BỆNH của các sinh vật thủy sản

Dis Aquat Org. 60: 233-240, 2004 Được đăng 08 tháng 9

GIỚI THIỆU

Vi khuẩn hepatopancreatitis hoại tử (NHP

B) là một vi khuẩn Gram âm nội bào rickettsial-bac

terial bệnh nhắm tôm penaeid, lây nhiễm

các ống tế bào biểu mô của gan tụy (HP)

(Loy et al 1996). NHP ban đầu được xác định vào năm 1990

trong nuôi tôm thẻ chân trắng Litopenaeus ở Texas (Mỹ)

(Frelier et al 1992). Căn bệnh đã được

được báo cáo ở một số địa điểm trên toàn phương Tây

Bán cầu bao gồm Texas, Peru, Ecuador, cột

bia, Venezuela, Brazil, Nicaragua, Panama, Costa Rica

và Mexico (Loy et al. 1996, Aguirre-Guzmán

Ascencio Valle 2000, Pantoja & Lightner 2003). NHP

có thể dẫn đến thiệt hại sản xuất đáng kể, với trần

ities khác nhau, từ 25 đến 95% trong các ao nuôi bị ảnh hưởng (Loy et

al. 1996). Tổng dấu hiệu được trình bày bởi tôm nặng

NHP-B bị nhiễm trùng bao gồm hôn mê, tăng trưởng thấp,

chán ăn và một đường trống rỗng ruột, vỏ mềm, và

trạng thái bình thường cơ quan. Các dấu hiệu gián tiếp khác bao gồm đen

hoặc mang tối do ô nhiễm, bệnh vỏ vi khuẩn

(Tổn thương lớp biểu bì, melanization, phụ xói mòn),

và mở rộng bào sắc tố (Aguirre-Guzman &

Ascencio Valle 2000). Một khi dấu hiệu của nhiễm trùng NHP

xảy ra trong ao, thời gian chẩn đoán nhiễm trùng

là rất quan trọng, bởi vì trong khi NHP có thể được điều trị bằng

thuốc thức ăn, quần thể tôm cao trước,

hóa trị của NHP có thể ngừng ăn, đáng kể reduc

ing hiệu quả của nguồn cấp dữ liệu quản lý thuốc.

Hiện nay, 3 phương pháp được sử dụng để phát hiện

NHP: (1) phân tích thói quen mô học của mẫu vật

cố định trong axit rượu formalin-acetic Davidson (AFA)

giải pháp (2) trong lai tạo tại chỗ (ISH) trên các mô cố định

với tàu thăm dò gen NHP cụ thể; và polymerase (3)

© Inter-Nghiên cứu 2004 www.int-res.com * Email: [email protected]

Phát triển các kháng thể đơn dòng

phát hiện hepatopancreatitis hoại tử

tôm penaeid

Deborah J. Bradley-Dunlop, Carlos Pantoja, Donald V. Lightner

Cục Thú y Khoa học và Vi sinh vật học, Đại học Arizona, Tucson, Arizona 85721, USA

TÓM TẮT: kháng thể đơn dòng (MABs) được sản xuất chống lại hepatopancreatitis hoại tử

vi khuẩn (NHP-B) của tôm penaeid. Các kháng thể đơn dòng được thử nghiệm trong xét nghiệm dot-immunoblot (D-IB) có khả năng

phát hiện NHP-B gan tụy trong các mẫu thu thập từ Litopenaeus vị thành niên hấp hối

tôm thẻ chân trắng trong một bệnh nhiễm trùng NHP-B thực nghiệm gây ra. Các kháng thể đơn dòng cũng đã được sàng lọc bởi

mô miễn dịch (IHC) sử dụng đệ trình trường hợp đã được xác định bị nhiễm bệnh không chỉ bởi

mô học, mà còn phản ứng chuỗi polymerase (PCR) và lai tạo tại chỗ (ISH) xét nghiệm bằng cách sử dụng đặc

cific digoxigenin (DIG) được dán nhãn thiết bị thăm dò vào phần mô học chế biến từ tự nhiên bị nhiễm bệnh

tôm. Hai trong số các kháng thể đơn dòng đã được chọn để phát triển các phương pháp phát hiện cho NHP. Các kháng thể đơn dòng

đã được thử nghiệm bằng cách sử dụng các phương pháp IHC rượu formalin-acetic acid Davidson (AFA) cố định mô giây

tions và xác định NHP-B tế bào bị nhiễm bệnh và các mô trong một mô hình tương tự được nhìn thấy với DIG-

có nhãn thiết bị thăm dò gen NHP-cụ thể. Không có các kháng thể đơn dòng phản ứng với mô từ cụ thể tác nhân gây bệnh miễn phí

(SPF) tôm với mô tôm bị nhiễm một loại vi khuẩn giống như rickettsia, Vibrio sp. Campylobac-

ter sp, và Spiroplasma sp. Các kháng thể đơn dòng đã được tìm thấy là tiêu cực chống lại các sinh vật khác,

chứng minh rằng họ là những loài cụ thể và hữu ích cho việc phát hiện chẩn đoán nhanh chóng của NHP-B.

KEY WORDS: NHP · hoại tử hepatopanceatitis · kháng thể đơn dòng Dot-immunoblot ·

Mô miễn dịch

Republication bán lại hoặc không được phép mà không có sự đồng ý bằng văn bản của Aquat publisherDis Org 60: 233-240, 2004

phản ứng chuỗi (PCR) sử dụng cụ thể oligonu NHP-B

cleotide mồi. 3 phương pháp yêu cầu labo đặc biệt

ratory thiết bị và nhân viên được đào tạo để thực hiện

ra thử nghiệm tương ứng và giải thích kết quả. Fur-

thermore, những xét nghiệm có thể mất đến 2-3 d đến

sản xuất kết quả chẩn đoán.

Kháng thể đơn dòng (kháng thể đơn dòng) được sử dụng trong nhiều-

thảm như công cụ chẩn đoán, họ có thể được sử dụng trong enzyme

liên kết khảo nghiệm miễn dịch (ELISA), immunohisto

hóa học (IHC), xét nghiệm dot-immunoblot (D-IB), và

bên dòng định dạng (Bangs Phòng thí nghiệm Công nghệ Ghi chú

1999) chẳng hạn như những người hiện đang được sử dụng trong thai tại nhà

thử nghiệm bộ dụng cụ. Những phương pháp này dựa trên kháng thể là tương đối

nhanh chóng, chỉ cần một vài phút đến vài giờ

chạy, và họ yêu cầu chuyên môn ít hơn và không đặc biệt

các thiết bị khác hơn so với các phương pháp chẩn đoán

hiện đang được sử dụng trong chẩn đoán bệnh tôm

phòng thí nghiệm. Một lợi thế đáng kể để chống

cơ thể dựa trên chẩn đoán xét nghiệm được rằng một số được nhanh chóng,

đơn giản và có thể được sử dụng ao phía ngay lập tức chẩn

nosis. Những đặc điểm này làm cho việc sử dụng kháng thể đơn dòng như là một

công cụ chẩn đoán một thực tế để có sẵn

phương pháp.

Nghiên cứu này báo cáo việc sản xuất kháng thể đơn dòng NHP-B

mô bị nhiễm bệnh, và ứng dụng của họ đến vài

khảo nghiệm các định dạng miễn dịch để sử dụng trong chẩn đoán của

bệnh. Nghiên cứu này cũng chứng minh rằng các kháng thể đơn dòng

phản ứng với đặc NHP-B, trong cả hai bản địa của nó

hình thức và ở trong trạng thái biến tính, cho phép các ứng dụng

mAbs một số định dạng huyết thanh khác nhau

có thể được sử dụng để phát triển các phương pháp kiểm tra nhanh chóng

cho các mẫu bệnh phẩm, ngay cả trong những tình huống lĩnh vực.

TÀI LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NHP-B cô lập. Kể từ khi NHP-B vẫn chưa được

trồng thành công trong ống nghiệm, đó là cần thiết để ủng hộ

Duce NHP-B trong cơ thể bằng cách sử dụng tôm thẻ chân trắng Litopenaeus trong

phòng thí nghiệm theo thủ tục của Vin-

xu & Lotz (2004). NHP-B được sử dụng bởi Vincent & Lotz

(2004) và trong nghiên cứu này là ban đầu thu được

từ tôm nuôi bị nhiễm bệnh ở miền nam Texas. Tóm lại,

cụ thể tác nhân gây bệnh miễn phí (SPF) vị thành niên L. vannamei

được cho ăn được tẩm ướt NHP-B bị nhiễm HP. Nhỏ

phần của HP được sử dụng làm thức ăn cho đã được kiểm tra

H & E thông thường mô học và bằng phương pháp PCR để xác nhận

sự hiện diện của NHP-B. HP vừa mới chết hoặc mori-

tôm bund được tẩm ướt và ăn còn lại

tôm. Một khi nhiễm trùng được thành lập vào

tôm dân số, được xác định bằng phương pháp PCR phân tích

mẫu phân, HP từ tôm bị nhiễm bệnh hấp hối,

được cắt bỏ trong điều kiện vô trùng và được sử dụng trước

đình chỉ cắt giảm tế bào chứa các-bacte

ria. Các HPS sau đó nhẹ nhàng phá vỡ vào làm một

tế bào đình chỉ. Hệ thống treo sau đó, hoặc đông lạnh

trên các phương tiện truyền thông mô đóng băng văn hóa có chứa 10%

dimethylsulfoxide (DMSO; ATCC,) 90% thai trâu, bò

huyết thanh (FBS-Irvine khoa học) và được lưu trữ trong chất lỏng nitro-

gen để sử dụng sau này, hoặc các tế bào đã bị đình chỉ trong cơ sở

phương tiện truyền thông (RPMI-1640 phương tiện truyền thông với L-glutamine) để tiếp tục

thanh lọc.

NHP-B lọc. Một khi các HPS đã bị phá vỡ

vào hệ thống treo di động duy nhất trong RPMI cơ sở phương tiện truyền thông,

các tế bào đã được ly tâm ở 2000 × g trong 15 phút, ở nhiệt độ 4 ° C.

Các tế bào đã bị đình chỉ trong bộ đệm ly giải theo

phương pháp được sử dụng bởi Konkel et al. (1990) để trích xuất

trong tế bào vi khuẩn. Các tế bào được lysed trong khi ở

đình chỉ sử dụng phosphate đệm nước muối (PBS)

0,2% Triton X-100 (Sigma), trong 30 phút ở phòng bình tĩnh-

ature (rt). Các tế bào sau đó được ly tâm ở 2000 x g

10 phút tại rt viên các mảnh vụn tế bào lớn. Các bề

chất lỏng đã được gỡ bỏ và chuyển sang một ống mới và

sau đó ly tâm ở 13 000 × g trong 30 phút ở rt. Các điểm ảnh

cho phép đã bị đình chỉ trong 4 ml PBS và sau đó pha trộn với một

bằng khối lượng của freon trong 10 phút, theo phương pháp

được mô tả bởi Bonami et al. (1990, 1995, 1997) để giảm

tế bào chất béo, glycoprotein, và carbohydrate. Các

freon hỗn hợp được ly tâm ở 2000 x g

10 phút để tách các lớp. Bề dịch

loại bỏ và chuyển vào ống sạch và cả hai

lớp lipid và freon được loại bỏ. Còn lại

chất lỏng bề một lần nữa ly tâm ở 13 000 × g

30 phút ở rt. Viên đã bị đình chỉ trong 1 ml PBS,

sau đó phân phát trong 100 aliquots ml và đông lạnh ở -80 ° C

để sử dụng sau. Một mẫu tinh khiết cô lập đã được thử nghiệm

bằng phương pháp PCR để chứng minh rằng mẫu có NHP

B. Một số các aliquots đã được sử dụng để truyền

hiển vi điện tử (TEM) để đánh giá tinh chế

kết quả NHP-B đình chỉ.

Kính hiển vi điện tử truyền dẫn. Ăn viên vi khuẩn

đã bị đình chỉ trong 200 ml 1 × TN đệm (0,02 M Tris-

HCl, 0,4 M NaCl, pH 7,4) và 10 mẫu ml

được đặt vào formvar phủ 200 lưới đồng lưới.

Các mẫu được tiêu cực màu trong 3 phút với

Phosphotungstic 2% acid (PTA) ở pH 7.0, không khí khô và

kiểm tra bằng cách sử dụng kính hiển vi điện tử Phillips CM12.

MAB sản xuất. Kháng thể đơn dòng đã được chuẩn bị theo

các thủ tục được mô tả bởi Poulos et al. (1999,

2001). Balbc / Bae Yong Joon chuột (Phòng thí nghiệm Jackson, Bar Har-

Bor, ME) được tiêm vào màng bụng (IP)

tinh khiết NHP-B 0,001 mg mỗi nồng độ chuột

và một loạt chủng ngừa đã được thực hiện tại 2

tuần khoảng thời gian trong khoảng thời gian 6 tuần. Chủng ngừa

có tinh khiết NHP-B. Một số tinh khiết

NHP-B đã được biến tính bằng cách đun sôi trong 10 phút, và

một số còn lại trong trạng thái bản địa của nó. Các bacter-kết quả

chuẩn bị ial sau đó gộp lại với nhau và emul

sified với chất bổ trợ tổng hợp (MPL-TDM; RIBI

Immunochem nghiên cứu). Ba con chuột này được cho IP

234Bradley Dunlop et al: Chẩn đoán của NHP bởi các kháng thể đơn dòng.

chủng ngừa ở khoảng thời gian 2 tuần trong MPL-TDM

bổ trợ cho 2 chủng ngừa đầu tiên. Huyết thanh của

mỗi con chuột được thu thập và sau đó thử nghiệm chống

cơ thể sản xuất 7 ngày sau khi tăng cường thứ hai immu

nization được quản lý để đánh giá phản ứng miễn dịch

của những con chuột NHP-B. Miễn dịch huyết thanh đã được pha loãng

1:1000 trong PBS và thử nghiệm IHC NHP-B phát hiện

bằng cách sử dụng Davidson paraffin của AFA cố định nhúng tis

kiện phần từ tôm bị nhiễm bệnh NHP-B. Các

huyết thanh miễn dịch cũng đã được thử nghiệm trong xét nghiệm D-IB chứa

ing cả hai bản địa và biến tính tinh khiết NHP-B. Con dê

chuỗi cụ thể IgG chống chuột, F (ab ') 2, gamma, Alka-

dòng phosphatase dán nhãn kháng thể thứ cấp (EY

Các phòng thí nghiệm) đã được sử dụng để phát hiện gián tiếp cuối cùng.

Theo xác nhận của các phản ứng tích cực với các

huyết thanh miễn dịch, tiêm chủng tăng cường thứ ba có chứa

bản địa và biến tính NHP-B trong PBS đã được trao cho

mỗi chuột ở khoảng thời gian 6 tuần, và các kết quả

huyết thanh được thu thập lại và sau đó được thử nghiệm trong ngày thứ 2

bài tiêm chủng để chọn đáp ứng tốt nhất ani-

mal. Bắt đầu với một pha loãng 1:1000 của huyết thanh trong PBS,

huyết thanh đã được pha loãng 10 lần đến 1:10 000 và chống

Hiệu giá cơ thể được xác định bằng cách sử dụng IHC và D-IB.

Các con chuột được lựa chọn cho hybridoma phát triển là

được lựa chọn dựa trên huyết thanh hiển thị

đáp ứng miễn dịch cao nhất titered. Lá lách tế bào

thu được từ chuột đã chọn được sử dụng trong

nhiệt hạch để làm cho hybridomas. Các kết quả

hybridomas được nuôi trên các phương tiện truyền thông chọn lọc cho 14 d

ở 37 ° C, sau đó hybridomas được chuyển vào

Các phương tiện truyền thông RPMI-1640 với L-glutamine (Sigma) chứa-

ing 10% FBS. Ngày 10 Ngày, bề dịch từ

Các nền văn hóa hybridoma được phản ứng với cả hai nguyên vẹn và

NHP-B đã bị làm biến tính mẫu. Hybridomas Một số

lựa chọn dựa trên phản ứng của họ với NHP-B

D-IB (bằng cách sử dụng NHP-B cả hai bản địa và đã bị làm biến tính) và

IHC. Hybridomas chọn sau đó nhân bản vô tính

hạn chế pha loãng (Galfre Milstein 1981). Các hạn chế

pha loãng đã được thực hiện tổng cộng 3 lần để đảm bảo

monoclonality của các kháng thể đơn dòng. sản xuất. Hai kháng thể đơn dòng

isotyped như IgG lớp 3, kappa chuỗi ánh sáng (g3k),

bằng cách sử dụng một bộ isotyping chuột kháng thể đơn dòng,

theo giao thức của nhà sản xuất (Roche Mol

ecular hóa sinh). Các dòng vô tính sản xuất này

kháng thể, được chỉ định 3D6 và 4A2, đã được lựa chọn

phát triển hơn nữa. Một nhân bản thú vị thứ ba là

không ổn định trong nền văn hóa và nó bị loại bỏ.

Dot-immunoblot xét nghiệm. Xét nghiệm D-IB được thực hiện

theo Nadala & Loh (2000) và Poulos et al. (2001)

với một số sửa đổi. Tóm lại, NHP-B đã được nạp vào

nitrocellulose tấm (Maha tấm, Millipore) sử dụng 1 ml

mỗi mẫu biến tính và bản địa, để mỗi

cũng có 1 ml kháng nguyên biến tính ở phía dưới

phần bên trái của giếng và 1 ml của kháng nguyên có nguồn gốc

phần phía trên bên phải của cùng một giếng. Còn lại

một phần của xét nghiệm này được điều hành theo phương pháp previ

ously được mô tả bởi Poulos et al. (1999). Các màng

đã bị chặn với 400 ml mỗi 2% sữa không chất béo

(NFM), ủ với kháng thể chính trong 100 ml của hy

bridoma bề chất dịch trong 1 h, sau đó rửa 3 lần

với PBS. Dê chống chuột IgG, F (ab ') 2, chuỗi gamma

cụ thể, phosphatase kiềm dán nhãn trung chống

thân (EY phòng thí nghiệm) đã được pha loãng 1:1000 trong PBS + 2%

NFM, và 100 ml mỗi cũng đã được bổ sung, trong 1 giờ ở rt, tráng

3 lần với PBS và các phản ứng đã được phát triển

15-30 phút bằng cách sử dụng chất nền đo màu, nitroblue

tetrazolium (NBT) và bromochloroindoyl phosphate (X-

phos) trong một bộ đệm pH 9,5.

Mô miễn dịch vào phần cố định. SPF Lito-

Penaeus vannamei (Wyban 1992) đã được thử nghiệm

nhiễm NHP-B. Động vật hấp hối đã được cố định

Davidson của AFA định hình từ 24 đến 48 h (Bell &

Lightner 1988). Các mô được nhúng vào trong parafin

và 4 phần micromet được chuẩn bị và được đặt vào

Superfrost Plus ® slide kính hiển vi điện tích dương

(Fisher Scientific). Slides cũng đã được chuẩn bị và nhiễm trùng đường tiết niệu-

lized từ phần liên tiếp của tôm

NHP-B tình trạng bệnh của tôm đã được xác nhận

tổn thương đặc trưng sử dụng thường xuyên mô học meth-

ods (Lightner, 1996). Sau khi làm nóng ở 65 ° C trong 45 phút

làm tan chảy parafin, các phần đã được hydrat

thông qua một loạt các ba 5 phút rửa trong Clear-Rite ® (A

xylene thay thế, Richard Allan khoa học), 95% Alco-

Hol, rượu 80%, 50% rượu và 6 rửa trong dis

cày nước. Các phần đã được ủ trong 5 phút trong

PBS và sau đó bị chặn với PBS có chứa 10% cũng không

mal dê huyết thanh (NGS) và NFM 2% trong 15 phút ở

37 ° C. Chất lỏng bề được thu hoạch từ

hybridomas và ly tâm trong 5 phút ở 13 000 × g đến

viên các tế bào, và 500 ml chất lỏng bề chứa-

các MAB đã được áp dụng cho phần mô hydrat

30 phút ở rt. Các kháng thể đơn dòng đã được thử nghiệm bằng cách sử dụng NHP-B

tích cực, cũng như các mẫu SPF. Sau khi rửa trong 3

thay đổi của PBS, các phần đã được phản ứng với một con dê

IgG chống chuột, F (ab ') 2 kháng thể liên hợp để Alka-

dòng phosphatase (Zymed) pha loãng 1:1000 trong PBS +2%

NFM +10% NGS, 30 phút ở rt. Các phản ứng

sau đó phát triển cho 15 đến 30 phút bằng cách sử dụng NBT và X-phos

trong một bộ đệm pH 9,5. Các phần được counterstained

Bismarck nâu và mất nước thông qua một loạt

rượu rửa kết thúc với Clear-Rite ® theo

thủ tục được mô tả bởi Poulos et al. (2001). Resul-

slide tant đã bao gồm trượt vĩnh viễn gắn kết

các phương tiện truyền thông và quan sát dưới kính hiển vi ánh sáng cho

sự hiện diện của một kết tủa màu xanh-đen cho thấy một

tích cực phản ứng.

MAB đặc. Nền văn hóa thuần khiết của vi khuẩn

Aeromonas sobria, Campylobacter sp, Spiroplasma.

sp, vi khuẩn Vibrio sp. (3 phân lập được sử dụng có được

xác định là có thể xảy ra V. harveyi), Vibrio paraheae-

235Dis Aquat Org 60: 233-240, 2004

molyticus, Vibrio vulnificus, Vibrio penaecidia, và

Alginolyticus Vibrio đã được sử dụng trong một khảo nghiệm D-IB để kiểm tra

cho phản ứng chéo của kháng thể đơn dòng. Các vi khuẩn Vibrio sp.

Aeromonas sp, và Spiroplasma sp. vi khuẩn đã được tất cả

phân lập vi khuẩn từ bộ sưu tập văn hóa của

Nuôi trồng thủy sản Bệnh học Phòng thí nghiệm, Đại học của Ari

zona. Các vi khuẩn Vibrio sp. và Aeromonas sp. phân lập có

được xác định bằng cách sử dụng các dải thử nghiệm API-NE và Gram

vết bẩn để hỗ trợ trong quá trình nhận dạng. Spiro-

plasma sp. và Campylobacter sp. được sử dụng cho qua phản ứng-

nghiên cứu tivity khảo nghiệm D-IB được thu hoạch từ

tinh khiết trong ống nghiệm cấy vi khuẩn được thu thập, phân lập ở của chúng tôi

cơ sở, và xác định thông qua PCR và di truyền

trình tự tại cơ sở trình tự ADN Core.

Đại học Arizona. Các nghiên cứu IHC được tất cả mỗi

hình thành bằng cách sử dụng thành lập các mẫu bị nhiễm bệnh đã được

xác nhận của các tổn thương ISH và đặc trưng trong thói quen

phương pháp mô học (Lightner 1996). Các vi khuẩn

các tế bào đã được nạp vào các tấm nitrocellulose

(Maha tấm, Millipore) theo cách thức giống như

tinh khiết NHP-B. Các kháng thể đơn dòng cũng được thử nghiệm bởi IHC

sử dụng trường hợp xác nhận (từ bộ sưu tập của Aquacul

Phòng thí nghiệm trồng thủy Bệnh Học, Đại học Arizona)

tôm bị nhiễm một loại vi khuẩn rickettsia giống như

tôm, Vibrio sp, sp Spiroplasma. (Nunan et al.

2004). Tích cực kiểm soát các mẫu từ NHP tích cực

tôm và tiêu cực điều khiển từ mẫu SPF

tôm được chạy đồng thời.

KẾT QUẢ

Kính hiển vi điện tử truyền NHP-B

NHP-B chuẩn bị tinh khiết đã được hình dung bằng cách

TEM sử dụng 2% PTA vết tiêu cực (Hình 1). Sau khi

TEM xác nhận rằng thanh lọc sản xuất A

sạch sẽ chuẩn bị các vi khuẩn NHP còn nguyên vẹn, mẫu

được sử dụng như là các immunogen cho việc chuẩn bị của

các kháng thể đơn dòng và là kháng nguyên để sử dụng trong xét nghiệm D-IB.

MAB sản xuất

Trước nỗ lực để sản xuất kháng thể đơn dòng để NHP sử dụng

vi khuẩn có nguồn gốc nhũ hoá còn nguyên vẹn trong tá dược tổng hợp

kết quả trong các kháng thể phản ứng với sinh vật

chỉ dưới hình thức bản địa của nó, và hybridomas không

ổn định. Đó là có thể xảy ra rằng các kháng thể này phản ứng

lipid, glycoprotiens, và / hoặc carbohydrate có trong

NHP-B thành tế bào (Kraus et al 2001), kể từ khi

phương pháp khai thác sử dụng Triton X-100 để phá vỡ

bức tường tế bào, và được biết đến để giải phóng chất béo, carbohy

drates và glycoprotein. Để giảm bớt vấn đề này, một

khai thác freon được hợp nhất, để loại bỏ hoặc

làm cạn kiệt các chất béo, glycoprotiens và / hoặc carbohydrate

(Priest et al 2001). NHP-B sau đó biến tính

sôi và hỗn hợp của bản địa và biến tính

NHP-B đã được sử dụng cho tiêm chủng của những con chuột.

Kháng thể có được phản ứng với cả hai nguyên vẹn và Dena

đèn pha hình thức NHP-B và kết quả hybrido

mas có xu hướng được rất ổn định. Một số hybridoma

dòng vô tính, sản xuất kháng thể đơn dòng có phản ứng.

NHP-B trong D-IB và IHC, đã được lựa chọn cho các tiểu-nhân bản

và đặc tính. Các dòng vô tính, 3D6 được chỉ định và

4A2, đã được chọn để phát triển. Cả hai kháng thể đơn dòng 3D6

và 4A2 phản ứng trong các xét nghiệm D-IB để bản địa và Dena

đèn pha tinh khiết NHP-B và IHC trong các mô cố định

bộ phận của tôm bị nhiễm bệnh NHP-B. MAbs 3D6 và

4A2 đã isotyped và tìm thấy được IgG3, k.

Dot-immunoblot phân tích

Trong quá trình kiểm tra ban đầu, 96 giếng còn

taining hybridomas đang phát triển đã được kiểm tra

chống lại cả hai bản địa còn nguyên vẹn và biến tính tinh khiết

NHP-B. Các kháng thể không phản ứng hoặc phản ứng

chỉ có 1 trong các hình thức kháng nguyên không evalu

ated hơn nữa. Kháng thể phản ứng với cả hai bản địa và

236

Hình 1. Truyền hiển vi điện tử (TEM) tinh khiết

hoại tử các vi khuẩn hepatopancreatitis (NHP-B), và tiêu cực

màu với axit phosphotungstic 2% (PTA). NHP-B

dạng xoắn ốc với 8 roi trên đỉnh cơ bản như mô tả của

Lightner (1996) đã quan sát sinh vật duy nhất trong

TEM. Quy mô thanh = 0,5 μmBradley-Dunlop et al: Chẩn đoán của NHP kháng thể đơn dòng

kháng nguyên B biến tính NHP

lựa chọn để điều tra thêm bằng cách IHC

(Hình 2). Trong khảo nghiệm D-IB, hybridoma

chất lỏng bề đã được thử nghiệm mà không có

tập trung và phản ứng

ghi trên một thang điểm từ cường độ ngày càng tăng

(1-4). MAbs Một số phản ứng

mạnh mẽ trong các xét nghiệm đối với cả hai kháng nguyên,

với một phản ứng 3-4 cấp (Bảng 1).

Mô miễn dịch

IHC được thực hiện trên 4 mm dày

mô phần. Tình trạng bệnh của

tôm bị nhiễm bệnh được sử dụng cho các mô này

phần đã được xác nhận bởi demonstra

tion của sự hiện diện hay vắng mặt của

đặc điểm tổn thương bằng cách sử dụng thường xuyên của anh

phương pháp tological với liên tiếp

phần (Lightner 1996). Các mô hình

phản ứng bằng cách sử dụng các kháng thể đơn dòng tương tự như rằng thấy

sử dụng các thiết bị thăm dò gen cụ thể digoxigenin nhãn hiệu. Chỉ có

các khu vực thể hiện các tổn thương điển hình của NHP cấp

nhiễm trùng đã được đánh dấu bởi sự lắng đọng của MAB

và sau đó phát triển với các sinh màu

chất nền (Hình 3). Các phản ứng một cách dễ dàng hình ảnh

ized sử dụng kính hiển vi ánh sáng. MAbs Một số

kiểm tra trong các định dạng IHC sau khi thử nghiệm tích cực trong

khảo nghiệm D-IB, tuy nhiên, chỉ có kháng thể đơn dòng 3D6 và 4A2

phản ứng với phần mô bị nhiễm bệnh NHP-B

(Bảng 1). Những kháng thể đơn dòng đã không phản ứng với mô giây

tions chuẩn bị từ SPF tôm (Bảng 2). Những người

Kháng thể đơn dòng đã không phản ứng trong các IHC đã không lông

có đặc trưng (Bảng 1). Thủ tục IHC

ít hơn 4 giờ để hoàn thành một lần mô là sectioned

lên slide kính hiển vi. Thời gian parafin, định hình

nhúng và cắt của các mô, tuy nhiên,

yêu cầu thêm khoảng 48 h trước khi phản ứng với

MAB.

MAB đặc

Một số chế phẩm phân lập vi khuẩn,

bao gồm cả một loại vi khuẩn rickettsia giống như

penaeid tôm, Aeromonas sobria, rẻ tiền

lobacter sp, Spiroplasma sp, vi khuẩn Vibrio sp. (3

phân lập đó đã được sử dụng đã được xác định

như có thể xảy ra V. harveyi), Vibrio paraheae

molyticus, Vibrio vulnificus, Vibrio penae

cidia, và vi khuẩn Vibrio alginolyticus, đã được thử nghiệm.

Aeromonas sp, Vibrio sp, Campylobacter.

sp. và Spiroplasma sp. đã được sàng lọc trong D-

IB cho phản ứng chéo. Trong các khảo nghiệm D-IB,

Kháng thể đơn dòng đã chứng minh không có phản ứng với tinh khiết

nền văn hóa của các vi khuẩn này, trong cả hai bản địa hoặc

các quốc gia biến tính (Bảng 2). Tương tự như vậy, trong

D-IB xét nghiệm kháng thể đơn dòng đã không phản ứng với lysed

HP đình chỉ từ SPF (không bị nhiễm bệnh)

tôm, trong khi các kháng thể đơn dòng đã phản ứng tích cực với

bản địa và biến tính NHP-B khi

kiểm tra (Bảng 2). Một số loài quan tâm

không thể được kiểm tra cho phản ứng chéo D-

IB kể từ khi nền văn hóa thuần túy không có sẵn.

Như vậy, các kháng thể đơn dòng đã được sàng lọc bởi IHC

237

Bảng 1. Đặc điểm của các kháng thể chọn đơn dòng (MABs) hoại tử

hepatopancreatitis vi khuẩn (NHP-B). Isotypes globulin miễn dịch đã được xác

khai thác sử dụng một bộ que thăm subtyping chuột. Trong khảo nghiệm (D-IB) dot-immunoblot,

hybridoma chất lỏng bề đã được thử nghiệm mà không cần tập trung. Kháng thể đơn dòng được

chiếu tại các xét nghiệm D-IB chống lại cả hai bản địa và biến tính NHP-B. MAB

phản ứng bình đẳng theo cả hai điều kiện tự nhiên và biến tính và được

ghi trên thang điểm của cường độ ngày càng tăng (1-4). Trong các mô miễn dịch

Khảo nghiệm (IHC), các chất lỏng bề hybridoma đã được thử nghiệm sau khi các tế bào hybridoma

đã được gỡ bỏ từ chất lỏng bề. NA: không được đánh giá vì thiếu

phản ứng trong IHC

Hybridoma / MAB Immunoglobulin phản ứng NHP phản ứng

chỉ isotype trong dot immunoblot NHP trong IHC

Native biến tính

3D6 IgG (g3k) 4 +4 +4

4A2 IgG (g3k) 3 +3 +4

2C1 NA +2 2 0

3B2 NA 4 2 0

3B4 NA 3 0 +1

3B6 NA 4 2 0

4C1 NA 4 0 0

Hình 2. Dot-immunoblot sàng lọc ban đầu để chọn hybridomas lại

hoạt động để NHP-B. Bốn tấm 24-cũng đã được khảo nghiệm trên một nitrocel 96-cũng-

lulose tấm. Mỗi góc phần tư của tấm 96-cũng tương ứng với 24,

hybridoma tấm. Phía dưới bên trái của giếng mỗi có chứa biến tính tinh khiết

NHP-B, trong khi phía trên bên phải của mỗi cũng có nguồn gốc tinh khiết NHP-B.

Lựa chọn tế bào đã được thực hiện dựa trên phản ứng đối với cả hai biến tính

bản địa mẫu

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

Một

B

C

D

Một

B

C

D

1

3

2

4Dis Aquat Org 60: 233-240, 2004

bằng cách sử dụng các mô từ tôm bị nhiễm những vi khuẩn này.

Tôm đã được xác nhận trước đó bởi ISH

cụ thể các đầu dò cho các vi khuẩn rickettsia như, Spiro

sp huyết tương, vi khuẩn Vibrio sp, và kiểm soát tiêu cực SPF sam-

ples đã thể hiện được tiêu cực (Bảng 2). Các IHC

NHP-B phần mô bị nhiễm bệnh đã được tích cực với

cả hai kháng thể đơn dòng.

THẢO LUẬN

Mục đích của nghiên cứu này là phát triển các kháng thể đơn dòng để

NHP-B và kiểm tra chúng đặc NHP-B bằng cách sử dụng

định dạng xét nghiệm khác nhau. Một chiến lược đã được lựa chọn

tiêm chủng của những con chuột để có được kháng thể đơn dòng sẽ

phản ứng chống lại nguyên vẹn và biến tính protein của

vi khuẩn. Lý do có kháng thể đơn dòng

rằng họ có thể được sử dụng để chẩn đoán nhanh chóng của

NHP trong các mẫu lâm sàng. Các hybridomas ban đầu

kiểm tra bằng cách sử dụng một xét nghiệm D-IB kết hợp cả hai

bản địa và biến tính kháng nguyên B NHP. Phương pháp này

và những người khác tương tự như nó đã được mô tả trước đây

(Poulos et al 1999, Nadala & Loh 2000). Các kháng thể đơn dòng

được lựa chọn theo phương pháp D-IB sau đó được chiếu bởi IHC

để chọn những kháng thể đơn dòng có thể phát hiện NHP-B ủng hộ

teins trong các mô của tôm sau khi họ đã được cố định

và biến tính. Các kháng thể đơn dòng đã được sàng lọc qua

phản ứng với các vi khuẩn khác có thể lây nhiễm sang tôm

sử dụng các nền văn hóa thuần túy trong các xét nghiệm D-IB và / hoặc bằng cách thực hiện

ing IHC trên phần mô bị nhiễm. Các sinh vật,

bao gồm cả một loại vi khuẩn rickettsia như tôm, Vibrio

sp, Aeromonas sp, Campylobacter sp., và Spiro

plasma sp, tất cả các xét nghiệm âm tính bằng cách sử dụng kháng thể đơn dòng 3D6.

4A2, cho thấy đặc trưng mạnh mẽ của các kháng thể đơn dòng

NHP-B.

Các vi khuẩn được lựa chọn màn hình mAbs cho Speci-

ficity đã được lựa chọn vì nhiều lý do. Rick-

ettsia-như vi khuẩn của tôm đã được thử nghiệm qua phản ứng-

238

Hình 3. Mô miễn dịch bằng cách sử dụng AFA cố định của Davidson

phần mô từ tôm bị nhiễm bệnh với NHP-B. (A) phản ứng

MAB 4A2 với NHP-B mô bị nhiễm bệnh (HP) gan tụy.

Các mô hình nhuộm màu đã xuất hiện đốm. (B) cụ thể

-miễn phí tiêu cực kiểm soát mầm bệnh HP mô, trong đó cả hai

kháng thể được gộp lại và đặt trên mặt cắt. (C)

phản ứng của MAB 3D6 với mô NHP-B bị nhiễm HP có

mô hình nhuộm màu đồng nhất. Thanh quy mô = 20 mm

Bảng 2. Đặc trưng của các kháng thể đơn dòng chống NHP (3D6 và 4A2)

chống lại tinh khiết chuẩn bị vi khuẩn được xác định bởi D-IB

hoặc xét nghiệm IHC sử dụng chất lỏng bề unconcentrated,

hybridoma tế bào loại bỏ. Phản ứng được cho điểm trên thang điểm từ

tăng cường độ (1-4, 0 = phản ứng tiêu cực). NT = không

thử nghiệm vì không có sẵn. SPF: cụ thể tác nhân gây bệnh miễn phí

Vi khuẩn D-IB IHC

3D6 4A2 3D6 4A2

SPF 0 0 0 0

NHP vi khuẩn +4 +4 +4 +4

Campylobacter sp. 0 0 0 0

Rickettsia giống như vi khuẩn NT NT 0 0

Spiroplasma sp. 0 0 0 0

Vibrio sp. 0 0 0 0

Aeromonas sp. 0 0 NT NTBradley Dunlop et al. Chẩn đoán NHP bởi các kháng thể đơn dòng

tivity mAbs bởi vì, như NHP-B, nó cũng là một

trong tế bào vi khuẩn lây nhiễm tôm penaid. Các

NHP-B đã được mô tả như là một rickettsia như

vi khuẩn (Loy et al 1996) bị nhiễm HP

penaid tôm, làm cho sinh vật này một ứng cử viên

qua phản ứng. Các vi khuẩn Vibrio sp. đã được lựa chọn cho Speci-

ficity thử nghiệm bởi vì vi khuẩn Vibrio spp. là một phần bình thường

hệ thực vật cũng như là tác nhân gây bệnh cơ hội của

tôm có liên quan đến đồng thời

nhiễm trùng với NHP-B. Campylobacter sp. được

được lựa chọn bởi vì nó là một loại vi khuẩn nội bào rằng

sở hữu roi có thể có kháng nguyên tương tự như

những người trên roi của NHP-B. Các Spiroplasma

sp. có thể có mặt trong tôm nuôi trong cùng thời

mùa và trong cùng một vùng địa lý

NHP-B xảy ra (Nunan et al 2004). Các kết quả sau khi

thử nghiệm đã chứng minh đặc trưng của 3D6 kháng thể đơn dòng và

4A2 để B-NHP.

Mặc dù một số kháng thể đơn dòng đã được xác định để tiếp tục

kiểm tra, chỉ có 2 (3D6 và 4A2) đã được lựa chọn cho phát triển

thuận bởi vì hybridomas sản xuất các kháng thể đơn dòng

chứng tỏ được tính ổn định cao trong nền văn hóa. Cả hai 3D6

4A2 isotyped và tìm thấy là IgG (g3k). Lãi

ingly, IgG (g3k) isotypes có xu hướng phổ biến trong thân

duction kháng thể đơn dòng có nguồn gốc từ protein ruột, và

NHP-B là một tác nhân gây bệnh đường ruột của tôm penaid. Các

isotype IgG (g3k) thường bắt nguồn từ ổn định

hybridomas và có xu hướng phản ứng như một kháng thể mạnh mẽ.

Ngoài ra, IgG (g3k) isotypes dễ dàng tinh khiết,

yêu cầu điều kiện rất nhẹ, làm cho họ ít

dễ bị tổn thương đến sự biến tính kết quả cao desir

kháng thể có thể sử dụng trong xét nghiệm chẩn đoán.

Sự phát triển của đơn giản, nhạy cảm và nhanh chóng

định dạng khảo nghiệm để phát hiện bệnh tôm là một

tiếp tục mục tiêu. Mặc dù việc sử dụng các đầu dò gen và

Kỹ thuật khuếch đại DNA đã được cung cấp có giá trị

định dạng thử nghiệm, công nghệ nói chung là tốn kém,

đánh giá cao kỹ thuật, không nhanh, và không tuân theo lĩnh vực

điều kiện. Việc sử dụng kháng thể để phát hiện

bệnh tôm như một thay thế cho thiết bị thăm dò gen và

các phương pháp khác đã chậm tiến độ vì

những khó khăn liên quan đến sản xuất của họ. Điều này

đã được chủ yếu là do số lượng hạn chế của Puri

fied kháng nguyên có sẵn để chủng ngừa và thử nghiệm,

cũng như số lượng thời gian thường được yêu cầu

phát triển các kháng thể đơn dòng. Tuy nhiên, bất chấp những vấn đề này,

Kháng thể đơn dòng đang được phát triển bởi phòng thí nghiệm khác nhau để

penaid tác nhân gây bệnh khác nhau vì những lợi thế

cung cấp hơn phương pháp.

Việc thử nghiệm kháng thể định dạng được sử dụng trong nghiên cứu này (IHC

và D-IB) là cả hai nhanh chóng và đơn giản để thực hiện

hơn so với hầu hết các xét nghiệm phân tử. Các thử nghiệm D-IB như được mô tả

ở đây là đủ nhạy cảm để phát hiện NHP-B trong lâm sàng

mẫu tôm bằng cách sử dụng một phương pháp phát hiện trực tiếp.

Tương tự như vậy, một khi phần mô được chuẩn bị, IHC

phương pháp tương đối dễ dàng để thực hiện, nhanh chóng, và nó

yêu cầu không có thiết bị bổ sung hoặc đào tạo chuyên

ing. Các định dạng IHC thử nghiệm đã được lựa chọn để nghiên cứu ban đầu

vì số lượng lớn mẫu vật nhận được

phòng thí nghiệm này được cố định trong Davidson của AFA. Điều này

phương pháp bảo quản mẫu được sử dụng rộng rãi trong

nuôi tôm công nghiệp và là tương đối dễ dàng để mỗi

hình thức. Nếu dịch vụ mô học có thể truy cập.

nông dân, hoặc lĩnh vực chẩn đoán phòng thí nghiệm, sau đó chống

cơ thể phương pháp mô tả ở đây cung cấp một mức độ Speci

ficity rằng tiêu chuẩn mô học có thể không. Hơn nữa, IHC

là nhanh chóng hơn ISH với đầu dò gen. Phiên Dịch

các phản ứng IHC chỉ đòi hỏi việc sử dụng của ánh sáng

kính hiển vi và đào tạo tối thiểu trong việc xác định

của một phản ứng tích cực. IHC có thể là một bổ sung có giá trị cho

bình thường mô bệnh học khi xác định tác nhân gây bệnh còn-

firmation là cần thiết.

Hạn chế chính với phương pháp IHC là nó

một phương pháp gây chết người mà đòi hỏi rằng tôm được sac-

rificed để được kiểm tra. Công việc đang được tiếp tục để xác định

thay thế các loại mẫu vật có thể được sử dụng cho

phát hiện của sinh vật này trong các mẫu lâm sàng, đặc

biệt bằng cách sử dụng phương tiện không gây chết người (ví dụ như cho thử nghiệm có giá trị

bố mẹ cổ phiếu).

Tóm lại, các kháng thể đơn dòng mô tả ở đây được cụ thể,

cũng như nhạy cảm, để phát hiện của NHP. Những

Kháng thể đơn dòng có thể được sử dụng trong một loạt các định dạng và có thể

được áp dụng với các phương pháp chẩn đoán khác nhau, đặc

biệt kể từ hơn 1 MAB là có sẵn. Incorpo-

khẩu phần của các kháng thể đơn dòng trong một bộ dụng cụ chẩn đoán sẽ cung cấp

một phương pháp phát hiện nhanh chóng và đơn giản cho NHP,

có thể chứng minh hữu ích cho ngành công nghiệp nuôi tôm.

Lời cảm ơn. Hỗ trợ cho nghiên cứu này đã được cung cấp

Consortium biển Gulf Coast Phòng thí nghiệm nghiên cứu

Chương trình Nuôi tôm, CSREES, dưới cấp 2002-38808

01345 và cấp đặc biệt của Viện Thuỷ sản Quốc gia.

Các tác giả xin chân thành cảm ơn Rita M. Redman cho histolog-

ical cắt, Linda M. Nunan và Bonnie T. Poulos cho họ

hỗ trợ kỹ thuật.

TÀI LIỆU trích dẫn

Aguirre-Guzmán G, Ascencio Valle F (2000) truyền nhiễm dis-

dễ dàng trong các loài tôm nuôi trồng thủy sản tiềm năng. In: Pan-

Đức Đạt Lai Lạt SG (ed) Nghiên cứu gần đây phát triển trong microbiol-

ogy, Vol 4. Nghiên cứu biển hiệu, Kerala, p 333-348

Ghi chú Bangs Phòng thí nghiệm Công nghệ (1999) hạt trên phần còn lại.

Technote # 303 kiểm tra dòng chảy Lateral (p 1-6) và Technote

# 201 Làm việc với các vi cầu (p 1-16) (có sẵn tại:

www.bangslab.com)

Chuông TA, Lightner DV (1988) Một cuốn sổ tay của tôm bình thường

mô học. Xuất bản số đặc biệt 1. Thế giới Nuôi trồng thủy sản

Xã hội, Baton Rouge, LA

Bonami JR, Trumper B, Mari J, Brehelin M, Lightner DV

(1990) sạch và đặc tính của truyền nhiễm

hypodermal và tạo máu hoại tử virus của penaeid

tôm. J Gen Virol 71:2657-2664

239Dis Aquat Org 60: 233-240, 2004

Bonami JR, Mari J, Poulos BT, Lightner DV (1995) ký tự

ization của virus parvo như hepatopancreatic, một lần thứ hai

parvovirus bất thường gây bệnh cho tôm penaeid. J Gen

Virol 76:813-817

Bonami JR, Hasson KW, Mari J, Poulos BT, Lightner DV

(1997) hội chứng Taura của tôm biển penaeid: charac

terization của các đại lý virus. J Gen Virol 78:313-319

Frelier PF, Loy K, Kruppenbauch B (1992) lây truyền

hoại tử hepatopancreatitis in (Pennaus tôm thẻ chân trắng).

J Invertebr Pathol 61:44-48

Galfre G, Milstein C (1981) Chuẩn bị đơn dòng chống

các cơ quan: chiến lược và thủ tục. Phương Pháp Enzymol

73B :3-46

Một cuốn sổ tay của tôm bệnh lý và Lightner DV (1996)

thủ tục chẩn đoán cho bệnh của penaeid nuôi

tôm. Thế giới Nuôi trồng thủy sản Hiệp hội, Baton Rouge, LA

Appl môi trường Microbiol

sinh vật. Thế giới

(Tóm tắt)

phân phối. Thế giới

(Tóm tắt)

In:

240

Biên tập chịu trách nhiệm: Timothy Flegel,

Bangkok, Thái Lan