PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MỘT SỐ CHỈ TIÊU
VI SINH CƠ BẢN CỦA THỰC PHẨM
1.
ĐỊNH LƯỢNG VSV BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM
SỐ KHUẨN LẠC TRÊN MÔI TRƯỜNG ĐẶC
-
Đối với vsv đơn bào, ta có thể xem mỗi khuẩn lạc là kết
quả của sự phát triển từ một tế bào ban đầu
-
-
Ưu điểm: định lượng được tế bào sống
Nhược điểm: tốn nhiều thời gian, nhân lực
Pha loãng: tiến hành pha loãng mẫu với các độ pha loãng
khác nhau: 10-1, 10-2, 10-3 ...
55
Lê Minh Tâm - 2007
Tính kết quả:
Chú ý: chọn tất cả các hộp petri có số khuẩn lạc dao
động trong khoảng 25-250.
Trường hợp 1: chỉ có 1 hộp petri có số khuẩn lạc dao động
trong khoảng 25-250 (tất cả các hộp petri còn lại có số
khuẩn lạc dao động nằm ngoài khoảng trên)
Công thức tính:
Trong đó:
N
C1 C2
2d
N - số khuẩn lạc có trong 1mL mẫu huyền phù ban
đầu
C1,C2 - số khuẩn lạc đếm được trên 2 hộp petri ở độ
pha loãng đã chọn
d - hệ số pha loãng mẫu
Ví dụ: tính số khuẩn lạc có trong 1mL mẫu ban đầu, biết
số liệu thí nghiệm như sau:
56
Lê Minh Tâm - 2007
Đáp số: 3.102 khuẩn lạc/mL
Trường hợp 2: chỉ có 1 độ pha loãng với 2 hộp petri có số
khuẩn lạc dao động từ 25-250 (tất cả các hộp petri khác có
số khuẩn lạc nằm ngoài khoảng trên)
Công thức tính: tương tự như trên
Ví dụ: tính số khuẩn lạc có trong 1mL mẫu ban đầu, biết
số liệu thí nghiệm như sau:
Đáp số: ~1,4.106 khuẩn lạc/mL
Trường hợp 3: ở hai độ pha loãng liên tiếp, các hộp petri
có số khuẩn lạc dao động từ 25-250. Khi đó, ta phải tính
kết quả cho từng độ pha loãng.
3.1 Nếu kết quả thu được ở 2 độ pha loãng liên tiếp chênh
lệch nhau 2 lần hoặc nhỏ hơn, ta tính như sau:
57
Lê Minh Tâm - 2007
N
∑ C
(n1 0,1.n2 )d
Trong đó:
N - số khuẩn lạc có trong 1mL mẫu huyền phù ban đầu
C - số khuẩn lạc đếm được trên các hộp petri đã chọn
n1,n2 - số hộp petri ở hai độ pha loãng liên tiếp đã chọn
d - hệ số pha loãng mẫu
Ví dụ:
-
Ở độ pha loãng 10-2, số khuẩn lạc đếm được trên 2 hộp
petri là 151 và 215. Suy ra, số khuẩn lạc trong 1mL mẫu
ban đầu là:
151 215
2.10−2
1,8.104
khuẩn lạc/mL
-
Ở độ pha loãng 10-3, số khuẩn lạc đếm được trên 2 hộp
petri là 25 và 31. Suy ra, số khuẩn lạc trong 1mL mẫu ban
đầu là:
25 31
2.10−3
2,8.104
khuẩn lạc/mL
-
Vì chênh lệch giữa 1,8.104 và 2,8.104 không lớn hơn hai
lần, nên kết quả cuối cùng như sau:
N
151 215 25 31
(2 0,1.2).10−2
58
1,9.104 khuẩn lạc/mL
Lê Minh Tâm - 2007
3.2 Nếu kết quả thu được ở 2 độ pha loãng liên tiếp chênh
lệch nhau lớn hơn 2 lần: sử dụng độ pha loãng nhỏ hơn để
tính kết quả:
Ví dụ:
-
Ở độ pha loãng 10-2, số khuẩn lạc đếm được trên 2 hộp
petri là 180 và 250. Suy ra, số khuẩn lạc trong 1mL mẫu
ban đầu là:
180 250
2.10−2
2, 2.104
khuẩn lạc/mL
-
Ở độ pha loãng 10-3, số khuẩn lạc đếm được trên 2 hộp
petri là 60 và 75. Suy ra, số khuẩn lạc trong 1mL mẫu ban
đầu là:
60 75
−3
6,8.104 khuẩn lạc/mL
Vì chênh lệch giữa 2,2.104 và 6,8.104 lớn hơn 2 lần, nên ta
sẽ sử dụng độ pha loãng nhỏ hơn 10-2 để tính kết quả. Số
khuẩn lạc có trong 1mL mẫu ban đầu sẽ là 2,2.104
Trường hợp 4: tất cả các hộp petri đều có số khuẩn lạc nhỏ
hơn 25. Khi đó, ta sẽ chọn hệ số pha loãng thấp nhất để
tính kết quả:
Ví dụ: kết quả thí nghiệm thu được như sau:
59
Lê Minh Tâm - 2007
Chọn hệ số pha loãng thấp nhất là 10-1. Số khuẩn lạc có
trong 1mL mẫu ban đầu là:
N
20 15
2.10−1
; 1,8.10−2 khuẩn lạc/mL
Trường hợp 5: tất cả các hộp petri đều có số khuẩn lạc lớn
hơn 250. Khi đó, ta sẽ chọn hệ số pha loãng cao nhất để
tính kết quả:
Chọn hệ số pha loãng thấp nhất là 10-5. Số khuẩn lạc có
trong 1mL mẫu ban đầu là:
N
260 300
2.10−5
2,8.107 khuẩn lạc/mL
Trường hợp 6: không có khuẩn lạc nào mọc trên tất cả các
hộp petri. Khi đó, ta sẽ ghi kết quả là có ít hơn (1x 1 )
d
khuẩn lạc. Trong đó, d là hệ số pha loãng thấp nhất.
60
Lê Minh Tâm - 2007
Ví dụ: hệ số pha loãng mẫu lần lượt là 10-3, 10-5 và 10-7.
Sau khi nuôi cấy không thấy có khuẩn lạc nào phát triển
trên tất cả các hộp petri. Ta ghi kết quả như sau:
khuẩn lạc trong 1mL mẫu ban đầu.
2.
-
TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ TRONG TP
Đánh giá khái quát về tình trạng vệ sinh của thực
phẩm, dự đoán thời gian bảo quản của sản phẩm.
-
Tổng số VK hiếu khí cho phép có mặt trong sản phẩm
có thể thay đổi, cao nhất là 5.104 khuẩn lạc/g sản phẩm.
-
Sử dụng môi trường thạch tryptone glucose:
Tryptone
Chất chiết nấm men
Glucose
Thạch
Nước cất (định mức)
pH cuối
:
:
:
:
:
:
5g
2,5g
1g
15-20g
1L
7,0 0,2
Tiệt trùng môi trường ở 1210C trong thời gian 15 phút
-
Cách thực hiện:
•
Chuẩn bị mẫu: lấy 25g mẫu rồi cho vào bình xay
vô khuẩn. Cho tiếp vào bình xay 225mL nước peptone và
xay nhuyễn mẫu. Ta sẽ thu được dd huyền phù có độ pha
61
Lê Minh Tâm - 2007
loãng là 10-1. Sử dụng nước peptone để tiếp tục pha loãng
mẫu với các hệ số pha loãng là 10-2, 10-3 ...
•
Cấy mẫu: mẫu thực phẩm được nuôi cấy với ba độ
pha loãng khác nhau, sử dụng 2 hộp petri cho mỗi độ pha
loãng.
•
Nuôi cấy: mẫu được giữ trong điều kiện hiếu khí ở
nhiệt độ 300C-350C trong thời gian từ 48-72g.
-
Tính kết quả: tương tự như phương pháp định lượng
vi sinh vật trên môi trường đặc.
3.
-
TỔNG SỐ NẤM MEN VÀ NẤM SỢI TRONG TP
Tiến hành tương tự như phương pháp xác định tổng vi
khuẩn hiếu khí trong thực phẩm.
-
Sử dụng môi trường thách nấm men và nấm sợi (Yeast
and mould agar). Thành phần như sau:
Chất chiết nấm men
Chất chiết malt
Peptone
Dextrose
Thạch
Nước cất
pH cuối
:
:
:
:
:
:
:
3g
3g
5g
10g
20g
1L
6,2 0,2
Tiệt trùng môi trường ở 1210C trong thời gian 15 phút
62
Lê Minh Tâm - 2007
4.
-
SỐ BÀO TỬ TRONG GIA VỊ THỰC PHẨM
Có 2 giống bào tử thường gặp trong công nghệ thực
phẩm là Bacillus và Clostridium. Các loài thuộc giống
Bacillus thuộc nhóm hiếu khí bắt buộc hoặc kỵ khí tùy
tiện; còn các loài thuộc giống Clostridium thuộc nhóm kỵ
khí bắt buộc.
-
Chúng ta xác định số bào tử trong gia vị thực phẩm, ví
dụ như tiêu đen.
-
Phương pháp thực hiện:
•
Chuẩn bị mẫu: cân 1g tiêu đen cho vào erlen chứa
99mL peptone. Đặt erlen vào bể điều nhiệt ở 800C trong
thời gian 30 phút. Trộn thật đều mẫu và tiến hành pha
loãng.
•
Cấy mẫu: dùng phương pháp cấy mẫu trên môi
trường thạch trong hộp petri.
•
Nuôi cấy: đặt các hộp petri vào tủ ấm, nuôi kỵ khí.
Nuôi ở 350C trong 48-72g.
-
Tính kết quả: tương tự như phương pháp định lượng
vi sinh vật trên môi trường đặc.
63
Lê Minh Tâm - 2007
VỆ SINH CÔNG NGHIỆP
1.
-
KIỂM TRA VI SINH NGUỒN NƯỚC SẢN XUẤT
Trong thực tế sản xuất, nhà máy thường dựa vào 2 chỉ
tiêu cơ bản sau đây:
•
•
•
Tổng số vi khuẩn hiếu khí
Tổng số Coliform và Coliform phân
Dùng E. coli làm vi sinh vật chỉ thị
-
Một số khái niệm cơ bản:
•
Coliform là trên gọi chung để chỉ một nhóm vi
khuẩn G(-) thuộc họ Enterobacteriaceae.
•
Có những vi khuẩn thuộc nhóm Coliform không có
nguồn gốc từ phân
•
Điểm khác biệt giữa nhóm Coliform có nguồn gốc
từ phân là chúng có thể sinh trưởng ở nhiệt độ 440C.
-
Môi trường sử dụng: Desoxycholate, Mac Conkey,
Violet Red Bile Agar (VRBA)
Chú ý: kiểm tra E. coli bằng các thử nghiệm sinh hóa
(kiểm tra Indol-dương tính, Methyl red-dương tính,
Voges-Proskauer-âm tính, citrate-âm tính)
64
Lê Minh Tâm - 2007
2.
XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ NHIỄM VI SINH VẬT CỦA
KHÔNG KHÍ TRONG PHÂN XƯỞNG SẢN XUẤT
-
Sử dụng phương pháp đếm khuẩn lạc trên hộp petri
chứa môi trường thạch
-
Lấy mẫu không khí:
•
Phương pháp truyền thống: đặt các hộp petri trên
tại một vài vị trí trong phân xưởng. Tại mỗi vị trí trong
phân xưởng, sử dụng 2 hộp petri chứa môi trường thạch
tryptone glucose và 2 hộp petri chứa môi trường thạch
nấm men, nấm mốc. Thời gian mở nắp hộp để cấy vsv có
thể kéo dài đến 1g.
•
Dùng membrane để vi lọc không
khí: lọc không khí bằng membrane;
sau đó, đặt membrane vào hộp petri vô
khuẩn. Tiến hành tương tự như
phương pháp truyền thống.
-
Nuôi cấy: đối với các hộp petri chứa
môi trường thạch tryptone glucose, nuôi ở 370C trong thời
gian 24g; hộp petri chứa môi trường thạch nấm men nấm
mốc được nuôi ở 300C trong 48g.
65
Lê Minh Tâm - 2007
3.
-
XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ NHIỄM VSV CỦA THIẾT BỊ
Kiểm tra: các thiết bị chế biến, thiết bị chứa nguyên
liệu, bán thành phẩm, thành phẩm (nguyên liệu hoặc sản
phẩm đã bị nhiễm vi sinh vật).
-
Quy trình vệ sinh: rửa thiết bị bằng nước
→
rửa bằng
hóa chất (soude)
→
rửa bằng nước
→
rửa bằng dung dịch
có chứa chất diệt khuẩn
→
rửa lại bằng nước sạch
-
-
Thường kiểm tra chỉ tiêu: tổng số vi khuẩn hiếu khí
Lấy mẫu:
•
•
Sử dụng nước rửa thiết bị gieo cấy
Sử dụng miếng gạt để lấy mẫu bề mặt
66
Lê Minh Tâm - 2007
Trường Đại học Công nghiệp
thực phẩm TP.HCM
2010
THỰC HÀNH PHÂN TÍCH
VI SINH THỰC PHẨM
ThS. Lê Thùy Linh
Lưu hành nội bộ
0
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM
NỘI DUNG
Bài 1: Định lượng Coliforms và E. coli
1.1. Tóm tắt kiến thức cơ bản
1.2. Quy trình định lượng Coliforms và E. coli bằng phương pháp MPN
1.3. Cách tiến hành thí nghiệm
1.4. Cách tính kết quả
Bài 2. Định lượng Staphylococcus aureus
2.1. Tóm tắt kiến thức cơ bản
2.2. Quy trình định lượng Staphylococcus aureus bằng phương pháp MPN
2.3. Cách tiến hành và cách tính kết quả
Bài 3. Định tính Salmonella
3.1. Tóm tắt kiến thức cơ bản
3.2. Qui trình định tính Salmonella trong thực phẩm
Bài 4. Định lượng Bacillus cereus
4.1. Tóm tắt kiến thức cơ bản
4.2. Quy trình định lượng Bacillus cereus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
Bài 5. Định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí và tổng nấm men-nấm mốc
5.1. Tóm tắt kiến thức cơ bản
5.2. Quy trình phân tích
Trang
2
2
3
4
10
10
10
10
11
14
14
14
20
20
20
24
24
26
Tài liệu tham khảo
1. Trần Linh Thước, Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ
phẩm, NXB Giáo dục, 2006
2. http://www.microbelibrary.org
3. http://www.chromagar.com
4. http://www.rapidmicrobiology.com
5. http://www.marietta.edu
Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage: http://lethuylinh.weebly.com
Page|1
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM
Bài 1: Định lượng Coliforms và E. coli
1.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản
1.1.1 Định nghĩa
Hình 1: phát hiện Coliforms và E.
coli trong thực phẩm hay nước bằng
môi trường CHROMagar ECC
Coliforms là những trực khuẩn gram âm không sinh bào tử,
hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý, có khả năng lên men lactose sinh acid và
sinh hơi ở 370C trong 24 - 48 giờ. Coliforms được xem là nhóm vi
sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm, nước
hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện
diện của các loại vi sinh vật khác. Nhóm Coliforms gồm 4 giống là:
E. coli, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter. Tính chất sinh hóa
đặc trưng của nhóm này được thể hiện qua các thử nghiệm Indol (I),
Methyl Red (MR), Voges-Proskauer (VP) và Citrate (iC) thường được gọi là IMViC.
Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có khả năng lên men lactose sinh hơi
trong khoảng 24h khi ủ ở 440C trong môi trường canh EC.
Coliforms phân (Faecal Coliforms) là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh
indole khi ủ khoảng 24h ở 440C trong canh Trypton. E. coli là Coliforms phân cho kết
quả thử nghiệm IMViC là ++-- (Indol +, Methyl Red +, Voges-Proskauer -, Citrate -)
1.1.2 Phương pháp Most Probable Number (MPN)
Đây là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm
được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau. Thông thường, việc định lượng này được
thực hiện lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng 3 x 3 = 9 ống nghiệm.
Quy trình thực hiện như sau:
Pha loãng mẫu phân tích ở 3 nồng độ pha
loãng bậc 10 liên tiếp.
Ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp
Kết quả biểu kiến chứng minh sự tăng
trưởng của vi sinh vật cần kiểm định
Ghi nhận số lượng ống nghiệm dương tính
ở từng độ pha loãng. Tra bảng Mac Crady
Mật độ vi sinh vật MPN/100 ml hay MPN/1g mẫu
Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage: http://lethuylinh.weebly.com
Page|2
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM
Chú ý:
Đa số các bảng MPN cung cấp số liệu ở dạng số MPN trong 100ml dung dịch
được sử dụng để phân tích ở các liều lượng là 10ml, 1ml, 0.1 ml. Trên thực tế phân tích,
người ta thường dùng 1ml cho mẫu đã pha loãng 10-1, 10-2, 10-3. Lượng mẫu với các độ
pha loãng này tương đương với 1/100 lượng mẫu sử dụng theo bảng MPN/100ml tính
theo lượng mẫu là 10ml, 1ml, 0.1 ml nêu trên. Vậy số liệu của bảng MPN/100ml tính
theo lượng mẫu là 10ml, 1ml, 0.1 ml tương đương với MPN/ml mẫu chưa pha loãng khi
1ml của các dung dịch có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 được dùng để phân tích.
Trường hợp mật độ vi sinh vật quá cao, cần phải sử dụng loạt nồng độ pha loãng
tiếp theo cần phải nhân trị số tra bảng MPN nêu trên với hệ số pha loãng. Ví dụ: sử dụng
1ml cho mỗi độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4 tức là chỉ sử dụng 1/10 lượng mẫu ở mỗi nồng
độ so với trường hợp dùng 1ml mẫu ở các độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3. Do vậy, trị số tra
bảng MPN cần nhân thêm hệ số pha loãng là 10.
1.2 Quy trình định lượng Coliforms và E. coli bằng phương pháp MPN
Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãng mẫu để có độ
pha loãng 10-1, 10-2, 10-3...
Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 10ml canh
LSB, mỗi nồng độ có 3 ống lặp lại, ủ ở 370C, 48 giờ
Ghi nhận các ống LSB (+) (sinh hơi) ở mỗi nồng độ pha loãng
Cấy vào ống canh BGBL,
ủ ở 370C ± 10C, 48 giờ
Số ống (+)(sinh hơi )ở
Cấy vào ống canh EC, ủ
ở 44.50C ± 0.20C, 24 giờ
Số ống (+) ở mỗi độ pha loãng
mỗi độ pha loãng
Cấy lên thạch EMB, ủ ở 370C,
24 giờ
Coliforms
Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage: http://lethuylinh.weebly.com
Xem
trang
sau
Page|3
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM
Tiếp
theo
Chọn khuẩn lạc (tròn, dẹt hình đĩa và có
ánh kim xanh), cấy vào Trypton, MR-VP,
SC Citrate, ủ ở 44.50C ± 0.20C, 24 giờ
Thử nghiệm IMViC
Đếm số ống canh EC (+) và
IMViC ++--, tra bảng MPN
E. coli
1.3 Cách tiến hành thí nghiệm
Mẫu phân tích: nước mía nguyên chất (dùng 10ml cho một tổ)
1.3.1 Pha môi trường và khử trùng dụng cụ
Bước 1: pha môi trường
Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage: http://lethuylinh.weebly.com
Page|4
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM
Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage: http://lethuylinh.weebly.com
Page|5
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM
Bước 2: khử trùng dụng cụ và môi trường đã pha.
Bao gói dụng cụ và phân phối môi trường vào dụng cụ, gắn nút và bao gói. Hấp
tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút.
1.3.2 Cách tiến hành :
Bước 3: pha loãng mẫu
ống
mẫu
1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml
9ml
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 Độ pha loãng
Hình 2: quy trình pha loãng mẫu
Pha loãng mẫu thành 3 nồng độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3.
Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage: http://lethuylinh.weebly.com
Page|6
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM
Bước 4: Cấy mẫu vào canh LSB
Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 10ml canh LSB, mỗi nồng độ có 3
ống lặp lại, ủ ở 370C, 48 giờ.
Hình 3: Sơ đồ cấy mẫu từ các độ pha loãng
10-1
Bước 5: Định lượng Coliform và E. coli
Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage: http://lethuylinh.weebly.com
10-2
10-3
Page|7
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM
Hình 4: E.coli nuôi trên môi trường thạch EMB
cho khuẩn lạc màu kim xanh (theo Naowarat
Cheeptham, Thompson Rivers University,
Kamloops, BC, Canada)
Bước 6: thử nghiệm IMViC
Hình 5: Kết quả IMViC của Escherichia coli sau 24giờ ủ ở 37°C. (Anne Hanson, University of Maine, Orono)
Ống A: dương tính thử nghiệm indole trên môi trường tryptone. Xuất hiện lớp màu đỏ trên bề mặt môi
trường sau khi nhỏ thuốc thử Kovács.
Ống B: dương tính thử nghiệm methyl red xuất hiện màu đỏ của methyl red.
Ống C: âm tính thử nghiệm Voges-Proskauer biểu hiện qua sự không thay đổi màu sau khi cho thuốc
thử Barritt's A và Barritt's B.
Ống D: âm tính thử nghiệm citrate biểu hiện qua sự thay đổi màu sắc và không có khuẩn lạc trong ống
nghiệm.
a. Thử nghiệm Indol (I):
Nguyên tắc: Tryptophan là một acid amin có thể bị oxi hóa bởi một số vi sinh vật
có hệ enzyme tryptophanase tạo nên các sản phẩm chứa gốc indol. Việc phát hiện indol
được thực hiện bằng phản ứng của phân tử này với các thuốc thử chứa p-
Dimethylaminbenzaldehyde (p-DMABA) tạo nên một phức chất dạng quinone có màu
đỏ.
Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm này là nước
tryptone. Sinh khối chủng thuần được cấy vào môi trường lỏng tryptone, ủ ở nhiệt độ
370C trong 24-48 giờ. Bổ sung 1ml ether hoặc xylene vào ống nghiệm, lắc đều để chiết
Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage: http://lethuylinh.weebly.com
Page|8
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM
tách indol lên lớp dung môi hữu cơ. Nhỏ 5 giọt thuốc thử
vào ống dịch nuôi cấy, để yên vài phút, theo dõi sự tạo màu
đỏ trong lớp dung môi hữu cơ.
Đọc kết quả: (+) xuất hiện của lớp màu đỏ trên bề mặt
môi trường. (-) lớp màu vàng của thuốc thử. Đôi khi có sự
xuất hiện của màu cam do skatol, là tiền chất của methyl hóa
của indol, tạo ra.
Hình 6: thử nghiệm Indol
b. Thử nghiệm Methyl Red (MR):
Nguyên tắc: chỉ thị đỏ methyl red giúp phân biệt nồng độ H+ hiện diện trong môi
trường sau khi vi sinh vật lên men glucose. Chỉ thị này thay đổi màu như sau: pH
pH 5.0-5.8 màu cam; pH>6.0 màu vàng.
Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm này là môi trường
lỏng Glucose Phosphate (MR-VP Broth). Dùng que vòng cấy một lượng nhỏ khuẩn lạc
trên môi trường MR-VP, ủ ở 370C trong khoảng 2-5 ngày. Thêm vào vài giọt thuốc thử
đỏ methyl red (0.02% trong hỗn hợp cồn nước có tỷ lệ 3:2, bảo
quản ở 40C) vào trong ống nghiệm dịch nuôi cấy, đọc kết quả
ngay.
Đọc kết quả: (+) môi trường có màu đỏ sau khi bổ sung
thuốc thử. (-) khi có màu vàng. Trường hợp màu cam, cần tiếp
tục ủ ống môi trường có giống trong 4 ngày và thực hiện lại
Hình 7: thử nghiệm MR
thử nghiệm.
c. Thử nghiệm Voges-Proskauer (VP) (xem mục 3.3, bài 3)
d. Thử nghiệm Citrate (iC)
Nguyên tắc: sự biến dưỡng citrate bởi vi sinh vật sẽ tạo ra CO2 làm kềm hóa môi
trường. Mặt khác mọi VSV có khả năng sử dụng citrate làm nguồn carbon duy nhất đều
có khả năng dùng muối ammonium làm nguồn đạm duy nhất. Sự phân giải của muối
ammonium dùng làm nguồn đạm trong môi trường sẽ sinh NH3 làm kiềm hóa môi
trường. Sự gia tăng giá trị pH này được chỉ thị bằng sự đổi màu của chỉ thị pH trong môi
trường.
Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage: http://lethuylinh.weebly.com
Page|9
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM
Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm này là môi trường
lỏng SCA. Dùng que vòng cấy ria một lượng nhỏ khuẩn lạc lên
môi trường SCA rắn trong ống nghiệm thạch nghiêng, ủ ở 350C
trong khoảng 24-48 giờ.
Đọc kết quả: (+) khi xuất hiện khuẩn lạc và môi trường
chuyển sang màu xanh dương. (-) khi không có khuẩn lạc và môi
trường giữ nguyên màu xanh lục.
1.4 Cách tính kết quả
Hình 8: thử nghiệm Citrate
Từ số lượng các ống nghiệm có E. coli (+) ở mỗi độ pha loãng của mẫu, dùng bảng
MPN loạt 3 ống nghiệm ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp để tính ra mật độ vi sinh vật
trong mẫu và biểu diễn dưới dạng trị số MPN/ml mẫu ban đầu chưa pha loãng.
Bài 2. Định lượng Staphylococcus aureus
2.1. Tóm tắt kiến thức cơ bản
Staphylococcus aureus là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy ý,
hình cầu, gram dương, có thử nghiệm coagulase, phản ứng
DNAse, phosphatease (+) có khả năng lên men và sinh acid từ
mannitol, trehalose, sucrose. Tất cả các dòng S. aureus đều mẫn
cảm với novobiocine, có khả năng tăng trưởng trong môi trường
chứa đến 15% NaCl. Một số dòng có khả năng tăng trưởng làm
Hình 9: S. aureus trên BPA
tan máu trên môi trường thạch máu. S. aureus có thể nhiễm vào
thực phẩm qua con đường tiếp xúc với người thao tác trong quá trình chế biến thực phẩm.
Sự hiện diện với mật độ cao của S. aureus trong thực phẩm chỉ thị điều kiện vệ sinh và
kiểm soát nhiệt độ kém của quá trình chế biến.
2.2 Quy trình định lượng Staphylococcus aureus bằng phương pháp MPN
Phương pháp này được dùng để định lượng S. aureus trong mẫu có mật độ S. aureus thấp
nhưng mật độ vi sinh vật cạnh tranh cao.
Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage: http://lethuylinh.weebly.com
Page|10
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM
Đồng nhất mẫu và pha loãng mẫu thành các dãy nồng độ
thập phân 10-1, 10-2, 10-3...
Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 10ml canh
MSB, mỗi nồng độ có 3 ống lặp lại, ủ ở 370C, 48 giờ
Chọn ống (+) đục ở mỗi độ pha loãng
Ria lên đĩa thạch BPA, ủ ở 370C, 48 giờ
Chọn khuẩn lạc đặc trưng (tròn lồi, đen
bóng, có quầng trong và quầng sáng
xung quanh (đôi khi chỉ xuất hiện 1
trong 2 quầng))
Cấy vào TSA, ủ ở 370C ± 10C , 24 giờ
Thử nghiệm ngưng kết coagulase
Ghi nhận số coagulase (+) ở mỗi độ pha
loãng
Tra bảng MPN
Mật độ S.aureus
(MPN/g hoặc MPN/ml)
2.3 Cách tiến hành và tính kết quả
Mẫu phân tích: thịt heo sống, khối lượng 50g cho 1 lớp
Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage: http://lethuylinh.weebly.com
Page|11
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM
Bước 1: pha môi trường
Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage: http://lethuylinh.weebly.com
Page|12
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM
Bước 2: khử trùng dụng cụ và môi trường đã pha.
Bao gói dụng cụ và phân phối môi trường vào dụng cụ, gắn nút và bao gói. Hấp
tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút.
Bước 3: đồng nhất mẫu và pha loãng mẫu
Cân 10g mẫu trong túi PE vô trùng, thêm 90ml dung dich SPW, đồng nhất mẫu
bằng máy dập mẫu khoảng 30 giây. Pha loãng mẫu (xem bài 1, mục 1.3.2)
Bước 4: Cấy mẫu vào canh MSB
Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 10ml canh MSB, mỗi nồng độ có 3
ống lặp lại, ủ ở 370C, 48 giờ. (xem bài 1, mục 1.3.2). Chọn các ống (+) có vi sinh vật phát
triển làm đục môi trường để tiến hành phân lập khuẩn lạc đơn trên BPA
Bước 5: phân lập khuẩn lạc đơn trên BPA
Dùng kỹ thuật cấy ria lên đĩa thạch BPA, ủ ở 370C, 48 giờ.
Chọn khuẩn lạc đặc trưng :tròn lồi, đen bóng, có quầng trong và
quầng sáng xung quanh; đôi khi chỉ xuất hiện 1 trong 2 quầng (xem
hình 10).
Hình 10: hình dạng S. aureus trên BPA
Chọn khuẩn lạc đặc trưng của S. aureus trên BPA để thử nghiệm sinh hóa
coagulase
Bước 6: thử nghiệm sinh hóa coagulase
Nguyên tắc: các loài thuộc giống Staphylococcus có khả năng tiết ra môi trường
enzyme coagulase có tác dụng làm kết tụ các thành phần của huyết tương, tạo thành các
khối đông làm đông huyết tương.
Phương pháp tiến hành: Huyết tương người hay thỏ đông khô thương phẩm được
dùng cho thử nghiệm này. Cho vào ống nghiệm 0.5ml huyết tương người hay thỏ không
pha loãng, bổ sung 0.5ml dịch nuôi cấy chủng thuần hoặc một lượng lớn sinh khối khuẩn
lạc. Xoay nhẹ ống để trộn đều VSV. Ủ ống thử nghiệm ở 370C trong
4 giờ. Quan sát, ghi nhận sự ngưng kết mỗi 30 phút. Tiếp tục ủ đến
24 giờ nếu không thấy xuất hiện khối kết tụ.
Đọc kết quả: (+) có sự kết tụ; (-) không có sự kết tụ, hỗn hợp
vẫn đồng nhất
Hình 11: thử nghiệm coagulase. Ống trên (+); ống dưới (-)
Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage: http://lethuylinh.weebly.com
Page|13
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM
Bài 3. Định tính Salmonella
3.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản
Hình 12: Salmonella trên thạch XLD
Salmonella là trực trùng gram âm, hiếu khí và kị khí tùy
ý, có khả năng di động không tạo bào tử, lên men glucose và
mannitol sinh acid nhưng không lên men saccharose và lactose,
không sinh Indole, không phân giải ure, không có khả năng
tách nhóm amine từ tryptophane, hầu hết các chủng đều sinh
H2S.
Salmonella có thể phân tích định tính bằng mộ quy trình
gồm 4 bước: tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng
định. Salmonella thường có mặt trong mẫu với số lượng nhỏ, bị tổn thương và cùng hiện
diện chung với một số lượng lớn với các loài vi khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaceae
có tính cạnh tranh mạnh và ức chế sự tăng trưởng của Salmonella.
3.2 Quy trình định tính Salmonella trong thực phẩm
Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml môi trường tăng sinh
BPW, ủ ở 370C, 18-24 giờ
Cấy 0.1ml dịch tăng sinh sang môi trường tăng sinh chọn
lọc RV, ủ ở 420C, 18-24 giờ
Phân lập khuẩn lạc đơn trên ít nhất 2 môi trường chọn
lọc đặc biệt (XLD, HE, BS, SS...), ủ ở 370C, 24 giờ
Chọn các khuẩn lạc đặc trưng cho Salmonella, cấy sang
BHI hay TSA, ủ qua đêm
Thử nghiệm sinh hóa cho kết quả:
- Trên KIA/TSI: đỏ/vàng, có/không H2S, sinh hơi/không
- Urea (-); Indol (-); VP (-); LDC (+); ODC (+); Manitol
(+); Sorbitol (+)
Salmonella dương tính/
âm tính trong 25g mẫu
Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage: http://lethuylinh.weebly.com
Page|14
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM
3.3 Cách tiến hành và tính kết quả
Mẫu phân tích: cá hoặc ruột cá, khối lượng 25g cho 1 lớp
Bước 1: pha môi trường
Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage: http://lethuylinh.weebly.com
Page|15
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM
Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage: http://lethuylinh.weebly.com
Page|16
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM
Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage: http://lethuylinh.weebly.com
Page|17
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM
Bước 2: khử trùng dụng cụ và môi trường đã pha.
Bao gói dụng cụ và phân phối môi trường vào dụng cụ, gắn nút và bao gói. Hấp tiệt trùng
ở 1210C trong 15 phút.
Bước 4: Tăng sinh
Đối với các loại mẫu thông thường tiến hành cân 25g mẫu trong túi PE vô trùng,
bổ sung 225ml dung dịch BPW và đồng nhất mẫu bằng Stomacher trong 15 hoặc 30 giây.
Ủ ở 370C, 18-24 giờ. Đối với một số loại thực phẩm (mẫu gia cầm tươi sống, sữa khô,
các gia vị hay các loại thực phẩm chứa nhiều gia vị, casein, pho mát, bơ, sản phẩm chứa
cocoa, các sản phẩm của dừa) có chứa các chất có thể gây độc hoặc ức chế sự tăng trưởng
của Salmonella cần thực hiện quy trình tăng sinh đặc biệt (xem TLTK).
Bước 5: Tăng sinh chọn lọc
Lắc để trộn đều dịch tăng sinh, và chuyển 0.1ml sang 10ml môi trường tăng sinh
RV đã được ủ ấm 420C. Ủ ở 420C, 18-24 giờ. Khi cần thiết có thể kéo dài thời gian ủ
thêm 24 giờ.
Bước 6: Phân lập và nhận diện
Dùng que cấy vòng thực hiện kỹ thuật cấy phân lập khuẩn lạc đơn với giống từ
dịch tăng sinh chọn lọc lên đĩa môi trường chọn lọc phân biệt đặc trưng cho Salmonella
như XLD và HE. Biểu hiện của Salmonella trên từng môi trường như sau:
+ Môi trường XLD: khuẩn lạc có màu hồng trong suốt, có
hay không có tâm đen. Một số dòng Salmonella có thể có tâm đen
bóng rất lớn có thể chiếm gần hết khuẩn lạc.
Hình 14: khuẩn lạc Salmonella trên HE
Hình 13: khuẩn lạc Salmonella trên XLD
+ Môi trường HE: khuẩn lạc Salmonella có màu thay đổi từ
xanh dương đến màu xanh lục, có hay không có tâm đen. Một số
dòng Salmonella có thể có tâm đen bóng rất lớn có thể chiếm gần
hết khuẩn lạc.
Bước 7: Khẳng định
Từ mỗi môi trường chọn lọc phân biệt chọn và cấy chuyền ít nhất 5 khuẩn lạc nghi
ngờ sang môi trường không chọn lọc TSA. Ủ ở 370C, 18-24 giờ. Các khuẩn lạc xuất hiện
trên môi trường này được sử dụng cho các thử nghiệm sinh hóa như sau:
Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage: http://lethuylinh.weebly.com
Page|18
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM
+ Thử nghiệm sinh H2S trên môi trường KIA (Kligler Iron Agar): Môi trường KIA
được sử dụng để thử nghiệm khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau (glucose,
lactose) và khả năng sinh H2S.
Về nguồn carbon, môi trường KIA chứa 2 loại đường là 1% lactose và 0.1%
glucose. Khi cấy chủng vi sinh vật lên môi trường này có 3 trường hợp xảy
ra đối với sự tăng trưởng của VSV: chỉ sử dụng glucose, sử dụng glucose và
lactose, không sử dụng cả hai đường này. Salmonella chỉ lên men được
đường glucose vì thế phần nghiêng của môi trường có màu đỏ, phần sâu có
màu vàng. Thời gian ủ từ 18-24 giờ.
Về sinh hơi: đa số các dòng Salmonella đều có khả năng sinh H2S nên có
xuất hiện các vệt màu đen trong môi trường này. Có thể thấy hiện tượng
sinh hơi qua hiện tượng làm vỡ thạch môi trường hoặc môi trường bị đẩy
lên trên tạo một khoảng không bên dưới đáy ống nghiệm.
Hình 15: thử nghiệm KIA. Ống 1: môi trường KIA không có
VSV. Ống 2: xuất hiện màu vàng chứng tỏ VSV lên men
lactose tốt (lên men glucose cũng tốt). Ống 3: có sinh khí,
chứng tỏ lên men có sinh khí. Ống 4: màu đỏ trên phần thạch
nghiêng, màu vàng dưới đáy chứng tỏ VSV chỉ lên men
glucose. Ống 5: màu đen xuất hiện chứng tỏ có quá trình khử
lưu huỳnh và sinh H2S.
+ Thử nghiệm urea (-): được thực hiện trên môi trường
urea lỏng RSU (Rustigian - Stuart's Urea Broth), chứa chỉ thị
đỏ phenol, chuyển màu từ vàng sang đỏ (vùng chuyển màu là
pH 6.8-8.4). Dùng que cấy vòng cấy lượng sinh khối lớn từ
khuẩn lạc của chủng thuần vào ống chứa 3ml môi trường vô
trùng, lắc nhẹ ống để trộn đều vi khuẩn và ủ ở 370C trong 48
giờ. Salmonella không phân giải urea nên không làm thay đổi
pH môi trường; sau khi nuôi cấy môi trường vẫn giữ nguyên
Hình 16: kết quả thử nghiệm Urea
màu vàng cam.
+ Thử nghiệm VP (-): môi trường được sử dụng là môi
trường lỏng Clark-Lubs (môi trường MR-VP), pH 6.9. Dùng que
cấy vòng cấy vào các ống môi trường MR-VP một ít sinh khối từ
khuẩn lạc của chủng thuần đã ủ 18-24 giờ trên môi trường KIA.
Sau thời gian ủ, bổ sung thuốc thử trực tiếp vào ống môi trường.
Thuốc thử Barritt gồm dung dịch A là 5% α-naphthol trong cồn
Hình 17: kết quả thử
Biên nghin:mLê Thùy
Linh
Page|19
Homepage: http://lethuylinh.weebly.com
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM
tuyệt đối, dung dịch B là 40% NaOH hay KOH. Trước tiên nhỏ 6 giọt dung dịch A, sau
đó nhỏ 2 giọt dung dịch B. Đọc kết quả sau 20 phút hoặc chậm nhất 4 giờ. Salmonella
cho phản ứng âm tính với thử nghiệm VP có hiện tượng không đổi màu trên bề mặt môi
trường. Thử nghiệm VP (+) khi có màu đỏ trên bề mặt môi trường.
Bài 4. Định lượng Bacillus cereus
4.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản
B. cereus là những trực khuẩn, gram dương, hiếu khí và kỵ khí tùy ý, di động, tạo
nội bào tử, lên men glucose sinh hơi, phản ứng VP (+), có khả năng sử dụng nitrate. Loài
này tăng trưởng được trong khoảng nhiệt độ từ 50C - 500C, tối ưu ở 350C - 400C; pH dao
động từ 4.5-9.3, dễ tạo bào tử và bào tử nảy mầm rất dễ dàng. Trên môi trường chọn lọc
loài này tạo khuẩn lạc rất lớn, mọc lan, rìa nhăn.
4.2 Quy trình định lượng Bacillus cereus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
Cân 25g mẫu, đồng nhất trong 225ml BPW, đồng
nhất bằng Stomacher, độ pha loãng 10-1
Pha loãng đến các độ pha loãng 10-2, 10-3
Trãi 0.1ml mỗi độ pha loãng lên môi trường thạch
MYP, ủ ở 300C, 24 giờ
Chọn 5 khuẩn lạc có màu hồng eosin, lecithinase
dương tính (tủa lecithinase bao quanh khuẩn lạc)
cấy sang thạch nghiêng MYP, ủ ở 300C, 24 giờ
Nhuộm Gram và thử nghiệm sinh hóa như: lên
men glucose, thử nghiệm VP.
Kết luận B. cereus
Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage: http://lethuylinh.weebly.com
Page|20
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM
4.3 Cách tiến hành và tính kết quả
Mẫu phân tích: tôm khô, khối lượng 50g cho 1 lớp
Bước 1: pha môi trường
Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage: http://lethuylinh.weebly.com
Page|21
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM
Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage: http://lethuylinh.weebly.com
Page|22
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM
Bước 2: khử trùng dụng cụ và môi trường đã pha.
Bao gói dụng cụ và phân phối môi trường vào dụng cụ, gắn nút và bao gói. Hấp
tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút.
Bước 3: Pha loãng mẫu
Cho 25g mẫu vào túi PE, bổ sung 225ml môi trường BPW đồng nhất để có độ pha
loãng 10-1, đồng nhất bằng Stomacher trong 1 phút. Mẫu tiếp tục pha loãng thành 10-2,
10-3.
Bước 4: Phát hiện bằng môi trường chọn lọc
Trãi 0.1ml mỗi độ pha loãng trên môi trường thạch MYP, ủ ở
0
và kháng polymycin nên trên môi trường này khuẩn lạc B. cereus có
màu hồng eosin, được bao quanh bởi vùng có tủa chứng tỏ
lecithinase được tạo thành. Chọn 5 khuẩn lạc (+) cấy sang thạch
nghiêng để chuẩn bị cho các phản ứng khẳng định.
Bước 5: Các thử nghiệm khẳng định
Hình 18: khuẩn lạc B. cereus trên MYP
Hình 19: nhuộm gram B. cereus
-
Nhuộm Gram: nhỏ 1 giọt nước cất lên phiến kính sạch;
dùng que cấy vòng lấy 1 ít sinh khối vi khuẩn chuyển vào giọt
nước trên phiến kính, khuấy nhẹ. Cố định vệt bôi trên phiến kính
bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn. Nhỏ vài giọt methyl violet
lên vệt bôi, giữ yên 20 giây. Rửa sạch phẩm nhuộm bằng nước.
Nhỏ vài giọt dung dịch KI/I2 lên vệt bôi, để yên 1 phút. Rửa
bằng cồn 95% đến vừa mất màu. Rửa lại bằng nước. Nhuộm bằng dung dịch
safranin 30 giây. Rửa sạch bằng nước. Thấm nước dư bằng giấy lọc. Quan sát vi
khuẩn bằng vật kính 100X nhúng trong dầu, Gram dương có màu xanh tía, Gram
âm có màu đỏ hồng.
-
Thử nghiệm lên men glucose: cấy vi khuẩn vào 3ml canh PRG, ủ ở 350C, 24 giờ
trong điều kiện kỵ khí. Lắc ống nghiệm thật mạnh và quan sát sự phát triển thông
qua độ đục và sự chuyển màu từ đỏ sang vàng, chứng tỏ sự sinh acid từ glucose
trong điều kiện kỵ khí.
Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage: http://lethuylinh.weebly.com
Page|23
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM
Hình 20: thử nghiệm lên men glucose. Ống
a: đối chứng. Ống b: không lên men
glucose. Ống c: lên men yếu. Ống d: lên
men mạnh.
-
Thử nghiệm VP (xem bài 3)
Bài 5. Định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí và tổng nấm men-nấm mốc
5.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản
Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong
điều kiện có oxi phân tử. Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ
vệ sinh của thực phẩm. Chỉ số này được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc
trên môi trường thạch dinh dưỡng từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem 1 khuẩn lạc
là sinh khối phát triển từ 1 tế bào hiện diện trong mẫu và được biểu diễn dưới dạng số
đơn vị hình thành khuẩn lạc (colony forming unit, CFU) trong một đơn vị khối lượng
thực phẩm.
Nấm mốc là vi nấm dạng sợi, sinh sản bằng bào tử hoặc khuẩn ty. Nấm men là
những tế bào đơn tính phát triển theo kiểu nảy chồi, thỉnh thoảng có thể tồn tại ở dạng
khuẩn ty giả trong đó các tế bào kết nhau thành chuỗi. Đơn vị hình thành khuẩn lạc của
nấm mốc và nấm men là mầm để tạo nên một khuẩn lạc khi nuôi cấy trong môi trường.
Mầm có thể là một bào tử, một tế bào hay một đoạn của khuẩn ty. Trong thực phẩm, nấm
mốc và nấm men hiện diện có thể tăng trưởng làm thay đổi màu của thực phẩm, làm phát
sinh mùi hay vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cơ cấu của thực phẩm.
Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage: http://lethuylinh.weebly.com
Page|24
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM
5.2 Quy trình phân tích
Đồng nhất và pha loãng mẫu để có độ pha
loãng 10-1, 10-2, 10-3, 10-4...
Xác định tổng số VK hiếu
khí bằng kỷ thuật hộp đổ
Chọn 2 nồng độ pha loãng
thích hợp, chuyển 1ml mẫu
vào đĩa petri vô trùng (mỗi
nồng độ cấy 2 đĩa)
Rót vào mỗi đĩa petri 10-
15ml môi trường PCA đã
Xác định tổng số nấm men nấm
mốc bằng kỷ thuật hộp trải
Trải 0.1ml mẫu lên đĩa
DRBC, ủ ngửa đĩa ở
250C, 5-7 ngày (mỗi
nồng độ cấy 2 đĩa)
Đếm khuẩn lạc nấm
mốc, nấm men
được làm nguội đến 450C,
lắc cho mẫu phân tán đều
vào môi trường, ủ ở 300C
trong 72 giờ
Tính kết quả: tổng số vi
Chọn các đĩa có số khuẩn
lạc trong khoảng 25-250
khuẩn lạc/đĩa để đếm
sinh vật hiếu khí và tổng số
nấm men nấm mốc trong
mẫu (CFU/g hoặc CFU/ml)
5.3 Cách tiến hành thí nghiệm
Mẫu phân tích: nước mía nguyên chất (dùng 10ml cho một tổ)
1.3.1 Pha môi trường và khử trùng dụng cụ
Bước 1: pha môi trường
Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage: http://lethuylinh.weebly.com
Page|25
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM
Bước 2: khử trùng dụng cụ và môi trường đã pha.
Bao gói dụng cụ và phân phối môi trường vào dụng cụ, gắn nút và bao gói. Hấp
tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút.
Bước 3: pha loãng mẫu (xem bài 1, mục 1.3.2)
Bước 4: thực hiện như qui trình
Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage: http://lethuylinh.weebly.com
Page|26
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM
Cách tính kết quả
Đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ. Chọn số đĩa có số đếm
trong khoảng 25-250 để tính kết quả. Mật độ tổng vi khuẩn hiếu khí hay tổng số nấm men
nấm mốc được tính như sau:
Trong đó:n1 x V x f1 + ⋯ + ni x V x i
A: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn (hay nấm mốc nấm
men) trong 1g hay 1ml mẫu.
N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn
ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i
V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa
fi: độ pha loãng tương ứng.
Nếu ở độ pha loãng cao nhất, số khuẩn lạc đếm được trên một đĩa >250, ví dụ ở
nồng độ 10-5 số đếm lớn hơn 250, kết quả được ghi: >2.5 x 107 CFU/g.
Nếu ở độ pha loãng thấp nhất, số khuẩn lạc đếm được trên một đĩa
nồng độ 10-1 số đếm nhỏ hơn 25, kết quả được ghi:
Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage: http://lethuylinh.weebly.com
Page|27
Bạn đang đọc truyện trên: Truyen2U.Pro