Giám sát sự lưu hành virus cúm gia cầm ở Nam Định

I. Đặt vấn đề

  1.1. Khái niệm về bệnh:

Bệnh cúm gia cầm (Avian influenza) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính do virus cúm typ A họ Orthomyxovirideae gây ra. Đây là một virus gây bệnh dịch rất lớn, có tính chất khốc liệt trên gia cầm nói chung. Con vật bị bệnh thường sốt cao, có những biểu hiện bệnh lí ở hệ thống tiêu hóa, hô hấp, thần kinh và sinh sản.

Trước đây gọi là bệnh dịch tả gà (Fowlplague). Hội nghị quốc tế về cúm gia cầm ở Beltsville (Mĩ) năm 1981 đã thay đổi thành: Bệnh cúm truyền nhiễm cao ở gia cầm HPAI (Highly pathogenic avian influenza)

OIE xếp HPAI vào danh mục 1/15 bệnh nguy hiểm ở động vật.

Bệnh có từ lâu . Năm 1878, bệnh xảy ra ở Italia, đến năm 1955 Achafer mới xác định được virus đó là virus typ A (H7N1, H7N7).

Gần đây, năm 1997 bệnh xảy ra ở Hồng Kông do virus H5N1 gây ra. Tại đây lần đầu tiên người ta ghi nhận được virus cúm gia cầm có thể lây nhiễm và gây tử vong cho người.

  1.2. Bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam:

    Dịch cúm gia cầm (avian influenza) xảy ra trong những năm qua đã gây thiệt hại rất lớn cho nền kinh tế Việt Nam. Số lượng lớn gia cầm, thủy cầm chết và bị thiêu hủy làm cho người chăn nuôi điêu đứng. Số tiền nhà nước phải bỏ ra để tiêu hủy gia cầm, mua vắc xin, tiêm phòng, chi trả cho thú y viên, hỗ trợ cho người chăn nuôi… lên tới hàng nghìn tỉ đồng. Từ lần đầu tiên xuất hiện tại nước ta vào cuối  tháng 12/2003đến 15/12/2005 dịch đã được khống chế.Hậu quả 59,4 triệu gia cầm các loại mắc bệnh, chết và buộc phải tiêu hủy (gà 51,6%, vịt 24,5%, ngan 0,7%, cút 23,2%).

đến 15/12/2005 dịch đã được khống chế. Hậu quả 59,4 triệu gia cầm các loại mắc bệnh, chết và buộc phải tiêu hủy (gà 51,6%, vịt 24,5%, ngan 0,7%, cút 23,2%).

 Năm 2006, Việt Nam đã khống chế dịch cúm gia cầm thành công.

      Năm 2007, tái phát các ổ dịch cúm ở 33 tỉnh, thành phố (18 tỉnh miền Bắc, 10 tỉnh miền Nam, 5 tỉnh miền Trung). Tổng số gia cầm bệnh, chết và tiêu hủy là 236.582 con (gà 15,84%, vịt 81,69% và ngan 2,46%). Dịch chủ yếu tập trung vào 2 đợt chính sau:

·     Từ 06/12/2006 đến 01/2007: Dịch cúm gia cầm tái phát tại Cà Mau, Bạc Liêu, sau đó dịch xuất hiện ở 6 tỉnh thuộc đồng bằng sông Cửu Long và 3 tỉnh thuộc đồng bằng sông Hồng (Hà Nội, Hà Tây và Hải Dương). Dịch đã xảy ra ở 11 tỉnh thành phố. Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu hủy là 45.581 con (gà 30%, vịt 70%). Các ổ dịch chủ yếu xảy ra trên đàn vịt chăn nuôi nhỏ lẻ, dưới 3 tháng tuổi, ấp nở trái phép và chưa được tiêm phòng vacxin.

·     Từ 01/05/2007 đến hết tháng 07/2007: Dịch tái phát ở Nghệ An, sau đó tiếp tục được phát hiện ở 18 tỉnh khác. Ở Giang, Ninh Bình, Bắc Ninh, Vĩnh Phúc, Hà Nam, Hưng Yên, Thái Bình miền Bắc dịch thấy ở Nam Định, Sơn La, Hải Phòng, Quảng Ninh, Bắc, Phú Thọ, Cao Bằng và Điện Biên. Dịch xảy ra chủ yếu ở đàn thủy cầm dưới 2 tháng tuổi và chưa được tiêm phòng. Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu hủy là 191.001 con (gà 12,51%, vịt 84,53% và ngan 2,96%).

      Sau 2 đợt dịch trên, cúm gia cầm phát ra lẻ tẻ, rải rác, chủ yếu trên các đàn vịt con, không được tiêm phòng vacxin.

      Năm 2008, dịch cúm gia cầm đã xuất hiện ở 27 tỉnh, thành phố. Tổng số gia cầm chết bắt buộc phải tiêu hủy là 76.095 con (gà 38%, vịt 58,1%, ngan 3,9%). Dịch chỉ xuất hiện các điểm dịch ở những đàn quy mô từ 100-2000 con, không được tiêm phòng vacxin (44,59%), hoặc đàn thủy cầm mới tiêm phong 1 mũi (16,21%), ổ dịch trên thủy cầm chiếm 61,98%. Các ổ dịch xuất hiện thường được địa phương bao vây, xử lý ngay nên hầu như không có hiện tượng lây lan.

      Năm 2009, cả nước có 129 ổ dịch ở 18 tỉnh, thành phố. Ở miền Bắc có dịch cúm gia cầm là Bắc Ninh, Điện Biên, Quảng Ninh, Thái Nguyên, Hà Nội và Cao Bằng. Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu hủy là 112.847 con (gà 21,87%, vịt 75,35% và ngan 2,76%).

      Đầu năm 2010 tới 03/12/2010, dịch đã xảy ra ở 63 xã, phường của 37 huyện, quận thuộc 24 tỉnh, thành phố (Bắc Cạn, Bắc Ninh, Điện Biên, Hà Giang, Lạng Sơn, Nam Định, Thái Bình, Tuyên Quang, Thái Nguyên,…làm hơn 76 ngàn con gia cầm mắc bệnh, chết và buộc phải tiêu hủy, trong đó chủ yếu là vịt (chiếm 70%). Các ổ dịch chỉ xuất hiện lẻ tẻ, rải rác ở một vài hộ chăn nuôi, không lây lan thành dịch lớn và được các địa phương bao vây, dập tắt ngay [2].

Bảng 2.1. Tình hình dịch cúm gia cầm ở nước ta từ 2003-2010

Năm

Số  tỉnh 

có dịch

Số  gia cầm mắc bệnh, chết, tiêu hủy (con)

Tổng cộng

Số  gà

Số  vịt

Số  ngan

Số  chim cút

2003

57

29.706.902

13.073.849

389.22

13.171.680

56.341.651

2004

21

80.508

30.534

0

57.287

168.329

2005

44

874.786

1.455.952

0

579.832

2.910.570

2006

Khống chế  thành công dịch

2007

33

35.290

180.148

15.303

0

230.741

2008

27

28.928

44.202

2.965

0

76.095

2009

17

24.686

85.038

3.123

0

112.847

2010

23

21938

52.809

1.022

0

75.769

Tổng cộng

30.773.038

14.922.532

411.633

13.808.799

59.916.002

      Từ đầu năm 2011 tới thời  điểm 26/04/2011, xảy ra 12 ổ dịch trên phạm vi 10 tỉnh thành: Lạng Sơn, Nam Định, Kon Tum, Quảng Ninh, Hà Nam, Quảng Ngãi, Nghệ An, Hải Phòng, Bình Định, Quảng Trị. Tổng số gia cầm mẫn cảm là 22.395 con, tổng số con mắc bệnh là 11.608 con (tỷ lệ mắc bệnh là 51,83%), số con chết là 8.433 (tỷ lệ chết là 37,66%) [28]. Theo tình hình thông tin dịch cúm gia cầm của Cục thú y, ngày 12/05, cả nước không phát sinh thêm ổ dịch mới nhưng vẫn còn 3 tỉnh là Quảng Ngãi, Vĩnh Long và Lạng Sơn có ổ dịch cúm gia cầm chưa qua 21 ngày [24].

II. MỤC ĐÍCH

- Hiểu được sự nguy hại của việc mua bán gia cầm tập trung chưa được kiểm soát ở các chợ.

- Giám sát sự lưu hành virus cúm trong các loài gia cầm được trao đổi, mua bán ở các chợ trên địa bàn thành phố Nam Định.

III. NỘI DUNG, ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN, NGUYÊN LIỆU VÀ  PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

  -  Giám sát sự lưu hành virus cúm gia cầm tại Nam Định.

2.2. ĐỐI TƯỢNG ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

 - Đối tượng: gia cầm được mua bán, trao đổi.

 - Địa điểm: Tại các chợ ở Nam Định, Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương.

- Thời gian: Từ 01/6/2011- 01/11/2011.

2.3. NGUYÊN LIỆU TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM

     - Các nguyên liệu, hóa chất, dụng cụ, máy móc và thiết bị để tiến hành thí nghiệm là các cơ  sở vật chất kỹ thuật ở Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương.

  - Các mẫu vật phẩm được lấy từ gia cầm ở các chợ ở Nam Định.

2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Sử dụng kĩ thuật REALTIME RT- PCR

2.4..1. Quy trình xử lý mẫu bệnh phẩm

·     Bệnh phẩm là  não hoặc các phủ tạng được nghiền trong cối chày sứ vô trùng, pha thành huyễn dịch 1:10 với nước sinh lý (hoặc PBS pH 7,0 - 7,4) có kháng sinh (Penicillin 2.000UI/ml, Streptomycin 2mg/ml). Để ở tủ lạnh 40C trong 2 giờ. Ly tâm ở 1.000 vòng trong 15 phút, lấy nước trong ở trên để tiến hành các xét nghiệm.

·     Bệnh phẩm là dịch ngoáy (swab) hầu họng hoặc hậu môn chứa trong dung dịch bảo quản cần được ly tâm (như trên) để tách cặn, sử dụng phần nước trong để tiến hành các xét nghiệm.

      Bệnh phẩm sau khi xử lý được lưu ở nhiệt độ -200C đến -800C. 

2..4.2. Quy trình chiết tách RNA bằng kít Rneasy Mini Kit Qiagen (Sử dụng hệ thống hút chân không)

·     Chuẩn bị

·     Chuẩn bị mẫu như trong quy trình xử lý mẫu.

·     Bổ sung lượng 1/100 β-Mercaptoethanol (β-ME) vào dung môi RLT.  Chia dung môi sẵn vào các ống 1,5 ml, lượng 600 µl/ống. Dung môi này có thể bảo quản 1 tháng ở nhiệt độ phòng.

·     Tiến hành tách chiết

·     Lắc đều (Vortex) mẫu trong 5 giây và ly tâm nhanh (spin down).

·     Lấy 600 µl dung dịch RLT vào ống 1,5 ml.

·     Chuyển 200 µl mẫu sang ống 1,5 ml đã có sẵn 600 µl RLT.

·     Lắc đều trong 15 giây và ly tâm nhanh . 

·     Cho 400µl cồn Ethanol 100% (cồn tuyệt đối).

·     Lắc đều 15 giây và ly tâm 1 phút ở 10.000 vòng/phút (rpm) nhiệt độ phòng.

·     Đặt ống cột lọc (spin column) vào hệ thống hút chân không.

·     Chuyển tất cả dung dịch mẫu sang cột lọc và bật máy hút.

·     Rửa lần 1

Cho 700µl dung môi RW1 vào cột lọc và bật máy hút.

·     Rửa lần 2

·     Cho 500µl dung môi RPE vào cột lọc và bật máy hút.

·     Cho tiếp 500µl dung môi RPE vào cột lọc và bật máy hút.

·     Đặt cột lọc vào ống thu mới (collection tube).

·     Ly tâm cột lọc trong 2 phút ở .12000 rpm.

      Nếu không có hệ thống hút chân không, các bước dùng máy hút được thay thế bằng cách ly tâm cả  cột lọc và ống thu ở tốc độ 10000 vòng/phút trong 1 phút.

·     Thu hoạch ARN

·     Chuyển cột lọc sang ống 1,5ml mới.

·     Cho 50ml nước (RNase-free H2O) vào cột lọc, đợt 1 phút.

·     Ly tâm 1 phút ở tốc độ >10,000 rpm. 

·     Chuyển mẫu RNA đã thu sang ống 1.5ml mới.

·     Cất mẫu ARN

      Cất mẫu RNA ở 40C trong ngày nếu chạy phản ứng PCR ngay và cất ở nhiệt độ -200C để lưu mẫu trong thời gian dài.

2..4.3. Quy trình xét nghiệm virut cúm gia cầm H5N1 bằng phương pháp Realtime RT-PCR

·     Máy móc và  nguyên liệu

      Hệ  thống chiết tách RNA

      Máy Realtime PCR

      Bộ  Micropipet các cỡ

      Kít chiết tách RNA (qiagen hoặc ambion magmax)

      Kit RT-PCR: Qiagen One-step RT-PCR Kit (Cat No.210210) hoặc Invitrogen superscript III qRT-PCR kit (Cat No.12574-026)

      Primer và probe (xem phụ lục)

·     Tiến hành

·     Chiết tách RNA: như quy trình chiết tách ARN ở trên

·     Chuẩn bị Master mix (hỗn hợp nhân gen):

      Có  thể dùng 1 trong 2 bộ kit nhân gen, với lượng cụ  thể cho một phản ứng như dưới đây:

Qiagen one-step RT-PCR kit

Invitrogen SS3 qRT-PCR kit

Reagent

Lượng (µl)

Reagent

Lượng (µl)

DW

10.5

DW

4.5

5x Reaction Mix

5.0

2x Reaction buffer

12.5

MgCl2 (25mM)

1.2

MgCl2 (50mM)

1.0

dNTP

0.8

PPP

1.5

PPP

1.5

Enzyme mix

1.0

Enzyme mix

0.5

·     Cho 20 µl master mix vào ống PCR.

·     Cho 5 µl mẫu RNA vào ống PCR.

·     Đặt ống PCR vào máy real-time PCR.

·     Chạy chương trình Real-time RT-PCR phát hiện gen của virut Cúm gia cầm đã cài đặt sẵn trên máy tính. Chu trình nhiệt cụ thể như bảng dưới đây:

Qiagen one-step RT-PCR Kit

Invitrogen superscript 3 qRT-PCR Kit

RT

PCR

RT

PCR

500C-30m 950C-15m

40 x (950C-10s + 580C-50s)

500C-15m 950C-2m

40 x (950C-10s + 580C-50s)

·     Đọc kết quả

Xét nghiệm  được công nhận khi:

      Đối chứng dương tính cho giá trị chu kỳ Ct (threshold cycle) hoặc ngưỡng đã biết (±2). Đối chứng âm tính không có Ct.

      - Mẫu được coi là dương tính khi có Ct £ 35.

      - Mẫu được coi là âm tính nếu không có Ct.

      - Mẫu được coi là nghi ngờ nếu Ct >35. Mẫu nghi ngờ có thể được nhân lên trên phôi trứng hoặc trên tế bào xơ phôi gà (CEF – Chicken Embrio Fibroblast) rồi xét nghiệm lại để có kết quả chính xác.

      2.5. XỬ LÝ SỐ LIỆU

      Các số liệu được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học trên chương trình Microsoft Excel.

      Mẫu huyết thanh có HGKT ≥ 4 log2 được coi là đạt mức bảo hộ.

      Công thức tính tỷ lệ bảo hộ cá thể/tổng đàn:

      Một  đàn nếu có TLBH ≥ 70% thì được coi là đàn được bảo hộ.

IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

4.1. Kết luận:

4.2 Đề xuất:

  - Các cơ quan chức năng tại địa phương, chi cục thú y nên tiến hành kiểm tra, kiểm soát chặt chẽ sự lưu thông gia cầm, thủy cầm tại các chơ trên đia bàn mình quản lí.