụng N ADPH và N ADH (tác nhân khử) trong tổng hợp glutamate thay đổi tuỳ theo loài.

Một khi alanine hoặc glutamate đã được tổng hợp nhóm α-amine mới được tạo thành có thể được chuyển sang các bộ khung carbon khác thông qua các phản ứng chuyển amine, từ đó sẽ xuất hiện các amino acid khác. Các transaminease chứa coenzyme pyridoxal phosphate có chức năng chuyển nhóm amine. Vi sinh vật có một số transaminease, mỗi enzyme này xúc tác việc tạo thành một số amino acid bằng cách sử dụng cùng một amino acid làm chất cho nhóm amine. Khi glutamate-dehydrogenase hoạt động phối hợp với các transaminease ammonia có thể được chuyển thành nhiều amino acid (hình 18.10).

Phản ứng glutamine synthetase

Acid glutamic Glutamine

Phản ứng glutamate synthase

Acid - ketoglutaric

Glutamine

2 acid glutamic

Hình 18.11: Glutamine synthetase và glutamate synthase

Các phản ứng do 2 enzyme này xúc tác tham gia vào việc đồng hóa ammonia. Một số glutamate synthetase sử dụng NADPH là nguồn electron, số khác lại sử dụng ferredoxin khử (Fd). (Nguồn Prescott và cs, 2005)

Con đường thứ hai dùng đồng hoá ammonia bao gồm 2 enzyme tác dụng theo thứ tự, đó là glutamine synthetase và glutamate-synthase (hình 18.11). Ammonia được dùng để tổng hợp glutamine từ glutamate, sau đó nitrogen amit của glutamine được chuyển đến α-ketoglutarate để tạo thành một phân tử glutamate mới. Vì glutamate tác dụng như một chất cho amine trong các phản ứng của transaminease nên ammonia có thể được dùng để tổng hợp tất cả các amino acid thông thường khi có mặt các transaminease thích hợp (hình 18.12).

Cả ATP và một nguồn các electron như N ADPH hay ferredoxin khử đều cần. Con đường này gặp ở E. coli, B. megaterium và nhiều vi khuNn khác. Hai enzyme tác dụng theo thứ tự hoạt động rất hiệu quả ở các nồng độ ammonia thấp khác với con đường glutamate dehydrogenase. N hư đã nói ở trên glutamine synthetase được điều hoà chặt chẽ nhờ sự cải biến cộng hoá trị thuận nghịch và các effector dị lập thể.

Hình 18.12: Cố định ammonia nhờ glutamine synthetase và glutamate synthase

Con đường này hoạt động có hiệu quả ở những nồng độ ammonia thấp. (Theo: Prescott và cs,

2005)

Sự khử nitrate đồng hoá

N itrogen trong nitrate ( N O ) ở trạng thái oxy hoá hơn nhiều so với nitrogen trong ammonia. N itrate trước hết phải bị khử thành ammonia trước khi nitrogen có thể được chuyển hoá thành một dạng hữu cơ. Sự khử này của nitrate được gọi là khử nitrate đồng hoá. Quá trình này khác với quá trình diễn ra trong hô hấp kỵ khí

và khử nitrate dị hoá. Trong sự khử nitrate đồng hoá nitrate được chuyển thành

chất hữu cơ và không tham gia vào việc sản sinh năng lượng. Khử nitrate đồng hoá gặp phổ biến ở vi khuNn, nấm và tảo.

Quá trình nói trên diễn ra trong tế bào chất ở vi khuNn.

Bước thứ nhất trong đồng hoá nitrate là khử nitrate thành nitrite xúc tác bởi nitrate reductase là enzyme chứa FAD và molipden (Hình 18.13), N ADPH là nguồn electron:

N O

+ N ADPH +H+ 

N O + N ADP+

+ H2O

Sau đó, nitrite bị khử thành ammonia thông qua một số lần bổ sung 2 electron được xúc tác bởi nitrite reductase và có thể cả các enzyme khác. Hydroxylamine có thể là một chất trung gian. Tiếp theo ammonia được chuyển hoá thành các amino acid nhờ các con đường đã mô tả.

Hình 18.13: Khử nitrate đồng hóa

Con đường này gặp ở các vi khuẩn có thể khử và đồng hóa nitrogen của nitrate. Theo: Prescott và cs, 2005)

18.4.4. Sự cố định Nitrogen (Nitrogen fixation)

Sự khử khí nitrogen của khí quyển được gọi là sự cố định nitrogen. Vì nồng độ của ammonia và nitrate thường thấp, hơn nữa chỉ một số vi khuNn có khả năng trên (các tế bào nhân thật hoàn toàn không thể thực hiện được cố định N 2) nên tốc độ của quá trình này trong nhiều hoàn cảnh, hạn chế sinh trưởng của thực vật. Cố định nitrogen gặp ở: 1) các vi khuNn sống tự do (ví dụ: Azotobacter, Klebsiella, Clostridium và Methanococcus); 2) các vi khuNn cộng sinh với thực vật như các cây họ Đậu (Rhizobium), cây phi lao (xạ khuNn Frankia) và bèo dâu (vi khuNn lam Anabaena azollae) và 3) các vi khuNn lam (Nostoc và Anabaena).

Sự khử nitrogen thành ammonia được xúc tác bởi enzyme nitrogenase. Mặc dù các chất trung gian gắn vào enzyme ta còn chưa rõ nhưng có lẽ nitrogen bị khử qua một số lần bổ sung 2 electron như Hình 18.14 mô tả. Sự khử nitrogen phân tử thành ammonia phát nhiệt mạnh nhưng phản ứng có năng lượng hoạt hoá cao do nitrogen phân tử là một khí trơ với một liên kết ba giữa hai nguyên tử nitrogen.

Vì vậy, sự khử nitrogen là tốn kém và tiêu thụ nhiều ATP. Ít nhất 8 electron và 16ATP, cứ 4ATP là cần cho một cặp electron.

N 2 + 8H+ + 8e + 16ATP  2N H3 + H2 + 16ADP + 16Pi

Hình 18.14: Khử nitrogen. Giả thuyết khử nitrogen nhờ nitrogenase. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Các electron bắt nguồn từ ferredoxin đã bị khử bởi một số con đường, chẳng hạn qua quang hợp ở vi khuNn lam, qua các quá trình hô hấp ở các vi khuNn cố định nitrogen hiếu khí hoặc qua lên men ở các vi khuNn kỵ khí. Ví dụ, Clostridium pasteurianum (một vi khuNn kỵ khí) khử ferredoxin trong quá trình oxy hoá Pyruvate, trong khi Azotobacter (một vi khuNn hiếu khí) lại sử dụng electron từ N ADPH để khử ferredoxin.

N itrogenase là một phức hệ gồm 2 protein chủ yếu: một protein MoFe (hay nitrogenase, MW 220.000) liên kết với 1-2 protein Fe (hay nitrogenase reductase, MW 64.000). Protein MoFe chứa 2 nguyên tử molipden và 28-32 nguyên tử sắt; protein Fe chứa 4 nguyên tử sắt hình 18.15). Fe và Mo của protein MoFe được chứa bên trong một cofactor gọi là FeMo-co và sự khử N 2 diễn ra ở cofactor này.

Trước hết protein Fe bị khử bởi ferredoxin sau đó nó liên kết ATP (hình18.16). Sự liên kết ATP làm thay đổi hình thể của protein Fe và hạ thấp thế

khử của protein này (từ 100mV đến  400 mV) tạo điều kiện cho protein Fe khử

protein MoFe. ATP bị thuỷ phân khi diễn ra sự chuyền electron này. Cuối cùng, protein MoFe khử chuyền các electron tới nitrogen nguyên tử.

Hình 18.15: Cấu trúc của protein Fe ở nitrogenase (Theo: Prescott và cs, 2005)

Một số vi khuNn chứa enzyme hidrogenase oxi hóa H2 thành H2O và liên kết phản ứng này với việc tạo thành ATP hay với việc khử ferredoxin (Fd) hoặc flavodoxin (Fld) rồi các chất này lại có thể chuyển electron cho protein Fe. N itrogenase rất mẫn cảm với O2 và phải được bảo vệ sao cho khỏi bị bất hoạt bởi O2 bên trong tế bào. Ở nhiều vi khuNn lam sự bảo vệ này được thực hiện nhờ một cấu trúc đặc biệt gọi là dị bào nang (heterocyst), có vách dày, chỉ chứa hệ quang I (dùng tổng hợp ATP nhưng không tạo thành O2). N itrogenase cố định N 2 bên trong dị bào nang và nhận được saccarose từ các tế bào lân cận sau đó truyền nitrogen cố định được cho các tế bào trên. Ở các vi khuNn hiếu khí, cố định N 2 như Azotobacter nitrogenase được bảo vệ nhờ: (1) Lớp vỏ nhày bao quanh tế bào cản trở sự khuếch tán của O2 vào tế bào; (2) Vận tốc hô hấp cao nhờ đó O2 bị loại bỏ nhanh; (3) N itrogenase được kết hợp với một protein đặc biệt nhờ đó không bị bất hoạt bởi O2. N ốt rễ của các cây đậu thuộc họ Leguminosae tạo thành một protein màu đỏ gọi là leghemoglobin có khả năng liên kết O2 tự do đủ cho quá trình hô hấp tạo thành ATP nhưng không kìm hãm hoạt tính của nitrogenase của vi khuNn Rhizobium.

Hình 18.16: Cơ chế tác dụng của nitrogenase. Quá trình di chuyển của 2 electron từ ferredoxin tới nitrogen được lặp lại 3 lần để khử N2 thành 2 phân tử ammonia. Cân bằng ở phía dưới bao gồm cả việc khử proton thành H2. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Đáng chú ý, ở đây có sự cộng sinh di truyền giữa hai cơ thể: cây tổng hợp phần protein còn vi khuNn tổng hợp nhóm hem. Tổng hợp nitrogenase không những bị kìm hãm bởi O2 nhưng cũng bởi các hợp chất nitrogen vô cơ và hữu cơ. Khi thiếu nguồn năng luợng ADP được tích lũy lại và ức chế hoạt tính của enzyme. Điều này làm tăng cái giá của sự khử N 2. Theo tính toán để cố định được

1 mg N Clostridium pasteurianum phải tiêu thụ 1g C hữu cơ trong glucose khi đó

vi khuNn hiếu khí Azotobacter chroococcum thậm chí cần tới 30g.

Trong điều kiện đất thiếu Mo một số vi khuNn có thể tổng hợp 2 loại nitrogenase khác: chứa Va (vanadi) Fe hay chỉ chứa Fe. Các cofactor tương tự FeMo-co gặp trong cả 2 nitrogenase nói trên nghĩa là FeVa-co (trong nitrogenase vanadi) và 1 nhóm Fe-S (tương tự FeMo-co và FeVa-co) nhưng thiếu cả Mo và Va (trong nitrogenase sắt)

Sự khử nitrogen thành N H3 diễn ra qua ba bước, mỗi bước cần 2 electron

(hình 18.14 và 18.16). N hư vậy 6 electron sẽ được chuyển và cần tổng cộng

12ATP đối với một phân tử nitrogen bị khử. Tuy nhiên trên thực tế quá trình thường tiêu thụ ít nhất 8 electron và 16ATP vì nitrogenase cũng khử các proton thành H2. Hydro phản ứng với diamine (HN = N H) tạo thành nitrogen và hydro. Chu trình vô ích này sản ra một phần N 2 ngay trong điều kiện thuận lợi khiến cho việc cố định nitrogen trở nên tốn kém hơn. Các vi khuNn cố định nitrogen cộng sinh có thể tiêu thụ tới 20% ATP do cây chủ sản ra N itrogenase có thể khử một số phân tử chứa liên kết ba (như Acetylen, xianit và azit)

HC  CH + 2H+ + 2e  H2C = CH2

Tốc độ khử Acetylen thành etilen được dùng để đánh giá hoạt tính nitrogenase.

Một khi nitrogen phân tử đã bị khử thành ammonia, ammonia có thể được chuyển thành các chất hữu cơ. Ở Rhizobium (vi khuNn cố định nitrogen cộng sinh), có lẽ ammonia khuếch tán khỏi tế bào vi khuNn và được đồng hoá bởi các tế bào của cây đậu bao quanh. Việc đồng hoá ammonia có lẽ chủ yếu là tổng hợp glutamine bởi hệ thống glutamine synthetase - glutamate synthase (Hình 18.11). Tuy nhiên, allantoin và acid allantoic (các dẫn xuất của Purine) cũng được tổng hợp và được dùng cho việc vận chuyển nitrogen tới các phân tử khác của cây.

18.5. TỔNG HỢP CÁC AMINO ACID

Vi sinh vật thay đổi về các nguồn nitrogen được sử dụng nhưng hầu hết có thể đồng hoá một vài loại nitrogen vô cơ nhờ các con đường đã mô tả. Việc tổng hợp amino acid cũng đòi hỏi sự kiến trúc nên các bộ khung carbon thích hợp và thông thường đây là một quá trình phức tạp bao gồm nhiều bước. Do nhu cầu bảo tồn nitrogen, carbon và năng lượng nên các con đường tổng hợp acid amine, nói chung, được điều hoà chặt chẽ bởi các cơ chế dị lập thể và cơ chế kìm hãm bởi sản phNm cuối cùng.

E. coli, tảo và hầu hết thực vật có khả năng tổng hợp tất cả amino acid từ các tiền chất. Các sinh vật khác kể cả người không có khả năng tổng hợp một số amino acid không thay thế và phải thu được chúng trong thức ăn. Một số vi khuNn lactic như Lactobacillus hoàn toàn không tổng hợp được một amino acid nào và phải thu nhận chúng nhờ phân giải protein trong môi trường.Trong mục này không thể trình

bày chi tiết con đường sinh tổng hợp của từng amino acid mà chỉ giới thiệu khái quát về sinh tổng hợp amino acid.

Hình 18.17: Tổ chức của sự đồng hóa

Các sản phẩm sinh tổng hợp dẫn xuất từ các chất trung gian của con đường lưỡng hóa. Chú ý 2 phản ứng cố định CO2 bổ sung chủ yếu. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Hình 18.17 mô tả quan hệ của con đường sinh tổng hợp amino acid với các con đường lưỡng hoá. Bộ khung của amino acid bắt nguồn từ Acetyl-CoA và các chất trung gian của chu trình TCA, đường phân và con đường pentose-phosphate.

Để cho hiệu quả và kinh tế nhất các tiền chất dùng cho sinh tổng hợp amino acid được cung cấp chỉ từ một vài con đường lưỡng hoá chủ yếu. Thứ tự dẫn đến các amino acid riêng rẽ phân nhánh từ các con đường trung tâm này. Alanine, aspartat và glutamate được được tổng hợp nhờ sự chuyển amine lần lượt, trực tiếp từ Pyruvate, Oxaloacetatee và α-ketoglutarate.

Hình 18.18: Con đường phân nhánh của tổng hợp amino acid. Các con đường dẫn tới methionine, threonine, izoleucine và lysine. Mặc dù 1 số mũi tên biểu thị 1 bước tuy nhiên hầu hết những sự chuyển hóa qua lại đều đòi hỏi sự tham gia của 1 số enzyme. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Hầu hết các con đường sinh tổng hợp đều phức tạp hơn và các chất trung gian quen thuộc thường được dùng trong sinh tổng hợp của các họ amino acid có liên quan nhằm mục đích tiết kiệm hơn. Chẳng hạn, lysine, threonine, izoleucine và methionine đều được tổng hợp từ oxaloacetatee từ một con đường đồng hoá phân nhánh (Hình 18.18). Con đường sinh tổng hợp các amino acid thơm phenylalanine, tyrosine và tryptophan cũng có chung nhiều chất trung gian (Hình

18.19).

Hình 18.19: Tổng hợp các amino acid thơm (phenylalanine, tyrosine, tryptophan). Chú ý: hầu hết các mũi tên đều biểu thị trên 1 phản ứng enzyme. (Theo: Prescott và cs, 2005)

18.6. CÁC PHẢN ỨNG BỔ SUNG

Khi xem xét hình 18.17 ta thấy các chất trung gian của chu trình TCA được dùng trong sinh tổng hợp các pyrimidine và nhiều acid amine. Trên thực tế, các chức năng sinh tổng hợp của chu trình này quan trọng đến mức hầu hết chu trình hoạt động kỵ khí để cung cấp các tiền chất sinh tổng hợp mặc dù N ADH là không cần thiết cho việc vận chuyển electron và phosphoryl hoá trong sự vắng mặt của O2. Do đó chu trình TCA có vai trò đáng kể trong việc cung cấp carbon cho sinh tổng hợp và các chất trung gian của chu trình có thể bị cạn kiệt nếu tế bào không có biện pháp duy trì chúng. Tuy nhiên vi sinh vật có các phản ứng hoàn lại các chất trung gian của chu trình giúp cho chu trình TCA có thể hoạt động liên tục khi sinh tổng hợp đang diễn ra mạnh mẽ. Các phản ứng thay thế các chất trung gian của chu trình được gọi là các phản ứng bổ sung (anaplerotic reactions).

Hầu hết vi sinh vật có thể thay thế các chất trung gian của chu trình TCA

bằng cố định CO2, trong đó CO2 được chuyển hoá thành carbon hữu cơ và được

đồng hoá. Cần phân biệt là, các phản ứng bổ sung không đảm nhiệm cùng chức năng như con đường cố định CO2 cung cấp carbon cần thiết ở các cơ thể tự dưỡng. Cố định CO2 ở các cơ thể tự dưỡng cung cấp hầu hết hoặc toàn bộ carbon cần cho sinh trưởng. Các phản ứng bổ sung cố định CO2 chỉ nhằm thay thế các chất trung gian và duy trì cân bằng trao đổi chất. Thường thường CO2 được gắn vào một phân tử chất nhận (Pyruvate hoặc phosphorusenolPyruvate) để tạo thành chất trung gian của chu trình là Oxaloacetatee (Hinh 18.17). Arthrobacter globiformis và nấm men sử dụng Pyruvate-carboxylase xúc tác phản ứng này.

Pyruvate + CO2 + ATP + H2O

Biotin  Oxaloacetatee + ADP + Pi

Enzyme trên cần cofactor là biotin và sử dụng năng lượng của ATP để liên kết CO2 vào Pyruvate. Biotin thường là cofactor của các enzyme xúc tác phản ứng carboxyl hoá. Do có chức năng quan trọng như vậy nên biotin là yếu tố sinh trưởng cần thiết đối với nhiều loài vi sinh vật. Các vi sinh vật khác như E. coli, Salmonella typhimurium lại sử dụng enzyme phosphoenolpyruvate-carboxylase xúc tác phản ứng dưới đây:

Phosphoenolpyruvate + CO2  Oxaloacetatee + Pi

Một số vi khuNn, tảo, nấm và động vật nguyên sinh có thể sinh trưởng với nguồn carbon duy nhất là acetate bằng cách sử dụng acetate để tổng hợp các chất trung gian của chu trình TCA trong chu trình glioxylat (Hình 18.20). Chu trình được thực hiện nhờ hai enzyme đặc biệt - Izocitrate liase và malat synthase - xúc tác các phản ứng sau:

Izocitrate

izoxitrat lyaza Succinat + Glioxylat

Glioxylat + Acetyl-CoA

malatsin taza Malat + CoA

Chu trình glioxylat, thực ra là một chu trình TCA cải biến. Hai phản ứng loại carboxyl của chu trình TCA (bước Izocitrate dehydrogenase và α-ketoglutarate dehydrogenase) được bỏ qua giúp cho việc chuyển hoá Acetyl-CoA để tạo thành Oxaloacetatee mà không để mất carbon của Acetyl-CoA như CO2. Theo cách này, acetate và bất kỳ các phân tử nào được chuyển hoá thành acetate đều có thể đóng góp carbon vào chu trình và giúp cho sinh trưởng của vi sinh vật.

CHU TRÌNH GLIOXYLAT

Hình 18.20: Chu trình glioxylat. Chú ý: các enzyme của chu trình TCA ở

phần dưới được bỏ qua. (Theo: Prescott và cs, 2005)

18.7. TỔNG HỢP CÁC PURINE, PYRIMIDIN VÀ NUCLEOTIDE

Sinh tổng hợp của purine và pyrimidine là sống còn cho mọi tế bào vì các phân tử này được dùng để tổng hợp ATP, một số cofactor, acid ribonucleic (ARN ), acid deoxyribonucleic (ADN ) và các thành phần quan trọng khác của tế bào. Hầu

hết vi sinh vật có thể tổng hợp các Purine và pyrimidine cho bản thân vì các chất này có vai trò quyết định đối với chức năng của tế bào.

Purine và pyrimidine là các bazơ nitrogen vòng chứa một số nối đôi và có các đặc tính thơm rõ rệt. Purine gồm 2 vòng nối với nhau, còn pyrimidine chỉ có một vòng (hình 18.21 và 18.23). Trong vi sinh vật thường gặp các purine adenin và guanin và các pyrimidine uracyl, xitozin và thymine. Một base purine hoặc pyrimidine nối với một đường pentose (ribose hoặc deoxyribose) là một nucleoside. Một nucleotide là một nucleoside nối với một hoặc trên một nhóm phosphate liên kết với đường.

Nitơ amine của aspactate

Glycine

Nhóm format từ acid folic

Nhóm format từ

acid folic

Nitơ amide của glutamine

Hình 18.21: Sinh tổng hợp Purine.

Chú ý sự chỉ dẫn các nguồn N và C của bộ khung Purine. (Theo: Prescott và cs, 2005)

18.7.1. Sinh tổng hợp Purine

Con đường sinh tổng hợp các purine là một thứ tự phức tạp gồm 11 bước trong đó 7 phân tử khác nhau góp phần vào bộ khung purine cuối cùng (Hình

18.21). Vì con đường mở đầu với ribo-5-phosphate và bộ khung purine được kiến trúc trên đường này nên sản phNm purine đầu tiên của con đường là nucleotide acid inosinic chứ không phải là một base purine tự do. Trong sinh tổng hợp của purine cofactor acid folic đóng vai trò rất quan trọng. Các dẫn xuất của acid folic đóng góp carbon 2 và 8 vào bộ khung purine. Trên thực tế, thuốc sulfonamide kìm hãm sinh trưởng của vi khuNn là do ức chế tổng hợp acid folic. Điều này sẽ ảnh hưởng đến sinh tổng hợp của purine và các quá trình khác cần acid folic.

Một khi acid inosinic đã được tạo thành, các con đường tương đối ngắn sẽ tổng hợp adenosine monophosphate và guanosine monophosphate (Hình 18.22) và sản ra nucleoside diphosphate và triphosphate bằng cách chuyển phosphate từ ATP. ADN chứa deoxyribonucleotide (ribose thiếu một nhóm hydroxyl trên C2) thay cho ribonucleotide gặp trong ARN . Các deoxyribonucleotide xuất hiện từ sự khử của các nucleoside diphosphate hoặc nucleoside triphosphate qua hai con đường khác nhau. Một số vi sinh vật khử triphosphate nhờ hệ thống cần cofactor vitamine B12. Số khác, như E. coli, lại khử ribose trong nucleoside diphosphate. Cả hai hệ thống đều sử dụng một protein nhỏ chứa S gọi là thioredoxin làm tác nhân khử.

Hình 18.22. Sinh tổng hợp adenosine monophosoahte và Guanosine

Monophosphatee

18.7.2. Sinh tổng hợp pyrimidine

Sinh tổng hợp pyrimidine mở đầu với acid aspartic và cacbamoyl-phosphate

(một phân tử cao năng được tổng hợp từ CO2 và ammonia) (Hình 18.23).

Aspartate-cacbamoyltransferase xúc tác việc ngưng tụ hai cơ chất này để tạo thành cacbamoyl-aspartat, sau đó chất này được chuyển thành sản phNm pyrimidine đầu tiên đó là acid orotic.

Sau khi bộ khung pyrimidine được tổng hợp, một nucleotide sẽ được tạo thành bằng cách thêm vào ribo-5-phosphate nhờ tác dụng của chất trung gian cao năng 5-phosphorusribosyl-1-pyrophosphate. Do đó việc kiến trúc vòng pyrimidine được hoàn thành trước khi ribose được thêm vào trái với việc tổng hợp vòng Purine bắt đầu với ribo-5-phosphate. Việc loại carboxyl hoá của orotidine monophosphate sản ra uridine monophosphate và cuối cùng uridine triphosphate và cytidine triphosphate.

Hình 18.23: Tổng hợp pyrimidine.

PRPP là acid 5-phosphorusribose 1- pyrophosphorusric, chất cung cấp chuỗi ribo-5-phosphate.

Phần dẫn xuất từ cacbamoylphosphate được in đậm. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Pyrimidine thứ ba phổ biến là thymine - một thành phần của ADN . Ribose trong các nucleotide pyrimidine bị khử theo cùng cách như trong các nucleotide purine. Sau đó deoxyuridine monophosphate được methyl hoá với dẫn xuất của acid folic để tạo thành deoxythymidine monophosphate (Hình 18.24).

Hình 18.24: Tổng hợp deoxythymidine monophosphate. Chú ý:

deoxythymidine khác với deoxyuridine ở chỗ có thêm nhóm methyl. (Theo: Prescott và cs, 2005)

18.8. TỔNG HỢP LIPID

Vi sinh vật chứa nhiều lipid đặc biệt là ở màng tế bào. Lipid thường chứa các acid béo hoặc dẫn xuất của acid béo. Acid béo là các acid monocarboxylic với các chuỗi alkyl dài thường có một số chẵn carbon (chiều dài trung bình là 18 carbon). Một số có thể là chưa bão hoà nghĩa là có một hoặc trên một nối đôi. Hầu hết acid béo của vi sinh vật là chuỗi thẳng nhưng có một số phân nhánh. Các vi khuNn gram âm thường có các acid béo cyclopropan (tức là các acid béo chứa một hoặc trên một các vòng cyclopropan trong chuỗi).

Việc tổng hợp các acid béo được xúc tác bởi phức hệ synthetase acid béo với Acetyl-CoA và malonyl-CoA như cơ chất và N ADPH như chất cho electron. Malonyl-CoA dẫn xuất từ sự carboxyl hoá của Acetyl-CoA với sự tiêu thụ ATP. Việc tổng hợp diễn ra sau khi acetate và malonat đã được chuyển từ CoA đến nhóm sulfihidril của protein mang acyl (ACP, acyl carrier) là một protein nhỏ mang chuỗi acid béo đang sinh trưởng trong tổng hợp. Ở mỗi thời điểm synthetase lại thêm 2 carbon vào đầu carboxyl của chuỗi acid béo đang sinh trưởng trong một quá trình gồm hai chặng (Hình 18.25). Trước hết, malonyl-ACP phản ứng với acyl-

ACP acid béo để sản ra CO2 và một acyl-ACP acid béo có 2 carbon dài hơn. Việc mất đi CO2 hướng cho phản ứng hoàn thành. Ở đây ATP được dùng để bổ sung CO2 vào Acetyl-CoA tạo thành malonyl-CoA. Cũng CO2 như vậy mất đi khi malonyl-ACP chuyền các carbon cho chuỗi. Do đó CO2 là cần thiết cho tổng hợp acid béo nhưng không phải luôn luôn được cố định. Trên thực tế, một số vi sinh vật cần CO2 để sinh trưởng tốt nhưng chúng vẫn có thể sinh trưởng thuận lợi khi không có CO2 mà có mặt một acid béo như acid oleic (một acid béo 18 carbon không bão hoà). Trong chặng thứ hai của tổng hợp nhóm α-keto xuất hiện từ phản ứng ngưng tụ ban đầu bị loại đi trong một quá trình ba bước bao gồm hai sự khử và một sự loại nước. Sau đó acid béo sẵn sàng cho việc bổ sung thêm 2 nguyên tử carbon nữa.

Hình 18.25: Tổng hợp acid béo. Chu trình được lặp lại cho tới khi chiều dài chuỗi thực sự đã đạt được. ACP = acyl carrier protein (protein mang acyl). (Theo: Prescott và cs,

2005)

Các acid béo không bão hoà được tổng hợp theo hai con đường. Các tế bào nhân thật và vi khuNn hiếu khí như Bacillus megaterium sử dụng con đường hiếu khí với sự tham gia của cả N ADPH và O2.

O

R (CH2)9 C SCoA + NADPH + H + O2

O

R CH CH (CH2)7 C SCoA + NA DPH + + 2H2O

Một nối đôi tạo thành giữa các carbon 9 và 10 và O2 bị khử thành nước nhờ

các electron do cả acid béo và N ADPH cung cấp. Các vi khuNn kỵ khí và một số vi khuNn hiếu khí tạo ra các nối đôi trong quá trình tổng hợp acid béo bằng cách loại nước các acid béo hydroxy. Oxy không cần cho việc tổng hợp nối đôi theo cách này. Con đường kỵ khí hoạt động ở một số vi khuNn gram âm quen thuộc (ví dụ: E. coli và Salmonella typhimurium), vi khuNn gram dương (ví dụ: Lactobacillus plantarum và Clostridium pasteurianum) và vi khuNn lam.

(Theo: Prescott và cs, 2005)

Các vi sinh vật nhân thật thường dự trữ carbon và năng lượng ở dạng triacylglycerol, glycerol được este hoá với 3 acid béo. Glycerol xuất hiện từ sự khử dihydroxyacetone phosphate (là chất trung gian của đường phân) thành glycerol-3- phosphate, sau đó glycerol-3-phosphate được este hoá với 2 acid béo để cho acid phosphateidic (Hình 18.26). Phosphate bị thuỷ phân khỏi acid phosphateidic tạo thành diacylglycerol và acid béo thứ ba được gắn vào để sản ra một triacylglycerol.

Phospholipid là thành phần chủ yếu của màng tế bào nhân thật và hầu hết tế bào nhân nguyên thuỷ. Tổng hợp phospholipid cũng thường diễn ra theo con đường của acid phosphateidic. Một chất mang đặc biệt-cytidine diphosphate (XDP)-đóng vai trò tương tự vai trò của các chất mang của uridine và adenosine diphosphate trong sinh tổng hợp hidrat carbon. Chẳng hạn, vi khuNn tổng hợp phosphateidinetanolamine (một thành phần chủ yếu của màng tế bào) qua việc tạo thành XDP - diacylglycerol đầu tiên (Hình 18.26). Sau đó dẫn xuất XDP này phản ứng với serine để tạo thành phospholipid phosphateidilserine và qua việc loại carboxyl sẽ xuất hiện phosphateidinetanolamine. Theo cách này, một lipid màng, phức tạp được tạo nên từ các sản phNm của đường phân, sinh tổng hợp acid béo và sinh tổng hợp acid amine.

18.9. TỔNG HỢP PEPTIDOGLYCAN

Hầu hết thành tế bào vi khuNn chứa một phân tử lớn, phức tạp bao gồm các chuỗi polisaccaride dài tạo thành bởi các nhánh luân phiên acid N -Acetylmuramic (N AM) và N -Acetylglucose semin (N AG). Gắn vào các nhánh N AM là các chuỗi pentapeptide. Các chuỗi polisaccaride được liên kết với nhau bởi các pentapeptide hay bởi các cầu nối gian - peptide phức tạp của peptidoglycan, dĩ nhiên, càng đòi hỏi một quá trình sinh tổng hợp phức tạp, đặc biệt còn vì các phản ứng tổng hợp diễn ra ở cả bên trong và bên ngoài màng tế bào. Tổng hợp peptidoglycan là một quá trình nhiều bước và đã được nghiên cứu chi tiết ở vi khuNn gram dương Staphylococcus aureus. Ở đây có sự tham gia của hai chất mang là uridine diphosphate (UDP) và bactoprenol (Hình 18.27). Bactoprenol là một alcohol 55 carbon gắn vào N AM bởi một nhóm pyrophosphate và vận chuyển các thành phần

của peptidoglycan qua màng kỵ nước.

CH3

CH3

CH3 O O

CH3 C

CH CH2 (CH2 C CH CH2)

CH2 C

CH CH2 O P O O-

P NAM O-

Hình 18.27: Bactoprenol pyrophosphate. Chú ý: Chất này được gắn vào NAM. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Tổng hợp peptidoglycan (Hình 18.28 và 18.29) diễn ra qua 8 bước:

1.Các dẫn xuất UDP của acid N .Acetylmuramic và N -Acetylglucosamine

được tổng hợp trong tế bào chất.

2. Các amino acid lần lượt được thêm vào UDP-N AM tạo thành chuỗi pentapeptide (2 D-alanine tận cùng được thêm vào ở dạng dipeptide). N ăng lượng của ATP được dùng để sản ra các liên kết peptide nhưng không có sự tham gia của tRN A và riboxom.

3.

HHình 18.28: Tổng hợp peptidoglycan. Chú ý: pentapeptide chứa L-lysine ở peptidoglycan của S. aureus và acid diamineopimelic (DAP) ở peptidoglycan của E. coli. Tác dụng kìm hãm của bacidraxin, xicloserine và vancomixin được chỉ rõ. Các con số tương ứng với

6 trong 8 bước nói trong bài. Bước 8 được mô tả ở hình 18. 29. (Theo: Prescott và cs, 2005)

4.N AM-pentapeptide được chuyển từ UDP sang phosphate của bactoprenol

ở bề mặt của màng.

5. UDP-N AG bổ sung N AG vào N AM-pentapeptide tạo thành đơn vị lặp lại của peptidoglycan. N ếu một cầu nối pentaglycine là cần thiết các glycine sẽ được

thêm vào bằng cách sử dụng các phân tử glycyl-tRN A đặc biệt nhưng không cần riboxom.

6.Sau khi đã hoàn thành đơn vị lặp lại của peptidoglycan N AM-N AG được chuyển qua màng đến bề mặt bên ngoài nhờ chất mang bactoprenol pyrophosphate. Đơn vị peptidoglycan được gắn vào đầu đang sinh trưởng của một chuỗi peptidoglycan kéo dài chuỗi một đơn vị lặp lại.

7.Chất mang bactoprenol trở lại bên trong màng. Trong quá trình này một phosphate được tách ra để cho bactoprenol phosphate giờ lại có thể nhận một N AM-pentapeptide khác.

8. Cuối cùng, các liên kết peptide chéo giữa các chuỗi peptidoglycan được tạo thành nhờ phản ứng chuyển peptide (Hình 18.29). Ở E. coli nhóm amineo tự do của acid diamineopimelic liên kết với D-alanine gần tận cùng tách ra nhánh D- alanine tận cùng. ATP được dùng để tạo thành liên kết peptide tận cùng bên trong màng. Khi sự chuyển peptide diễn ra bên ngoài năng lượng của ATP là không cần nữa. Quá trình như vậy cũng được thực hiện khi có sự tham gia của một cầu nối; chỉ nhóm phản ứng với D-alanine gần tận cùng là khác.

Hình 18.29: Chuyển peptide

Các phản ứng chuyển peptide trong việc tạo thành peptidoglycan ở E. coli và S. aureus. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Tổng hợp peptidoglycan rất mẫn cảm với các tác nhân kháng khuNn. Sự kìm hãm bất kỳ bước nào trong tổng hợp đều làm cho thành tế bào bị yếu đi và có thể dẫn đến phá vỡ tế bào do thNm thấu. N hiều chất kháng sinh ảnh hưởng đến tổng hợp peptidoglycan. Chẳng hạn, penixilin kìm hãm phản ứng chuyển peptide (Hình

18.29) và bacitraxin ức chế việc loại phosphate khỏi bactoprenol pyrophosphate.

18.10. CÁC KIỂU TỔNG HỢP THÀNH TẾ BÀO

Để sinh trưởng và phân chia được thuận lợi tế bào vi khuNn phải bổ sung peptidoglycan mới vào thành tế bào của mình một cách chính xác và có điều hoà cNn thận trong khi vẫn duy trì được hình dạng và tính nguyên vẹn của thành nếu phải tồn tại ở điều kiện áp suất thNm thấu cao. Vì peptidoglycan của thành là một mạng lưới khổng lồ duy nhất nên vi khuNn đang sinh trưởng phải có khả năng phân giải lưới sao cho đủ để cung cấp các đầu nhận dùng lắp vào các đơn vị peptidoglycan mới. Sự phân giải peptidoglycan hạn chế này được xúc tác bởi enzyme gọi là autolyzin, trong đó một số autolyzin tác dụng lên các chuỗi polisaccaride, số khác thuỷ phân các liên kết chéo peptide. Các chất kìm hãm autolyzin điều hoà chặt chẽ hoạt tính của các enzyme này.

Mặc dù vị trí và sự phân bố của hoạt tính tổng hợp thành tế bào thay đổi tuỳ

theo loài nhưng có lẽ tồn tại hai kiểu phổ biến (Hình 18.30) sau đây.

Vùng vách ngăn

Trong hình là các kiểu tổng hợp thành tế bào ở các vi khuẩn đang sinh trưởng và phân chia (a) Các streptococci và một số cocci khác gram dương. (b) Tổng hợp ở các vi khuẩn hình que (E. coli, Salmonella, Bacillus). (Theo: Prescott và cs, 2005)

N hiều cầu khuNn Gram dương (Enterococcus faecalis và Streptococcus) chỉ có một tới một vài vùng sinh trưởng. Vùng sinh trưởng chính thường ở vị trí tạo thành vách ngang và các nửa tế bào mới được tổng hợp giáp lưng nhau. Kiểu tổng hợp thứ hai gặp ở các trực khuNn E. coli, Salmonella và Bacillus. Tổng hợp peptidoglycan mạnh mẽ diễn ra ở vị trí tạo thành vách ngăn ngang như trên nhưng các vị trí sinh trưởng cũng nằm rải rác dọc theo phần hình trụ của trực khuNn. Do đó sinh trưởng được phân bố ở trực khuNn tràn lan hơn ở cầu khuNn. Việc tổng hợp phải kéo dài các tế bào hình que cũng như phân cắt chúng. Có lẽ điều này giải thích cho những sự khác nhau trong kiểu sinh trưởng của thành.