Un año después de lo acontecido en la primera entrega, Miles Morales como Dark Spider ha dominado sus habilidades y se ha establecido como el vigilante de Nashville en la lucha contra el crimen, aunque todavía lucha por adaptarse a su nuevo papel, continuando la búsqueda de las demás arañas mutadas como de la identidad del comprador del Merodeador, sin éxito. Mientras escolta a un convoy de la policía que lleva prisioneros a la prisión estatal, Shocker escapa liderando a otros reos, causando estragos en la ciudad. Dark detiene a los fugitivos, y a continuación lucha con Shocker en un banco, que, pese a las dificultades, logra derrotar al sabotear sus guantes con su explosión de veneno cuando la telaraña normal no funciona.

Mientras investiga un robo en Living Plaza, Dark se enfrenta a un misterioso hombre volador armado que se hace llamar el Escarabajo, que parece tener una venganza personal contra la empresa. Al regresar a casa para celebrar la Navidad con su madre, Rio, su mejor amigo, Ganke Lee, y su novia Emma Schmidt, Miles se sorprende al saber que su madre también invitó a Cindy Moon, vieja amiga de Miles con quien no ha hablado en más de un año. En privado con Emma, ambos se plantean empezar a vivir juntos, pero Miles no se siente seguro de dejar a su madre sola, pese a que previamente le dijo que quería que buscara su propia vida. Cerca, Macandale ah empezado a espiar a la familia Morales con micrófonos.

Más tarde, Miles asiste a uno de los mítines de campaña de Rio para ser alcaldesa de la ciudad, pero es testigo del ataque subterráneo de unos guardias de Living Foundation, empezando a perforar el suelo, tratando Dark de detener el conflicto antes de que se intensifique, presentándose una nueva habilidad; la de dividirse en múltiples copias suyas. Pronto descubre que los guardias están buscando una fuente de energía que parece venir de otro mundo. Mientras tanto, Emma empieza a sentirse mal, siendo trasladada a un hospital, descubriendo pronto que también tiene habilidades de araña, suponiendo Miles y Ganke que otra de las arañas radiactivas pico a Emma.

En una conferencia de prensa, el líder de Living Foundation y filántropo, Cartlon Drake, se disculpa con Rio diciendo que todo se trato de un mal entendido, pero Miles en privado no le cree, empezando a sospechar junto a sus amigos que algo más se oculta detrás de su faceta de filántropo. En su oficina, Drake decide que es hora de emplear fuerza bruta para descubrir el resto de energía, haciendo una llamada tras sostener dulcemente el retrato de una mujer diciendo que su visión pronto estará completa. En el gimnasio abandonado, Miles empieza a enseñarle a Emma a controlar sus nuevas habilidades de araña, a la vez que trata de entender mejor su nueva habilidad de dividirse, pero esta no está segura de querer tenerlas al no poder comprenderlas del todo, causándole algunos problemas en su vida.

Terminadas las vacaciones, Miles y amigos inician la universidad. En su primera clase de ciencias, Miles conoce a uno de sus ídolos, el profesor Miles Warren, investigador de genética y biología. También conoce a su nuevo rival de inteligencia, Hobbie Brown, un no muy sociable experto en informática con un violento padre alcohólico, y tiene su primer incomodo encuentro con Macendale, que sigue buscando información acerca del trepa muros de Nashville. El mismo día por la tarde, una extraña criatura que se hace llamar Scream ataca un centro comercial, como si estuviera buscando algo. Interceptándola Dark, tiene problemas en vencerla al no afectarle su explosión de veneno. Aun así, Scream huye tras escarbar bajo una tienda, llevándose algo consigo.

Investigando el grupo lo ocurrido, se descubre que Scream, al enterarse Miles y compañía del incidente del simbionte de Spider-Man 3, es otro miembro de dicha especie, aun no sabiendo como llego a la tierra, sospechando que Drake quizá podría estar detrás. En su oficina, Scream le entrega a Drake la extraña roca que extrajo, rebelándose como otros simbiontes de tono rosado y marronesco, que inmediatamente tras un experimento, el primero posee a una adicta olvidada extraída de un centro de rehabilitación. Deseando Emma entrar en combate para probar sus nuevas habilidades a las que ya está más acostumbrada, Miles le niega la posibilidad por temor a su seguridad. En las afueras de Nashville, el Escarabajo ataca a camiones transportadores de Living Foundation, exclamando que su jefe al fin capte el mensaje que quiere dar.

Al día siguiente, en su hogar, Hobbie como siempre tiene problemas con su padre al tratar de arreglar su barato celular, terminando por asesinarlo con un guante que dispara energía. En el gimnasio, Miles poco a poco comprende más su nueva habilidad de dividirse en copias iguales, intentando Emma tras terminar de dominar su única habilidad de hacerse invisible, hablar del por qué se lleva mal con Cindy, solo respondiendo que las cosas cambian simplemente. Más tarde, Dark tiene su segundo encuentro con el Escarabajo ahora en los aires tras atacar un almacén de LF, usando sus copias para confundirlo, pero aun así escapa nuevamente pese a lo dañada de su armadura. Deseando saber más del por que la enemistad de su novio con su examiga, Emma, usando sus poderes secretamente se dirige al hogar de Cindy, rebelando que se comportó como una egoísta con Miles tras volverse popular en la escuela antes de dejar el país. Pese a intentar hacer hablar a ambos, tanto Miles como Cindy se niegan a dialogar, el primero por resentimiento y la segunda por vergüenza.

Viendo la seria amenaza que representa el trepamuros de Nashville para sus planes, Drake ordena a sus nuevos mercenarios con simbionte que se deshagan de él. Sabiendo que el Escarabajo quiere vengarse por razones aun no aclaradas de Drake, Miles propone que se infiltren en la Living Foundation para descubrir exactamente que sucede, aunque para Ganke tomara tiempo por su gran sistema de seguridad. Sin embargo, y para su horrorosa sorpresa, los simbiontes de la LF han logrado encontrar el punto de encuentro del grupo, aunque no logran descubrir la identidad de Dark Spider al ocultarse Miles y amigos. Combatiendo ya cambiado a los simbiontes, Dark es superado hasta que Emma con un disfraz propio que Ganke le hizo en secreto interviene, haciéndose llamar Ghost Spider.

Con el gimnasio destruido, el grupo antes de tiempo se infiltra en la sede de Living Foundation. Tras lograr Ganke desactivar la enorme seguridad del edificio, Dark y Ghost se mueven por el lugar combatiendo a los guardias como por segunda y última vez a Agony, la cual accidentalmente se electrocuta hasta la muerte pese a que el dúo arácnido intenta salvarla al negarse a abandonar su simbionte. Finalmente, cara a cara con Drake, rebela que usa a los simbiontes como arma tras haber notado las grandes capacidades de Venom años atrás, como que los mandaba a obtener más en ubicaciones específicas, habiendo querido crear un ejército de ellos para mejorar la raza humana tras que su madre muriera de cáncer. Pese a que Dark trata de convencerlo que eso es imposible por nadie poder controlar a los simbiontes, Drake lo ignora, convirtiéndose en Phage, que inmediatamente los ataca.

Dark y Ghost escapan tras derrotar a Phage, siendo Drake asesinado por la inesperada aparición del Escarabajo, ahora rebelado como Hobbie, rebelando que su venganza contra Drake es por arruinarle la vida al comprar la empresa donde su padre trabajaba, enterándose también que modificó el reactor Nuform de la plaza para destruir Nashville, haciendo pasar todo como un Chernóbil para no dejar rastro de sus crímenes. Dark y Ghost en el escape luchan contra Riot, derrotándolo al quemarlo vivo en uno de reactores. Ganke trae a Miles y Emma heridos a casa, donde Rio descubre la identidad de su hijo y continúa apoyándolo pese al shock inicial. Una vez que se recupera, Dark intenta detener a el Escarabajo, acompañándolo nuevamente Ghost sin importar su estado. Sin embargo, son interceptados por Scream y Lasher. El dúo arácnido derrota a los últimos simbiontes al producir suficiente ruido, abandonando a sus portadores.

Mientras que Dark y Ghost luchan en las calles contra el Escarabajo, Cindy, inspirada por las palabras de Miles en la cena sobre que un poder debe ser manejado correctamente, ayuda a Rio a evacuar la ciudad, dándole a ambas arañas la oportunidad de detener el reactor Nuform antes de que se vuelva crítico. Incapaz de razonar con el Escarabajo, Dark y Ghost lucha contra Brown antes de intentar absorber Dark la energía de Nuform para negar la explosión. Sin embargo, hay demasiada energía y Dark no puede contenerla. Para salvar la ciudad, el Escarabajo parece sacrificarse llevándolo a una distancia segura para que pueda liberar la energía antes de que lo mate, solo para que el Escarabajo lo deje caer adrede a gran altura, no sin antes ser alcanzado por la explosión que acaba con su vida. Dark cae a gran altura, siendo salvado a punto de estrellarse contra el suelo por Ghost.

Cuatro semanas después, Life Foundation cierra, ocupando la policía todas sus sedes alrededor de Tennessee, arrestándose como interrogándose a todos sus empleados sin importar su rango. Los simbiontes sobrevivientes son congelados y resguardados en un área restringida. Miles finalmente se reconcilia con Cindy, hiendose a vivir con Emma al centro, despidiéndose de su madre que exclama que esta orgullosa de él, junto a su crecimiento y heroísmo, habiendo renunciado a ser alcaldesa. La historia acaba con Dark Spider y Ghost Spider balanceándose de noche por Nashville.

En una escena a mitad de los créditos, Rio recibe una inesperada visita, identificándose amablemente el hombre como Peter Parker, diciendo que esta buscando a su hijo.

En una escena post créditos, Macandale se reúne con su contratador en su laboratorio, siendo Miles Warren, afirmando que ya sabe la identidad de Dark Spider, respondiendo el profesor que ya es hora de concretar su llamada obra maestra, mostrándose como en un cuarto especial tiene encapsuladas a casi todas sus arañas.