PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GRAM

A.  NHẬN XÉT:

Nhuộm Gram là một phương pháp nhuộm kép và nhuộm tb đã chết. Với phương pháp này ta có thể phân biệt được chủng vk G -, G+ ; hồng cầu, bạch cầu và quan sát thấy sự tạo nội bào tử ở một số loài Vi khuẩn. Cụ thể:

·        Vk G -     : vách tb bắt màu hồng.

·        Vk G+     : vách tb bắt màu tím.

·        Hồng cầu : tb nhuộm màu hồng.

·        Bạch cầu  : tb nhuộm màu hồng, nhân tb nhuộm màu tím.

·        Bào tử vk không bắt màu, quan sát thấy tb như có lổ hỏng.

B.  PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN:

1)    Chuẩn bị:

·        Lam kính phải trong suốt, sạch và không dầu mỡ (dầu mỡ có thể nhuộm màu). Trước khi dùng ta ngâm lam trong cồn tẩy (như là hình thức khử trùng), khi sử dụng ta phải lau ráo và hơ khô. Có thể tẩy dầu mỡ bằng ete cồn.

·        Kính hiển vi quang học nền sáng, dầu soi để xem ảnh ở vật kính x100.

·        Nước cất, đèn cồn, giấy lọc, que cấy vòng, chậu rữa và giá nhuộm.

·        Dd tẩy màu    : cồn 96%( hoặc cồn 90%), cũng có thể dung cồn axeton.

·        Thuốc nhuộm: dd Crystal Violet, dd Lugol, dd Safranin hoặc dd Fucxin Ziehl.

·        Mẫu giống: sử dụng mẫu vk đã được nuôi cấy qua đêm để đảm bảo khả năng giữ màu thật tốt (vkG+ trửơng thành giữ mầu tốt hơn vk già). Có thể dùng mẫu giống ở dạng dịch thể ( nuôi cấy trong canh trường) hoặc ở dạng khuẩn lạc (nuôi cấy trên thạch).

2)    Thực hiện:

v Tạo tiêu bản vk:

·        Dung khuẩn lạc để làm vết bôi: lấy que cấy vòng khử trùng trên lửa đèn cồn rồi lấy hai giọt nước cất vô khuẩn nhỏ lên trên bề mặt của lam. Khử trùng que cấy lần hai rồi cũng dùng que cấy nầy phết một ít khuẩn lạc trên bề mặt thạch chấm vào giọt nước, trộn và dàn mỏng để tạo ra một vết bôi nhỏ.

·        Dùng canh trường để làm vết bôi: lấy que cấy vòng đã khử trùng trộn đều mẫu canh trong ống , sau đó lấy khoảng hai giọt canh nhỏ lên trên lam và cũng dàn mỏng để tạo ra một vết bôi nhỏ

·        Cố định vết bôi: bằng cách để khô tự nhiên hoặc hơ trên lữa đèn cồn( tránh hơ trực tiếp và quá lâu vì như thế có thể làm cho tb vk bị biến dạng). Mục đích: giúp cho vk bám chặt vào lam và cũng để giúp cho tb nhuộm màu tốt hơn.

v Nhuộm màu:

1.     Đặt tiêu bản vk lên trên giá nhuộm.

2.     Đặt miếng giấy lọc nhỏ lên trên vết bôi ( A ).

3.     Nhỏ dd Crystal Violet lên trên giấy, để 1 phút.

4.     Tẩy màu bằng nước cất đến khi thấy nước rữa trong là được, thấm khô vết bôi ( B ).

5.     ( A ).

6.     Nhỏ dd Lugol lên giấy, để 1 phút.

7.     ( B ).

8.     Tẩy màu tiếp bằng dd tẩy màu và cũng rữa đến khi thấy nước trong là được. Không nên rửa quá lâu.

9.     Rửa lại bằng nước cất và thấm khô (loại cồn ra khỏi vết bôi)

10.                        ( A )

11.                        Nhỏ dd Safranin hoặc Fucxin Ziehl lên giấy, để 1 phút

12.                        ( B )

13.                        Hơ khô

v Xem kính:

·        Nhỏ một giọt dầu soi lên trên vết bôi rồi đem đi xem ảnh ở vật kính x100

·        Chú ý: nếu rửa cồn qúa lâu có thể làm mất màu tím ở G+. Nếu không rửa cồn hoặc rửa không kĩ thì vẫn còn giữ màu tím ở G- (khuyến cáo 5 giây là đạt nhưng bên cạnh đó nó còn phụ thuộc vào độ dầy mỏng của vết bôi và lượng thuốc nhộm nhiều hay ít)

C.  CƠ CHẾ BẮT MÀU Ở VK G+ VÀ G-:

·        VKG+ : vách tb của vk G+ có cấu tạo gồm nhiều lớp peptidoglican, các axit teichoic và axit lipoteichoic. Các sợi peptidoglican liên kết chéo với nhau bằng cầu nối peptid, số liên kết chéo là rất nhiều. Kết quả là tạo ra một mạng lưới dầy, nhiều lớp, có các lổ lưới và khe lưới hẹp.Sự hiện diện của hai loại phân tử axit trên góp phần làm cho các lớp bện chặt vào nhau hơn và dính chặt vào màng sinh chất. Khi ta nhuộm bằng dd Crystal Violet (chứa cation màu ), các cation màu sẽ di chuyển qua các lổ lưới và dược định vị tại các khe lưới. Việc tẩy màu bằng nước chỉ nhằm tác dụng rửa trôi thuốc nhuộm ở phía ngoài vách mà không ảnh hưởng lớn lắm đến số lượng cation màu  nằm ở các lớp ngoài. Khi ta tiếp tục nhuộm bằng Lugol(chứa anion I-), thì các anion I- cũng di chuyển qua các lổ lưới để vào trong các khe và tại dây chúng bắt gặp các cation màu kết quả là hình thành một phức chất trung hòa điện tích. Phức chất màu tím này có kích thước lớn, tương đối bền và điều đó làm cho nó càng khó bị rửa trôi bởi nước. Việc tẩy màu tiếp bằng cồn sẽ giúp lôi nước ra khỏi vách tb. Việc mất nước sẽ làm cho cấu trúc của vách càng khép chặt lại giúp cho các phức chất khó bị rửa trôi. Tuy nhiên các phức chất nằm ở các lớp ngoài vẫn có thể bị rửa trôi nhưng rất ít, không ảnh hưởng lớn lắm đến sự bất màu tím của vách. Nếu ta rửa cồn quá lâu thì các phân tử cồn sẽ ngấm sâu vào các lớp bên trong khiến cho vách phồng lên làm nớ lỏng các lổ lưới và khe lưới dẩn đến các phức chất sẽ bị cuốn trôi theo dòng chảy của cồn. Kết quả lượng phức chất còn lại không đủ để cho vách biểu hiện ra màu tím , thay vào đó các khoảng trống sẽ đựơc lắp đầy bởi các phân tử safranin hoặc Fucxin Ziehl với một lượng lớn làm cho vách biểu hiện ra màu hồng thay vì phải là màu tím mới đúng.

·        VK G- : vách tb của vk G- có cấu tạo ít lớp peptidoglican hơn và điều đó làm cho nó không có khả năng giữ màu của phức chất.Tuy nhiên bên ngoài lớp peptidoglican còn có lớp màng ngoài bao bọc. Cấu tạo của lớp màng ngoài nổi bật gồm: bên trong là 1lớp photpholipid có khảm protein, bên ngoài là lớp lipid A liên kết với các phân tử lipopolisaccarid và điều này nghe như có vẽ sẽ làm tăng khả năng giữ màu của phức chất, nhưng có một điều là ở công đọan tẩy màu bằng cồn thì chính cồn đã làm tang lớp lipid A kéo theo cuốn trôi các phân tử lipopolisaccaric. Kết quả là các đầu ưa nước của lớp photpholipid sẽ tiếp xúc trực tiếp với cồn và cũng bị cuốn trôi theo cồn. Sự phân giải của lớp màng ngoài là nguyên nhân khiến cho lớp peptidoglican  bị mất màu của phức chất hoàn toàn, các khoảng trống sẽ được lắp đầy bởi các phân tử Safranin hoặc Fucxin Ziehl nên làm cho vách bắt màu hồng

·        Chú ý : lớp peptidoglican chỉ làm nhiệm vụ giữ màu chứ không nhuộm màu