ỨNG DỤNG VÀ MÔI TRƯỜNG vi sinh, năm 1996 tháng chín, p. 3439-3445 Vol. 62, số 9
0099-2240/96 / $ 04.0010
Copyright q 1996, American Hiệp hội Vi sinh vật
Phát sinh học phân tử và phát hiện Situ của bệnh nguyên
Đại lý của Hepatopancreatitis hoại tử ở tôm
James K. Loy,
1
* Floyd E. DEWHIRST
2
WILLIAM Weber,
3
Paul F. FRELIER,
1
Theodore L. GARBAR,
1
SERBAN I. TASCA,
1
Và JOE W. Templeton 1
Cục Thú y Pathobiology, Texas A & M University, College Station, Texas 778431
Cục Di truyền học phân tử, Trung tâm Nha khoa Forsyth, Boston, Massachusetts 021152
và Aprogenex, Inc, Houston, Texas 770543
Nhận được 27 tháng Chín 1995/Accepted 05 tháng sáu năm 1996
Hepatopancreatitis hoại tử (NHP) là một bệnh nghiêm trọng của nuôi trồng Penaeus vannamei đã được
liên quan với thiệt hại tử vong từ 20 đến 95%. NHP lần đầu tiên được công nhận tại Texas vào năm 1985 (S. K.
Johnson, p. 16, trong Sổ tay bệnh tôm, 1989) và là một căn bệnh kinh tế quan trọng đã hạn chế
khả năng để nuôi tôm ở Texas. Nguyên nhân giả định của NHP là một gram âm, pleomorphic, intracel
lular, rickettsia giống như vi khuẩn vẫn còn vô văn một phần vì sự vắng mặt của tôm thành lập
tế bào dòng. Không có khả năng vi khuẩn NHP văn hóa đòi hỏi phải sử dụng các phương pháp phân tử-phyloge
netic vị trí của vi khuẩn NHP. Các gen mã hóa 16S rRNA (16S rDNA) của tác nhân gây bệnh tôm
đã được khuếch đại bằng phương pháp PCR, nhân bản, và giải trình tự. Phân tích trình tự nhân bản 16S rDNA chỉ ra rằng
NHP vi khuẩn là một thành viên của lớp con của Proteobacteria. Trong lớp con alpha, NHP
vi khuẩn được thể hiện chặt chẽ nhất có liên quan đến các endosymbionts vi khuẩn nguyên sinh động vật, Caedibacter caryophila
và Holospora obtusa. Ngoài ra, các vi khuẩn NHP là khác biệt nhưng có liên quan đến các thành viên của nhóm sốt phát ban
(Rickettsia typhi và R. prowazekii) và nhóm phát hiện sốt (R. rickettsii) của Rickettsiaceae gia đình. Fluores-
cently dán nhãn thiết bị thăm dò DNA oligonucleotide liên kết với vùng biến đổi (V2, động cơ V6 và V8) 16S rRNA của
NHP vi khuẩn đã được sử dụng để phát hiện vi khuẩn trong tôm bị nhiễm bệnh bằng cách lai tạo tại chỗ. Kỹ thuật này
cung cấp bằng chứng trực tiếp hình ảnh các 16S rDNA được khuếch đại, nhân bản, và trình tự đã được bắt nguồn từ
vi khuẩn nội bào, nhiễm vào gan tụy của tôm nuôi trồng tôm thẻ chân trắng P..
Một loại vi khuẩn nội bào cuốn tiểu thuyết có liên quan với một nghiêm trọng
bệnh của trang trại, nâng lên Thái Bình Dương tôm thẻ chân trắng, Penaeus vannamei.
Căn bệnh này là phổ biến nhất được gọi là hoại tử m.
topancreatitis (NHP), tuy nhiên, từ đồng nghĩa cho NHP
Texas ao hội chứng tử vong và u hạt gan-
viêm tụy (14, 24). NHP là kinh tế quan trọng dis-
dễ dàng bị hạn chế sản xuất tôm ở Texas và
gần đây đã được chẩn đoán ở Trung và Nam Mỹ.
Nguyên nhân giả định của NHP là một gram âm, pleomorphic,
nội bào, rickettsia giống như loại vi khuẩn cư trú và đa
Minh Tuyet trong ống tế bào biểu mô của gan tụy của trong-
fected tôm.
Nghiên cứu hình thái của NHP mô tả hai hoặc ba khác biệt
hình thức vi khuẩn trong các tế bào chất của bị nhiễm hepatopancre-
ATIC hình ống biểu mô tế bào (14, 21, 24). Mặc dù nhiều
sinh vật hình thái khác biệt có liên quan
NHP, những sinh vật này được cho là đại diện khác nhau mor
phologic hình thức của một loại vi khuẩn phức tạp, (24). Nhất
hình thức phổ biến của vi khuẩn NHP là một, nhỏ pleomorphic,
coccobacillus gram âm hình thái tương tự như
thành viên của các Rickettsiales thứ tự. Hình thức này của vi khuẩn
là vòng (trung bình 0,32 mm đường kính) để que hình và
trưng bày một trilaminar màng tế bào chất với một undulat
ing, bên ngoài phong bì. Các hình thức vi khuẩn hình que là
Dài từ 0,59 đến 1,18 mm và rộng 0,36 mm. Đôi khi, que
hình thức vi khuẩn hình thể hiện một hình khuyên ngang, tập trung
co thắt, chỉ ra rằng hình thức này sao chép nhị phân FIS-
sion (14). Hình thái khác biệt hình thức các bacte
rium là một thanh xoắn ốc dài trưng bày một hồ sơ giảm dần
các đường lằn xoắn ốc nổi bật ở cực đỉnh và lu-nhiều
% không bào trong các khía cạnh mài mòn đáy, của sinh vật.
Điều này ít phổ biến hơn, dạng xoắn ốc của các vi khuẩn NHP chứa
tám, dài periplasmic roi phát sinh từ các khía cạnh đáy
của sinh vật chưa được xác định trong replicative
hình thức (24). Dạng xoắn ốc của các vi khuẩn trung bình NHP
0,24 mm chiều rộng và có thể vượt quá 3,25 mm chiều dài (14, 21, 24).
An, hình thức trung gian không rõ ràng rằng cuộc triển lãm hình thái
đặc điểm chung để replicative của cả hai và xoắn ốc
các hình thức đôi khi được xác định trong hepatopancreatic nhiễm
biểu mô tế bào. Đây là hình thức trung gian là một thanh kéo dài
hình sinh vật trưng bày một cong hồ sơ cá nhân nhấp nhô
và chứa số lượng khác nhau của không bào chất nguyên sinh lucent
tập trung ở một đầu của sinh vật. Progressive
thay đổi hình thái trong các hình thức trung gian cho một mat-
uration trình tự từ hình thức replicative về phía xoắn ốc
hình thức. Trong thời gian này biến thái, hình thức trung gian ac
quires một hồ sơ giảm dần với một khía cạnh riêng biệt đáy mài mòn
và một khía cạnh đỉnh nhọn (24).
Những nỗ lực văn hóa vi khuẩn NHP được unsuc
cessful, một phần vì sự vắng mặt của tôm thành lập
hệ thống nuôi cấy tế bào (13). Tuy nhiên, dạng hình que của
NHP vi khuẩn đã được tinh chế bởi mật độ Percoll dốc
ultracentrifugation và NHP đã được sao chép bằng cách tiêm
của vi khuẩn làm giàu cô lập vào gan tụy
tôm P. vannamei bình thường. Tái sản xuất thử nghiệm này
NHP phục vụ để chứng minh rằng vi khuẩn nội bào là
tác nhân gây bệnh của NHP và chỉ ra rằng hình que
hình thức vi khuẩn đóng vai trò chủ đạo trong tác nhân gây bệnh
esis của bệnh (14).
Này rickettsia như NHP vi khuẩn vẫn còn vô văn,
và phân loại phân loại của nó là không chắc chắn. Các hệ thống
* Tương ứng với tác giả. Địa chỉ hiện: Sở thí nghiệm
Bệnh học, Bristol-Myers Squibb, P.O. Box 4000, F14-03, Princeton, NJ
08543. Điện thoại: (609) 252-5071. Fax: (609) 252-6609.
3439evaluation của chuỗi acid nucleic đã cho phép, phí xây dựng
tion các đề án phát sinh loài cho prokaryote đa dạng và eu-
karyotic sinh vật (10, 12). Trình tự 16S rRNA và
gen mã hóa 16S rRNA (16S rDNA) được sử dụng cho
phát sinh loài phân loại vi khuẩn (7, 8, 26, 27, 42) và
đặc biệt hữu ích trong việc phân loại phân loại của vô văn
hoặc các vi khuẩn khó tính (20, 30, 38, 41). Các tiện ích của các ribo
somal tiểu đơn vị để phân loại phát sinh loài dựa trên của nó
phân phối phổ quát, tính thống nhất của chức năng, bảo tồn pri
mary liên tục với tốc độ thấp của sự thay đổi, và dễ bị cô lập
(12). Trong nghiên cứu này, các 16S rDNA của một Percoll-tinh khiết cô lập
của vi khuẩn NHP đã được khuếch đại bằng phương pháp PCR, nhân bản vô tính thành một
pSP65 vector, và trình tự để cho phép phát sinh loài classifi
cation của vi khuẩn NHP.
Trong lai tạo tại chỗ với đầu dò huỳnh quang oligonucleotide
đã được sử dụng để cung cấp phân loại phát sinh loài của vi khuẩn
và có thể được sử dụng để phân biệt các loài vi khuẩn trong liên quan
nhóm di truyền (2-4, 6, 35). Trong nghiên cứu này, các NHP
vi khuẩn đã được xác nhận là nguồn gốc của những khuếch đại,
nhân bản vô tính, và trình tự 16S rDNA lai tại chỗ. Các
16S rDNA trình tự thu được trong quá trình phát sinh loài classifica
tion của vi khuẩn NHP được phân tích và cụ thể oligonu,
cleotide đầu dò được thiết kế để lai giống với các khu vực biến (V2,
V6 và V8) 16S rRNA của vi khuẩn NHP
xác định và thử nghiệm. Lai tạo tại chỗ cho thấy fluoro-
oligonucleotide chrome nhãn hiệu thiết bị thăm dò địa hoá đến các cyto
vết bùn của hepatopancreatic tế bào biểu mô ống của NHP-
tôm thẻ chân trắng nhiễm P. tôm, do đó chứng thực các NHP
vi khuẩn như là nguồn gốc của chuỗi 16S rDNA.
TÀI LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vi khuẩn phân lập và khai thác DNA của vi khuẩn. Các dạng hình que của
NHP vi khuẩn được phân lập từ hepatopancreata tôm thu được trong một
tự phát bùng nổ của NHP P. nuôi tôm thẻ chân trắng ở Texas. Các NHP
vi khuẩn đã được tinh chế từ các mô tôm Percoll sửa đổi (Pharmacia
LKB, Pleasant Hill, California) mật độ dốc ly tâm như mô tả previ
ously (13, 37). Tóm lại, 8-10 hepatopancreata ướp lạnh đã được tẩm ướt và
ly tâm ở g 3 200 cho 8 phút trong bộ đệm Tris-sucrose (pH 7.4), có chứa 0,033
Tris M-hydrochloride 0,25 M và sucrose, để loại bỏ các mảnh vỡ mô. Siêu
natant đã được gỡ bỏ, lớp trên Percoll ở một nồng độ cuối cùng 40%, và
ly tâm ở g 3 25.000 cho 60 phút trong một ultracentrifuge. Một ban nhạc của vi khuẩn,
được hình thành tại giao diện của Percoll, thu hoạch và đông lạnh trong aliquots
2708C. Smears của ban nhạc thu hoạch được nhuộm màu Gram vết bẩn, và một viên
bắt nguồn từ các ban nhạc thu hoạch đã được kiểm tra bằng kính hiển vi điện tử để con-
công ty có sự hiện diện của vi khuẩn NHP (13). DNA được chiết xuất từ hai
riêng biệt Percoll chủng vi khuẩn NHP tinh khiết. Tóm lại, 25 mg
Percoll-tinh khiết vi khuẩn cô lập được lơ lửng trong 250 ml dung dịch đệm tiêu hóa (50
mM Tris, 20 mM EDTA, 0,5% sodium dodecyl sulfate [pH 8,5]) trong 0,5 ml
Eppendorf ống. Proteinase K (7,5 ml của một giải pháp chứng khoán 20-mg/ml) đã được bổ sung
mỗi ống, và giải pháp đã được ủ ở 608C trong 2 giờ với định kỳ
vortexing chất phản ứng, điều này đã được theo sau bởi bất hoạt nhiệt của proteinase K
958C cho 10 phút. Các ống này sau đó được microcentrifuged trong 3 phút ở 13.000 rpm,
và 75 ml của bề được áp dụng cho một SPIN Chroma TE-100 (Clon
công nghệ phòng thí nghiệm, Palo Alto, California) cột và ly tâm trong một cánh quạt ngang
theo quy định của nhà sản xuất. Eluent thu thập bằng cách ly tâm
pha loãng 1:100 và 1:1,000 trong nước cất (Gibco BRL, Grand Island, NY)
trước khi sử dụng trong khuếch đại PCR của 16S rDNA.
PCR. 16S rDNA của vi khuẩn NHP đã được khuếch đại bằng phương pháp PCR với nhẹ
sửa đổi của mồi được mô tả bởi Weisburg et al. (38). Các mồi
được thiết kế để nhắm mục tiêu rDNA 16S với bản sao gần như đầy đủ độ dài của 16S
rDNA (khoảng 1.500 cơ sở). Các PCR mồi 59 và 39 kết hợp một
HindIII hạn chế trang web và một trang web hạn chế EcoRI, tương ứng, để tạo điều kiện
chèn vào một vector nhân bản plasmid. Trình tự của mồi về phía trước
59GCAAGCTTAGAGTTTGATCCTGGCTCA (Escherichia coli vị trí từ 8 đến
26), và trình tự của mồi ngược lại là 59GCGAATTCACGGCTACC
TTG TTACGACTT (vị trí E. coli 1492-1512). Hạn chế HindIII trang web
mồi về phía trước và các trang web hạn chế EcoRI trong mồi ngược lại là
gạch chân. PCR được thực hiện với hỗn hợp phản ứng 50-ml có chứa 10 mm
Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl, 200 deoxynucleotides mM, 0,5
mM (mỗi) về phía trước và cặp mồi ngược lại, 1,25 U AmpliTaq DNA
polymerase (Perkin-Elmer Cetus Instruments, Norwalk, bang Connecticut), và từ 0,03 đến 0,3
mg DNA mẫu (2,5 ml của DNA tinh khiết cột trước đó pha loãng
1:100 hoặc 1:1,000 trong nước cất). Các giải pháp cuối cùng sau đó đã được che phủ với
dầu khoáng. Hồ sơ cá nhân khuếch đại bao gồm 30 chu kỳ 45 s ở 928C, 45 s
ở 528C, and2mat728C với thêm 8 phút ở 728C sau trận chung kết
chu kỳ. Một số chia hết một số 10 ml của mỗi sản phẩm PCR đã được kiểm tra bằng điện di trong
1% agarose trong Tris-acetate-EDTA (TAE) đệm có chứa 1 mg của ethidium
bromide mỗi ml.
Nhân bản và sắp xếp các sản phẩm PCR. Các sản phẩm PCR được tinh chế bằng
điện di (50 V từ 5 đến 6 giờ) trong một gel agarose 1,5% để loại bỏ
chưa được sơn lót và các sản phẩm mở rộng chưa đầy đủ của PCR. Sau
điện di, các ban nhạc có chứa sản phẩm PCR được cắt bỏ từ các Aga
tăng gel và DNA được chiết xuất từ các ma trận gel gel với DNA Qiaex
bộ dụng cụ khai thác, theo khuyến cáo của nhà sản xuất (Qiagen, Studio City, Cal-
.). Các sản phẩm PCR được sau đó được ủ với HindIII và EcoRI
(Boehringer Mannheim) theo khuyến cáo của nhà sản xuất và ligated đến một
tương tự như chuẩn bị pSP65 vector (Promega, Madison, Wisconsin) để chuẩn bị cho
nhân bản trong Epicuran coli SCS1 tế bào có thẩm quyền (Stratagene, La Jolla, California).
Sau chuyển đổi và lựa chọn các dòng vô tính, các plasmid được chiết xuất từ
chuyển đổi các tế bào với P20 cột (Qiagen, Chatsworth, California) như khuyến cáo
vá của nhà sản xuất và resuspended trong 100 ml dung dịch đệm TE. Các
plasmid đã được sàng lọc chèn PCR HindIII và tiêu hóa EcoRI của một
2-ml phần nhỏ của mỗi giải pháp plasmid tiếp bằng điện di gel agarose của
sản phẩm. Mười plasmid nhân bản vô tính có chứa một chèn kích thước thích hợp
theo dõi chấm dứt chuỗi trình tự DNA với DNA bộ Sequenase
(Hoa Kỳ Sinh hóa, Cleveland, Ohio) theo khuyến cáo của các manu
facturer. Ban đầu, 200 cơ sở đầu tiên của mỗi sợi DNA từ chèn của 10
nhân bản đã được sắp xếp theo trình tự, và không có bất xứng hợp đã được xác định.Bảy nhân bản
bắt nguồn từ một mẫu vi khuẩn, và ba nhân bản được lấy từ
mẫu vi khuẩn khác. Kể từ khi 200 cơ sở đầu tiên của một trong hai sợi của 16S rDNA
bao gồm công nhận các khu vực thay đổi, các dòng vô tính được coi là tương đương.
Sau đó, sáu dòng vô tính đã được lựa chọn và trình tự hoàn toàn. Chuỗi
mồi và vị trí gần đúng của họ trong các 16S rDNA (số E. coli)
được liệt kê trong Bảng 1.
16S rRNA phân tích dữ liệu. 16S rDNA trình tự được so sánh với tất cả các
Các chuỗi dữ liệu được duy trì trong cơ sở dữ liệu GenBank và EMBL bằng cách sử dụng
BLAST thuật toán để đảm bảo rằng nguồn gốc của trình tự 16S rDNA và
rằng trình tự là độc đáo (1). Đối với phân tích phát sinh loài, một chương trình thiết lập cho
nhập dữ liệu, chỉnh sửa, trình tự liên kết, trung-cấu trúc so sánh, Simi
thế hệ larity ma trận, và xây dựng dendrogram cho 16S rRNA dữ liệu
bằng văn bản trong Microsoft QuickBasic cho sử dụng trên máy tính IBM và các máy tính tương thích
(28). Cơ sở dữ liệu trình tự có chứa khoảng 500 chuỗi xác định
trong phòng thí nghiệm của FE Dewhirst và 200 thu được từ GenBank hoặc
Dự án Cơ sở dữ liệu ribosome (7, 8, 28). Ma trận tương tự đã được xây dựng
từ các chuỗi liên kết bằng cách chỉ sử dụng các vị trí đó 90% các chủng
có dữ liệu. Ma trận tương tự đã được sửa chữa cho nhiều thay đổi cơ sở
phương pháp Jukes và Cantor (18). Cây phát sinh loài đã được xây dựng bởi
người hàng xóm tham gia phương pháp của Saitou và Nei (31). Bootstrapping của hàng xóm
BẢNG 1. Trình tự mồi và địa điểm gần đúng trong
16S rRNA chuỗi các E. coli
Primer
tên
Primer
trình tự
Vị trí
(E. coli)
Primer 1187 59 TCACACAGGAAACAGCTATG-39
FS-1 59-GACGATAATGACGGTAGCAG-39 474-499
FS-2 59 GGAGCAAACAGGTTAGA-39 775-792
FS-3 59 GGGACAGAAGGCTCAG-39 998-1014
FS-4 59 CTTATGGGCTGGGCTACACA-39 1011-1029
Primer 59-ATTTAGGTGACACTATA-39
rs-1 59-TGTGTAGCCCAGCCCATAAG-39 1211-1228
rs-2 59 CATCGTTTACGGCGTGGA-39 807-820
rs-3 59 GGGCTTTCACACCTTGCTTA-39 613-595
rs-4 59 CTACCGTCATTATCGTCACA-39 445-459
rs-5 59 AGGTAGATTCCCGTGTATTA-39 119-138
một
Trình tự mồi trong vector nhân bản.
BẢNG 2. Trình tự của các đầu dò huỳnh quang-dán nhãn
một
Thăm dò
tên
Thăm dò chuỗi
Vị trí
(E. coli)
prV2 59-AGGTAGATTCCCGTGTATTA-39 151-171
prV6 59-TCTGATGCCTCCTGTCCCTAT-39 997-1018
prV8 59-TCACCCCCTTGCTTCTCATTGT-39 1249-1271
NS 59-ATTCCTTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTT-39 338-367
một
Vị trí gần đúng của mỗi đầu dò (với số lượng E. coli) là được.
3440 Loy ET AL. APPL.ENVIRON.MICROBIOL.TABLE 3. Ma trận tương tự dựa trên 16S rRNA so sánh chuỗi
Loài
% Tương tự% differencea
Afipia felis
Beijerinckia indica
Brucella abortus
Bartonella Quintana
Agrobacterium tumefaciens
Rhodobacter capsulatus
Rhodobacter sphaeroides
Hyphomonas jannaschiana
Erythrobacter longus
Sphingomonas capsulata
Sphingomonas paucimobilis
Azospirillum lipoferum
Magnetospirillum magnetotacticum
Rhodospirillum rubrum
Anaplasma marginale
Cowdria ruminantium
Wolbachia pipientis
Ehrlichia sennetsu
Rickettsia typhi
Rickettsia prowazekii
Rickettsia rickettsii
NHP vi khuẩn
Caedibacter caryophila
Holospora obtusa
Piscirickettsia salmonis
NIX vi khuẩn
Coxiella burnetii
Escherichia coli
Afipia felis 92,2 89,6 88,6 88,8 85,8 88,0 86,8 85,9 85,3 86,0 87,5 87,0 86,4 81,8 81,2 81,0 80,4 83,1 83,2 83,0 82,9 85,6 84,0 80,9 80,8 82,0 79,6
Beijerinckia indica 8,2 90,2 89,7 90,3 88,1 89,2 88,1 86,0 86,5 86,4 88,8 87,5 86,2 81,8 82,1 81,1 80,6 83,7 83,5 83,4 82,8 85,4 83,0 80,9 81,0 81,4 79,6
Brucella abortus 11,2 10,5 94,1 93,5 89,2 89,3 89,4 87,8 88,7 87,2 87,9 86,9 87,2 82,5 82,3 82,1 81,7 84,3 84,2 84,3 82,6 86,2 84,0 82,1 81,6 81,7 80,6
Bartonella Quintana 12,3 11,1 6,1 92,8 87,9 87,9 88,1 87,0 87,4 85,8 87,4 86,5 86,3 83,0 82,9 82,3 80,9 84,7 84,5 84,7 82,3 86,2 82,7 82,2 82,9 81,7 79,7
Agrobacterium tumefaciens 12,1 10,4 6,8 7,5 87,5 88,2 87,3 87,7 86,8 86,2 87,4 86,5 86,1 83,3 82,9 82,3 82,0 84,3 83,8 83,9 83,5 86,7 83,1 82,3 81,4 82,2 79,6
Rhodobacter capsulatus 15,7 13,0 11,7 13,2 13,6 95,1 88,7 85,4 85,5 85,6 87,0 85,5 86,2 81,8 81,7 81,6 80,4 82,9 83,3 83,4 82,2 85,0 81,7 80,2 80,4 80,6 78,4
Rhodobacter sphaeroides 13,0 11,6 11,6 13,2 12,9 5,0 89,2 85,8 86,7 87,2 87,7 86,1 86,6 82,6 82,1 81,5 81,1 83,2 83,4 83,1 82,3 84,6 81,4 81,1 81,6 81,4 79,5
Hyphomonas jannaschiana 14,5 13,0 11,5 13,0 13,9 12,3 11,7 87,2 87,4 86,8 87,5 86,5 87,5 83,3 83,7 82,2 81,0 84,3 84,5 84,5 83,1 85,4 82,5 81,3 81,0 81,5 80,5
Erythrobacter longus 15,7 15,5 13,3 14,3 13,4 16,2 15,7 14,1 92,0 91,1 85,3 85,7 86,1 82,3 83,2 80,6 80,7 83,6 83,8 83,2 82,2 84,3 82,2 81,2 81,5 82,6 80,6
Sphingomonas capsulata 16,3 14,8 12,2 13,8 14,6 16,1 14,6 13,9 8,5 91,7 86,1 86,0 86,0 82,2 82,3 79,5 79,7 83,5 83,8 83,6 82,4 84,8 81,3 81,2 80,8 81,4 80,7
Sphingomonas paucimobilis 15,4 15,0 14,1 15,8 15,2 16,0 14,0 14,6 9,4 8,8 86,7 86,8 85,9 82,4 82,1 79,0 79,6 83,3 83,6 83,5 82,6 84,8 81,8 81,2 80,1 81,7 80,7
Azospirillum lipoferum 13,6 12,1 13,2 13,8 13,8 14,3 13,5 13,7 16,4 15,4 14,6 89,7 88,4 82,5 82,0 80,7 81,0 85,1 85,2 84,7 83,8 87,7 83,2 81,2 81,8 81,3 80,3
Magnetospirillum magnetotacticum 14,3 13,6 14,4 14,9 14,8 16,2 15,4 14,9 15,8 15,5 14,5 11,1 88,2 82,6 81,9 80,7 80,1 84,1 83,9 83,7 81,9 85,7 81,5 80,9 80,8 81,4 80,6
Rhodospirillum rubrum 15,1 15,3 14,1 15,1 15,4 15,3 14,8 13,7 15,4 15,6 15,6 12,6 12,8 83,6 83,0 82,1 81,4 83,2 83,3 83,0 81,3 85,3 82,6 82,1 82,1 82,3 81,5
Anaplasma marginale 20,8 20,8 19,9 19,2 18,9 20,8 19,8 18,8 20,1 20,4 20,1 19,9 19,8 18,5 92,4 87,6 85,3 84,7 84,7 84,7 83,0 83,7 82,3 79,6 80,9 81,4 79,8
Cowdria ruminantium 21,6 20,4 20,1 19,4 19,4 20,9 20,4 18,4 19,0 20,2 20,4 20,6 20,7 19,2 8,1 87,6 84,7 84,2 83,9 84,4 80,8 83,1 81,9 79,5 80,4 80,5 77,9
Wolbachia pipientis 21,9 21,8 20,5 20,1 20,2 21,1 21,2 20,4 22,4 23,9 24,6 22,4 22,3 20,5 13,6 13,5 84,1 84,4 84,4 84,4 81,8 82,8 81,2 79,6 80,1 80,8 78,9
Ehrlichia sennetsu 22,7 22,5 21,0 22,0 20,5 22,7 21,7 21,9 22,4 23,6 23,8 22,0 23,2 21,4 16,4 17,1 17,9 82,7 83,1 83,3 80,6 81,2 80,2 78,7 78,8 80,0 77,4
Rickettsia typhi 19,1 18,4 17,6 17,1 17,7 19,5 19,0 17,6 18,5 18,6 18,8 16,6 17,9 19,0 17,1 17,8 17,5 19,7 99,5 98,6 82,9 85,4 83,4 80,9 81,0 82,1 78,0
Rickettsia prowazekii 19,0 18,7 17,7 17,4 18,2 18,8 18,8 17,3 18,2 18,2 18,5 16,5 18,1 18,8 17,1 18,1 17,5 19,2 0,5 98,6 83,5 85,3 83,6 81,3 81,6 82,0 78,6
Rickettsia rickettsii 19,3 18,8 17,7 17,1 18,2 18,8 19,1 17,3 19,0 18,5 18,6 17,1 18,3 19,3 17,1 17,5 17,5 18,9 1,4 1,4 83,4 85,0 83,5 81,3 81,4 82,5 78,3
NHP vi khuẩn 19,4 19,6 19,8 20,1 18,6 20,3 20,1 19,2 20,4 20,1 19,8 18,3 20,7 21,5 19,3 22,2 20,9 22,5 19,4 18,7 18,7 87,4 84,1 79,6 79,1 80,3 77,6
Caedibacter caryophila 16,0 16,3 15,2 15,2 14,6 16,7 17,2 16,2 17,7 16,9 16,9 13,5 15,9 16,3 18,4 19,2 19,5 21,6 16,2 16,4 16,8 13,8 86,4 82,1 80,6 81,3 80,5
Holospora obtusa 18,1 19,3 17,9 19,6 19,1 21,0 21,4 20,0 20,3 21,4 20,9 19,0 21,2 19,8 20,2 20,7 21,6 23,0 18,7 18,5 18,7 17,8 15,0 79,2 78,8 80,7 78,0
Piscirickettsia salmonis 22,0 22,1 20,4 20,3 20,3 22,9 21,8 21,5 21,6 21,6 21,7 21,6 22,0 20,4 23,8 23,9 23,8 25,0 22,1 21,5 21,4 23,8 20,4 24,4 87,2 87,6 85,5
NIX vi khuẩn 22,1 21,9 21,1 19,4 21,3 22,7 21,1 22,0 21,2 22,2 23,1 20,8 22,1 20,4 22,1 22,8 23,1 24,9 21,9 21,1 21,4 24,4 22,5 24,9 14,0 87,0 84,7
Coxiella burnetii 20,5 21,4 21,0 21,0 20,3 22,4 21,4 21,2 19,8 21,3 21,0 21,5 21,4 20,2 21,4 22,6 22,1 23,2 20,4 20,6 19,9 22,9 21,4 22,4 13,6 14,3 84,8
Escherichia coli 23,8 23,9 22,4 23,7 23,9 25,4 23,9 22,6 22,4 22,3 22,3 22,8 22,5 21,2 23,5 26,2 24,8 26,9 26,0 25,2 25,6 26,7 22,6 26,0 16,1 17,2 17,0
một
Số trên đường chéo đại diện cho tỷ lệ tương tự chưa được sửa chữa, và những người bên dưới đường chéo là tỷ lệ phần trăm của sự khác biệt cho nhiều thay đổi cơ sở sửa chữa theo phương pháp của Jukes và Cantor (18).
VOL. 62, 1996 phát sinh học VÀ PHÁT HIỆN chỗ của vi khuẩn NHP 3441joining cây được thực hiện với MEGA chương trình (22), với 500 resamplings
và pairwise loại bỏ dữ liệu không đầy đủ.
rRNA thăm dò thiết kế và tổng hợp. Phân tích sự trợ giúp của máy vi tính của 16S
trình tự rDNA cho thấy ba phân đoạn chuỗi axit nucleic được duy nhất
vi khuẩn NHP (Bảng 2). Các trình tự (prV2, prV6, và prV8) phạm vi
18-22 nucleotide và có nguồn gốc từ vùng biến đổi được công nhận (V2,
, Động cơ V6 và V8, tương ứng) của trình tự 16S rDNA. Một 16S eubacterial phổ quát
thăm dò phục vụ như một điều khiển tích cực (19). Đối với mỗi trình tự, nhân bản đầu dò mà
liên hợp isothiocyanate fluorescein hoặc Rhodamine một huỳnh quang
phái sinh (Texas đỏ; Clonetech) được sản xuất. Oligonucleotide đầu dò
được tổng hợp (ứng dụng mô hình tổng hợp DNA Biosystems 380 B), và
fluorochrome nhãn đã được liên hợp với một mối liên kết phosphate aminoethyl (Ami-
nolink I; Applied Biosystems) kết hợp vào cuối 59 của oligonucleotide.
Thiết bị thăm dò đã được tinh chế bằng Waters sắc ký lỏng với áp suất cao một
sắc ký ban đầu 810 máy trạm.
Mô phần chuẩn bị và điều kiện lai tạo thăm dò. Bị nhiễm P.
tôm thẻ chân trắng tôm đã được thu được trong một ổ dịch tự nhiên của NHP ở Texas.Các
hepatopancreata mẫu vật sống đã được tiêm thuốc định hình Davidson
(16), tôm đã được mổ xẻ, và cơ quan đã được gỡ bỏ từ tôm mỗi.
Gan tụy được đắm mình trong định hình Davidson trong 24 h, chuyển giao cho
70% ethanol, và xử lý để kiểm tra mô học thường xuyên. Paraffin-nhúng-
mẫu vật ded được sectioned 3 đến 4 mm và được gắn trên tích điện dương
slide (Fisher Scientific, Pittsburgh, bang Pennsylvania). Các phần đã deparaffinized bằng
được gia nhiệt ở 658C trong 20 phút và sau đó được đắm mình trong Xylen trong 2 phút,
với ba thay đổi của xylene. Các slide được hydrat bằng cách ngâm trong 1 phút
trong mỗi trong những giải pháp ethanol phân loại sau đây: tuyệt đối, 95%, 75%, 50%, và
cuối cùng cất nước. Các slide sau đó đã được đắm mình trong 15 phút-phosphate
đệm dung dịch muối (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4.3 mM NaH2PO4 z 7H2O,
1,4 mM KH2PO4 pH 7,3) tại 458C và ủ trong một giải pháp proteinase K (100.
mg / ml PBS) trong 15 phút ở 378C. Các slide được equilibrated với 1,6 mM
dithiothreitol (Boehringer Mannheim) PBS trong 10 phút ở 458C và bị chặn
với 1,6 mM dithiothreitol-1.6 mM iodoacetemide (Aldrich Chemical, Milwau
kee, Wisconsin) -1,59 mM N-ethylmaleimide (Sigma, St Louis, Missouri) PBS trong 30 phút
ở 458C. Các slide được rửa hai lần cho 5 phút trong PBS ở nhiệt độ phòng (RT;
258C) và equilibrated Triethanolamine 1,75% (TEA; Sigma) (pH 8,0) tại RT.
Các trang trình bày đã được chuyển giao cho anhydride acetic tươi TEA-0,25% (Sigma) cho 5
phút ở RT và sau đó chuyển giao cho anhydride acetic TEA 0,5% trong 5 phút ở RT.
Các trang trình bày đã bị chặn trong 23 Ủy ban Chứng khoán Nhà nước (13 Ủy ban Chứng khoán Nhà nước là 0.15MNaCl cộng 0.015Msodium
citrate) cho 5 phút ở RT và sau đó được đắm mình trong H2O cất 5 phút ở RT. Các
đầu dò được pha loãng trong cocktail lai (Aprogenex Inc, Houston, Texas),
và 30 đến 50 ml của giải pháp này được áp dụng cho slide. Một sự tập trung của 0,04
mg / ml đã được sử dụng cho các đầu dò được dán nhãn với fluorescein isothiocyanate, và một con
centration 0,02 mg / ml đã được sử dụng cho các đầu dò gắn nhãn với Texas đỏ.Coverslips
được đặt trên các trang trình bày, và các trang trình bày đã được ủ trong một căn phòng ẩm ướt
ở 428C trong 10 phút và sau đó được chuyển cho 45 s một cái vi để nướng prewarmed đặt ở
928C. Các trang trình bày đã được trả lại cho căn phòng ẩm ướt và ủ 5-16
giờ ở 428C trong bóng tối. Sau khi lai tạo, các trang trình bày đã được rửa sạch trong
Aprogenex Rửa tại 428C trong 15 phút và chuyển Aprogenex Rửa B
RT cho 10 phút với hai thay đổi. Các slide được gắn trong hoặc propidium
iodide / Antifade (Oncor) hoặc Vectashield (Vector phòng thí nghiệm, Inc, Burlingame,
California) và xem trên kính hiển vi BH10 Olympus trang bị với huỳnh quang
khả năng. Photomicrographs được chụp với Kodak Ektachrome site kia-135
(PS 1600) bộ phim và đẩy mạnh chế biến tại 1.600 ASA.
Số nhập chuỗi nucleotide. Các trình tự của vi khuẩn
chủng được duy trì trong EMBL, GenBank và cơ sở dữ liệu dự án ribosome
cơ sở dữ liệu trình tự nucleotide và có sẵn bằng cách thu hồi điện tử. Các
số gia nhập các chuỗi vi khuẩn trong cơ sở dữ liệu GenBank như
sau: Afipia felis, M65248 Agrobacterium tumefaciens, M11223; Anaplasma
marginale, M60313, Azospirillum lipoferum, Z29619; Beijerinckia indica M59060;
Brucella abortus, X13695; Caedibacter caryophila, X71837, Cowdria ruminantium
X61659; Coxiella burnetii, M21291; Ehrlichia sennetsu, M73225; Erythrobacter
longus, M59062, Escherichia coli, J01695; Hyphomonas jannaschiana, M83806;
Magnetotacticum Magnetospirillum, M58171, NIX vi khuẩn, M94381; Piscirick
ettsia salmonis, X60783; Rhodobacter capsulatus, D16428, Rhodobacter sphae
roides, D16425; Rhodospirillum rubrum, D30778; Rickettsia prowazekii, M21789;
Rickettsii Rickettsia, M21293, Rickettsia typhi, M20499, Sphingomonas capsulata
D16147; Sphingomonas paucimobilis, D13725, vi khuẩn Wolbachia pipientis, X61768.Các
trình tự cho Holospora obtusa là duy trì trong các dữ liệu trình tự nucleotide
cơ sở của dự án ribosome cơ sở dữ liệu theo Hol.obtusa số lượng nhập.
16S rDNA trình tự của các vi khuẩn NHP đã được trình lên
EMBL và cơ sở dữ liệu GenBank. Việc gia nhập GenBank số cho NHP
là vi khuẩn U65509.
Hình 1. Phát sinh loài cây so sánh các loại vi khuẩn NHP với các thành viên khác nhau của một-và g Proteobacteria. Số lượng tại các điểm chi nhánh mô tả%
xuất hiện của một chi nhánh trong thời gian 500 resamplings của phân tích bootstrap.
3442 Loy ET AL. APPL.ENVIRON.MICROBIOL.RESULTS VÀ THẢO LUẬN
Gần như toàn bộ các 16S rDNA (1.416 cơ sở) của NHP bac
terium được khuếch đại, nhân bản, và giải trình tự cho phát sinh loài
vị trí của sinh vật. Trình tự 16S rDNA của
Vi khuẩn NHP được so sánh 23 với những thành viên của
một lớp con của lớp Proteobacteria Proteobacteria (a) và
4 thành viên của g-Proteobacteria, và ma trận tương tự như cho
so sánh này được thể hiện trong Bảng 3. Một cây phát sinh loài con
structed từ các dữ liệu giống nhau bằng cách sử dụng hàng xóm-tham gia
phương pháp rõ ràng cho thấy rằng vi khuẩn NHP là một
thành viên của một Proteobacteria (Hình 1). Hiệp hội của
NHP vi khuẩn với một Proteobacteria được hỗ trợ bởi
thực tế là phân khu này bao gồm rất nhiều vi khuẩn đã hình thành
thân mật và thường trong tế bào liên kết với sinh vật nhân chuẩn
(34, 43, 44). Trong một loại vi khuẩn-Proteobacteria, NHP
hình thành một cụm monophylotetic với các vi khuẩn có
được bao gồm trong bốn phân nhóm được công nhận (a-1, a-2, một-3,
và một-4) (a-Proteobacteria 36). Các vi khuẩn này
cụm bao gồm thành viên của gia đình Rickettsiaceae (A. mar
ginale, C. ruminatum, W. pipientis, E. sennetsu, R. typhi, R.
prowazekii, và R. rickettsii), cũng như protozoal endosym
bionts caryophila C. và H. obtusa. Vi khuẩn NHP
tương tự như C. caryophila (87,4%) và H. obtusa (84,1%)
và thấp hơn một chút tương tự như ba loài Rickettsia, R.
prowazekii, R. typhi, và R. rickettsii (khoảng 83,5%).
Trong nghiên cứu này, các vi khuẩn NHP được thể hiện được hầu hết
chặt chẽ liên quan đến C. caryophila, một vi khuẩn cộng sinh protozoal
macronucleus Paramecium caudatum. Sự kết hợp của
vi khuẩn NHP với C. caryophila là hấp dẫn, bởi vì
một số tính năng quan trọng là phổ biến cho cả sinh vật. Như
thấy trong vi khuẩn NHP, C. caryophila và tương đối chặt chẽ
Holospora obtusa triển lãm nhiều hình thức khác biệt hình thái
(29). C. caryophila, những hình thức bao gồm một nonbright (như
xác định bằng kính hiển vi tương phản pha) hình thức sinh sản
và lớn hơn refractile, sáng hình thức (32). H. obtusa được biết đến
có một hình thức truyền nhiễm, tạo thành một replicative, và một trung gian
ăn hình thức (gọi là hình thức kích hoạt truyền nhiễm) (15). Tuy nhiên,
C. caryophila được phân biệt từ các loại vi khuẩn NHP và
endosymbionts kẻ giết người khác bởi vì nó sản xuất refractile
clusions bao gồm các chặt chẽ cuộn băng proteinaceous (33).
Những cơ quan được gọi là R đã không được quan sát thấy trong NHP
vi khuẩn.
Một sự biện hộ chính để theo đuổi phát sinh loài classifica
tion của vi khuẩn NHP là để đạt được cái nhìn sâu sắc vào hệ sinh thái của nó
và trong các yêu cầu văn hóa tinh trong ống nghiệm. Khi phát sinh loài loại
là tiên đoán, những thông tin mà được biết đến một cơ quan
ism nói chung có thể được áp dụng cho người thân của mình (26, 39). C.
caryophila được mô tả như là vi khuẩn cộng sinh của vi khuẩn bắt buộc,
và không có gì là nổi tiếng về sự bền bỉ của nó bên ngoài máy chủ
Paramecia (33). Như chúng ta đã chứng minh cho NHP
vi khuẩn (13), C. caryophila có thể được lọc bằng cách ly tâm
nhưng đã không được canh tác trên làm phong phú phương tiện truyền thông, và không phải là C.
caryophila cũng không obtusa H. đã được trồng bên ngoài chủ của nó
paramecium (32, 33). Mặc dù sự kết hợp của các NHP
vi khuẩn với C. caryophila và H. obtusa không phải là thông tin
đối với yêu cầu văn hóa in vitro của NHP bac
terium, nó có thể cung cấp cái nhìn sâu sắc vào hệ sinh thái của sinh vật
trong môi trường ao nuôi. Protozoans Epicommensal com-
đại lý ô nhiễm mon sống trên các bề mặt cuticular, mang, và
phụ của P. tôm thẻ chân trắng (11). Nhiễm ánh sáng với những
sinh vật không liên quan với bệnh tật, và sự hiện diện của họ
được coi là ngẫu nhiên (23). Tuy nhiên, theo quan điểm của các phylo
Hình 2. Gan tụy của tôm trắng Thái Bình Dương bị nhiễm vi khuẩn NHP. Con số này thể hiện một tín hiệu tích cực huỳnh quang trong nhiều nhiễm
biểu mô tế bào. Probe prV8 dán nhãn với fluorescein isothiocyanate đã được sử dụng.
VOL. 62, 1996 phát sinh học VÀ PHÁT HIỆN chỗ NHP vi khuẩn 3443genetic kết hợp của vi khuẩn NHP với một nội bào
vi khuẩn cộng sinh của động vật nguyên sinh, khả năng rằng epicommen-
sal sinh vật đơn bào nuôi dưỡng vi khuẩn NHP nên investi
gated.
Các phân tích trình tự cũng đã chứng minh rằng các bac-NHP
terium là khác biệt từ nhưng liên quan đến Rickettsia spp. và họ
người thân. Hiệp hội này hấp dẫn là được hỗ trợ bởi các sự kiện
rằng vi khuẩn NHP là một tác nhân gây bệnh nội bào của một ma-
rine không xương sống và nhiều của các rickettsias lây nhiễm các midgut
epithelia của vector động vật không xương sống của họ. Tuy nhiên, độc đáo
các tính năng hình thái của vi khuẩn NHP, không đầy đủ
kiến thức về chu kỳ sống của sinh vật, và xa
sự khác nhau của vi khuẩn NHP từ phylogenetically clas-
sinh vật sified trong một-Proteobacteria loại trừ vị trí của
vi khuẩn NHP trong một chi được xác định (9).
Sự vắng mặt của các dòng tế bào tôm và kiến thức không đầy đủ
về các yêu cầu phát triển phức tạp của vi khuẩn NHP
đã ngăn chặn trong ống nghiệm canh tác của nền văn hóa tiêu chuẩn meth
ods. Trong sự vắng mặt của một nền văn hóa thuần khiết của vi khuẩn NHP, một
Tổng
Bạn đang đọc truyện trên: Truyen2U.Pro