CHƯƠNG II : ENZYM

2.1.Cấu tạo hóa học phân tử enzyme

2.1.1. Cấu trúc phân tử enzyme

       Enzym là những hợp chất hữu cơ có phân tử lượng lớn từ 20 000 đến 1 000 000 ( có kích thước nhỏ nhất là Ribonucleaza 12 700 dalton). Do có kích thước lớn nên cũng như protein, enzyme không đi qua các màng bán thấm.

       Enzym có thể hòa tan trong nước, trong dung dịch muối loãng, trong các dung môi hữu cơ có cực, nhưng không hòa tan trong các dung môi không phân cực.

       Enzym không bền đối với tác dụng của nhiệt độ. Dưới tác dụng của nhiệt độ cao,enzim bị biến tính và mất khả năng xúc tác, mức độ giảm hoạt tính của enzyme tương ứng với mức độ biến tính của protein enzim. Enzim cũng bị mất khả năng hoạt động dưới tác dụng của các tác nhân gây biến tính protein khác axit hay kiềm mạnh hoặc muối kim loại nặng.

       Enzym cũng có tính lưỡng tính, nghĩa là trong điều kiện điện ly của môi trường có thể tồn tại ở dạng anion, cation hoặc dạng trung hòa điện.

       Enzym được cấu tạo từ các L – a – axitamin kết hợp với nhau qua liên kết peptit. Dưới tác dụng của các peptit hyđrolaza, axit, hoặc kiềm các enzim bị thủy phân hòan toàn tạo thành các L – a – axitamin, trong nhiều trường hợp ngoài axitamin còn nhận được các chất khác. Trong trường hợp thứ nhất enzim là protein phức tạp gọi là enzim hai cấu tử.Trong phân tử enzim hai cấu tử phần protein có tên gọi là ‘feron’ hoặc ‘apoenzim’được kết hợp với một phần không phải protein gọi là nhóm ngoại ‘agon’. Khi nhóm ngoại tách khỏi phần ‘apoenzim’ và có thể tồn tại độc lập, thì những agon đó còn có tên riêng là coenzim.

       Apoenzim thường quyết định tính đặc hiệu cao của enzim và làm tăng hoạt tính xúc tác của coenzim

       Nhiều enzim hai cấu tử cũng như một cấu tử, trong phân tử còn có chứa cả kim loại.

       Đa số enzim thuộc loại enzim hai cấu tử. Phần lớn phân tử các enzim có phân tử lượng cao thường chứa nhiều phần dưới đơn vị.

2.1.2 Cấu trúc trung tâm hoạt động của enzim  

       Trong quá trình xúc tác, chỉ một phần rất nhỏ của phân tử enzim tham gia kết hợp đặc hiệu với cơ chất, phần đó gọi là trung tâm hoạt động của enzim.

       Các enzim một cấu tử, trung tâm hoạt động thường bao gồm một tổ hợp các nhóm định chức của axitamin không tham gia tạo thành trục chính của sợi polypeptit.

       Các nhóm này có thể ở xa nhau trong mạch polypeptit nhưng lại gần nhau trong không gian cách nhau những khoảng cách nhất định sao cho chúng có thể tương tác với nhau trong quá trình xúc tác.

       Trung tâm hoạt động của các enzim hai cấu tử thường bao gồm nhóm ngoại và các nhóm định chức của axitamin ở phần apoenzim.

       Trong các nhóm chức tham gia vào trung tâm hoạt động của enzim thường phân biệt các nhóm của ‘tâm xúc tác’ tham gia trực tiếp vào hoạt động xúc tác của enzim và các nhóm của ‘miền tiếp xúc’ làm nhiệm vụ kết hợp đặc hiệu enzim với cơ chất để tạo thành phức hợp enzim – cơ chất.

       Trung tâm hoạt động có cấu hình không gian rất tương ứng với cấu trúc của cơ chất và thường được hình thành trong quá trình enzim tiếp xúc với cơ chất.

       Giữa cơ chất và trung tâm hoạt động tạo thành nhiều tương tác yếu, do đó có thể dễ dàng bị cắt đứt trong quá trình phản ứng để giải phóng enzim và các sản phẩm phản ứng.

       Enzym alosteric (enzim dị lập thể, enzim điều hòa) trong phân tử của chúng ngoài trung tâm hoạt động còn có một số vị trí khác có thể tương tác với các chất khác gọi là ‘trung tâm alosteric’các chất kết hợp vào các trung tâm này gọi là ‘các chất điều hòa alosteric’. Khi các chất này kết hợp lại với enzim làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzim, của trung tâm hoạt động, do đó làm thay đổi hoạt độ xúc tác của enzim. Nếu làm thay hoạt độ đó gọi là chất điều hòa dương, nếu làm giảm hoạt độ gọi là chất điều hòa âm.

2.2. Tính chất của enzim

2.2.1 Cường lực xúc tác

       Enzim là chất xúc tác sinh học, nó có đầy đủ các tính chất của một chất xúc tác. Tuy nhiên enzim có cường lực xúc tác mạnh hơn nhiều so với xúc tác thông thường.

Ví dụ: 1g pepxin trong 2h thủy phân 5kg protein trứng luộc ở nhiệt độ bình thường.

2.2.2. Tính đặc hiệu

       Tính đặc hiệu cao của enzim là một trong những khác biệt chủ yếu giữa enzim với các chất xúc tác khác. Mỗi enzim chỉ có khả năng xúc tác cho sự chuyển háo một hay một số chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định.Sự tác dụng có tính lựa chọn cao này gọi là tính đặc hiệu hoặc chuyên môn hóa của enzim.

2.2.2.1.Đặc hiệu kiểu phản ứng

       Đặc hiệu này thể hiện ở chỗ mỗi enzim chỉ có thể xúc tác cho một trong các kiểu phản ứng chuyển hóa một chất nhất định.

2.2.2.2 Đặc hiệu cơ chất : Cơ chất là chất có khả năng kết hợp vào trung tâm hoạt động của enzim và bị chuyển hóa dưới tác dụng của enzim

    a) Đặc hiệu tuyệt đối

       Enzim chỉ tác dụng trên một cơ chất nhất định và hầu như không có tác dụng với chất nào khác.Ví dụ, ureaza hầu như chỉ tác dụng với ure, thủy phân nó thành khí cacbonic và amoniac:

          H2N – CO – NH2 + H2O à CO2 + 2NH3

       Các enzim khác nhau arginaza, glucooxydaza cũng thuộc loại có tính đặc hiệu tuyệt đối, vì arginaza chỉ xúc tác thủy phân L – arginin tạo thành L – ornitin và ure

    b) Đặc hiệu tương đối

    Enzim có khả năng tác dụng lên một kiểu liên kết hóa học nhất định trong phân tử cơ chất mà không phụ thuộc vào cấu tạo của các phần tham gia tạo thành mối liên kết đó.

    c) Đặc hiệu nhóm

     Enzim có khả năng tác dụng lên một kiểu kết hóa học nhất định với điều kiện một trong hai phần tham gia tạo thành liên kết phải có cấu tạo xác định.

    d) Đặc hiệu quang học (đặc hiệu lập thể)

     Enzim chỉ tác dụng với một trong hai dạng đồng phân quang học của các chất

Ví dụ, phản ứng khử nước của axit malic để tạo thành axit fumaric dưới tác dụng của fumarathydrataza chỉ xảy ra đối với axit L – malic mà không tác dụng lên axit D – malic

    Enzim cũng thể hiện tính đặc hiệu lên một dạng đồng phân hình học cis hoặc trans

Ví dụ, fumarathydrataza chỉ tác dụng lên dạng trans của axit fumaric mà không tác dụng lên dạng cis

    Trong tự nhiên cũng có các enzim xúc tác cho các phản ứng chuyển hóa tương hỗ giữa các cặp đồng phân không gian tương ứng.

    Enzim còn có khả năng phân biệt được hai gốc đối xứng trong phân tử giống nhau hòan toàn về mặt hóa học.

Ví dụ, hai nhóm CH2OH trong phân tử glixerin, glixerophosphatkinaza xúc tác cho phản ứng chuyển vị gốc phosphate từ ATP đến C3 của glixerin (chứ không phải C1)

2.3.Cơ chế tác dụng của enzim

    - Quá trình tạo thành phức enzim – cơ chất (ES) và biến đổi phức này thành sản phẩm, giải phóng enzim tự do thường trải qua ba giai đoạn như:

                               E + S à ES à P + E

    - Giai đoạn thứ nhất : enzim kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành phức enzim – cơ chất (ES) không bền, phản ứng này xảy ra rất nhanh và đòi hỏi năng lượng hoạt hóa thấp.

    - Giai đoạn thứ hai : xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn tới sự kéo căng và phá vỡ các liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng.

    - Giai đoạn thứ ba : tạo thành sản phẩm, còn enzim được giải phóng ra dưới dạng tự do.

    - Có thể lấy phản ứng thủy phân cơ chất A – B dưới tác dụng của enzim làm ví dụ :

                   AB + H2O à AOH + BH

  Khi hợp chất AB kết hợp với enzim thì liên kết A – B bị kéo căng, kèm theo sự chuyển dịch electron dẫn đến làm đứt liên kết A – B và gắn nhóm HO- của nước vào phần A còn H+ của nước vào phần B của phân tử.Sau khi hoàn thành phản ứng, enzim được giải phóng dưới dạng tự do.

2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzim

2.4.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzim

    -  Trong điều kiện thừa cơ chất, vận tốc phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzim.

                                        v = k [E]

     v – vận tốc phản ứng

    [E] – nồng độ enzim

Cũng có trường hợp khi nồng độ enzim quá lớn, vận tốc phản ứng tăng chậm

2.4.2 Nồng độ cơ chất

       Năm 1913 Leonon Michaelis và Maud Menten đã đưa ra mô hình để giải thk tính chất động học của phản ứng enzim và đã lập được phương trình biểu diễn mối quan hệ giữa vận tốc phản ứng với nồng độ cơ chất enzim của enzim.

       Đặc điểm quan trọng nhất của mô hình này : mở đầu phản ứng cần thiết phải tạo thành phức trung gian enzim – cơ chất (ES). Sau đó phức ES chuyển hóa tiếp tạo thành sản phẩm cuối cùng của phản ứng và enzim tự do,enzim lại kết hợp với phân tử cơ chất khác bắt đầu vòng xúc tác mới.

       Trường hợp đơn giản nhất, phản ứng chỉ có một cơ chất S,enzim (E) xúc tác cho sự chuyển hóa nó chỉ taọ thành một sản phẩm P, phản ứng xảy ra như sau :

                                     k1         k2

                          E + S ---> ES ---> P + E

                                    k -1        k ­-2

       k1,k -1, k2,k -2 hằng số vận tốc của các phản ứng tương ứng.

       Qua sơ đồ trên ta thấy , phản ứng chuyển hóa phức ES à P + E là phản ứng quyết định quá trình xúc tác chuyển hóa S à P của enzim. Vận tốc của phản ứng này sẽ tỉ lệ với nồng độ ES, nồng độ ES càng cao thì vận tốc càng lớn

                                              v = k2 [ ES ]

       Khi nghiên cứu động học phản ứng enzim, ngta xác định vận tốc ban đầu của phản ứng khi :

-         nồng độ cơ chất [ S ] rất lớn so với nồng độ tổng của enzim [ E0]

-         lượng sản phẩm [P ] tạo thành chưa đáng kể, nên k -2 [E] [P] ~ 0

       Trong những điều kiện ấy, phản ứng sẽ diễn ra :

                           k1         k2

               E + S ----> ES ----> E + P

                          k­ -1

       Vì [S] rất lớn so với [E0], lượng S nằm ở trong phức có thể coi là không đáng kể, nên nồng độ co chất ban đầu cũng được xem là nồng độ cơ chất lúc phản ứng đạt đến trạng thái dừng. [ES] khi đó gần như không đổi và vận tốc ban đầu v1 = k2[ES] cũng gần như không đổi , từ đây ta có :

                 d[ES]

                --------- = k1[E][S] – (k -1 + k2) [ES] = 0

                  dt

                               [E][S]     k -1 + k2

                              -------- = ------------ = Km

                                 [ES]        k1 

       Vì S chưa được chuyển hóa thành P nên

                            [E] [S]        k -1

                           ---------- = ----- = Kp

                             [ES]          k1  

       Kp – hằng số phân ly của phức enzim- cơ chất

       Và k2 là không đáng kể so với k1 nên : Km ~ Kp. Ngta nói Km là hằng số phân ly biểu kiến của phức enzim- cơ chất. Km cho biết một cách gần đúng ái lực của enzim đối với cơ chất : Km càng nhỏ thì ái lực của enzim đối với cơ chất càng lớn và ngược lại.

       Khi ở trạng thái dừng ta có :

                       [E0] = [E] + [ES] = [ES] Km/[S] + [ES]

                               [E0] = [ES] (1 + Km / [S])

       Khi [S] >> [E0] tất cả enzim đều tham gia tạo phức ES và vận tốc phản ứng vi sẽ đạt cực đại (vmax)

                                            vmax = k2 [E0]  

       Có thể viết :

                                  Vi      [ES]       1

                                 ---- = ------ = -----

                               Vmax   [E]0     1 + Km / [S]

                                                  Vmax[S]

                                          Vi = -------------                                  (*)

                                                    Km + [S]  

       Đây là phương trình Michaelis – Menten đã được Holden và Briggx hoàn thiện. Km được gọi là hằng số Michaelis. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nồng độ cơ chất đến vận tốc phản ứng (theo pt (*)) trong đó v là hàm số của [S] có dạng của nhánh hipecpol vuông góc.

      Theo pt (*) ta có thể xét đến ba trường hợp:

-         Nếu [S] << Km

                                     [S]

                   V= Vmax -----  

                                     Km 

    Như vậy ở nồng độ cơ chất thấp v phụ thuộc tuyến tính vào [S]

    -  Nếu [S] >> Km, v = vmax vận tốc phản ứng đạt cực đại, không phụ thuộc vào [S]. Như vậy [S] đã đủ lớn đến mức nào đó, nếu tiếp tục tăng [S], v cũng sẽ không tăng theo

    - Nếu [S] = Km , v = vmax /2 , vận tốc phản ứng bằng một nửa vận tốc cực đại. Như vậy Km bằng nồng độ cơ chất mà ở đó vận tốc ban đầu của phản ứng bằng một nửa vận tốc cực đại.

Ảnh hưởng của chất kìm hãm

       Hoạt độ của enzim có thể bị thay đổi dưới tác dụng của một số chất có bản chất hóa học khác nhau. Các chất làm giảm hoạt độ enzim nhưng không bị chuyển hóa bởi enzim được gọi là các chất kìm hãm hoặc các chất ức chế, kí hiệu I

       Các chất này có thể là những ion, các phân tử vô cơ ,hữu cơ kể cả protein.

       Các chất này có thể kìm hãm thuận nghịch hoặc không thuận nghịch enzim. Nếu là kiểu kìm hãm thuận nghịch, phản ứng kết hợp giữa enzim và chất kìm hãm (I) nhanh chóng đạt đến cân bằng

                                            k1

                                  E + I -----> EI

                                             k -1

2.4.4 Các chất hoạt hóa

       Chất hoạt hóa làm tăng hoạt độ xúc tác của enzim, thường có bản chất hóa học khác nhau, có thể là các anion, các ion kim loại.

2.4.5 Nhiệt độ

       Vận tốc phản ứng do enzim xúc tác chỉ tăng theo nhiệt độ trong một giới hạn xác định mà ở đó phân tử enzim vẫn còn bền chưa bị biến tính.Đại lượng đặc trưng cho ảnh hưởng nhiệt độ đến vận tốc phản ứng hóa học cũng như phản ứng enzim là hệ số nhiệt Q10

       Đường biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến vận tốc phản ứng của nhiều enzim.Nhiệt độ ứng với hoạt độ enzim cao nhất gọi là nhiệt độ tối ưu của enzim. Nhiệt độ tối ưu của một enzim ko cố định mà có thể thay đổi tùy cơ chất,pH môi trường, thời gian phản ứng ….Nhiệt độ mà enzim bị mất hoàn toàn hoạt tính xúc tác gọi là nhiệt độ tới hạn.Ở nhiệt độ tới hạn enzim bị biến tính, ít khi có khả năng hồi phục lại được hoạt độ.Ở nhiệt độ 00C, hoạt độ enzim tuy bị giảm nhưng lại có thể tăng lên khi đưa về nhiệt độ bình thường.

2.4.6 pH môi trường

       pH môi trường ảnh hưởng rõ rệt đến phản ứng enzim vì nó ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzim và ảnh hưởng đến độ bền của enzim, độ bền của enzim có thể tăng lên khi  có cơ chất, coenzim, Ca2+….

       pH tối ưư của một enzim cũng không cố định mà phụ thuộc nhiều vào nhiều yếu tố khác như cơ chất, tính chất dung dịch đệm, nhiệt độ….

       Ngoài cá yếu tố chính đã nêu trên, hoạt độ enzim còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác như ánh sáng (đặc biệt là tia tử ngọai),sóng siêu âm, tia bức xạ….