Chương III NĂNG LƯỢNG HỌC

3.1. NĂNG LƯỢNG VÀ SỰ TRAO đỔI CHẤT 3.1.1. Năng lượng tự do Vật chất và năng lượng trong vũ trụ liên quan với nhau theo phương trình nổi tiếng của Anhxtanh: e = mc 2 ( e là năng lượng m là khối lượng và c là tốc độ của ánh sáng - là một đại lượng không đổi). Trong cuộc sống thì hai khái niệm năng lượng và vật chất tách biệt nhau. Vật chất chiếm một khoảng không gian nhất định và có trọng lượng - còn năng lượng, đó là khả năng gây ra những biến đổi vật chất, hoặc làm cho vật chất chuyển động, nghĩa là có khả năng sinh ra công. Năng lượng được xác định như khả năng sinh ra công có thể là nhiệt năng, năng lượng ánh sáng, điện năng, cơ năng hoặc hóa năng. Các nhà vật lý còn phân biệt động năng và thế năng. Thế năng là khả năng sinh ra công được xác định bỡi vị trí hoặc trạng thái của một vật thể. động năng là năng lượng chuyển động. Một hòn đá nằm trên dốc nó có một thế năng được xác định bỡi vị trí của nó, khi nó rơi xuống thì thế năng chuyển thành động năng. Người ta còn phân biệt ra năng lượng tự do, tức là năng lượng có khả năng sinh ra công trong điều kiện đẳng nhiệt và năng lượng không có khả năng sản ra công trong điều kiện đẳng nhiệt đó là entropi - trạng thái hỗn độn của năng lượng bên trong. Theo định luật bảo toàn năng lượng thì khối lượng chung của năng lượng trong bất kỳ một hệ thống cách ly nào là không đổi. Như vậy năng lượng tự do và entropi phụ thuộc lẫn nhau; tăng entropi trong quá trình không thuận nghịch kèm theo việc giảm năng lượng tự do. Năng lượng tự do là năng lượng có lợi - còn entropi là thước đo năng lượng không dùng được. Tất cả những quá trình vật lý và hóa học xảy ra với sự giảm năng lượng tự do cho tới khi mà chúng chưa đạt tới trạng thái cân bằng, trong đó năng lượng tự do của hệ thống là cực tiểu còn entropi là cực đại. 3.1.2. Oxy hóa khử Theo quan niệm hiện đại, quá trình mất điện tử hoặc proton (H) của phân tử chất nào đó gọi là sự oxy hóa, còn ngược lại: quá trình nạp điện tử hoặc proton của một phân tử chất nào đó gọi là sự khử. Chất nhường điện tử và proton gọi là chất bị oxy hóa, chất nhận điện tử và proton gọi là chất oxy hóa. SINH HỌC đẠI CƯƠNG 2007 TRANG 39 Sự oxy hóa và sự khử luôn luôn xảy ra đồng thời và liên hệ chặt chẽ với nhau thành một phản ứng oxy hóa khử thống nhất. 3.1.2.1. Phản ứng oxy hóa khử sinh học Cơ thể sinh vật oxy hóa các sản phẩm dinh dưỡng bằng oxy, chuyển hóa chúng thành CO 2 và H 2 O đồng thời sử dụng năng lượng giải phóng ra để đáp ứng nhu cầu hoạt động sống. Khi đó, hydro được giải phóng khỏi hợp chất hữu cơ và kết hợp với oxy kèm theo sự tỏa năng lượng. Phản ứng oxy hóa khử được tiến hành trong cơ thể sống với sự tham gia của những hệ enzyme đặc biệt - đó là phản ứng oxy hóa khử sinh học. Các quá trình oxy hóa khử sinh học thuộc loại các phản ứng dị hóa không những chỉ là nguồn năng lượng quan trọng dùng để thực hiện các phản ứng tổng hợp khác nhau, mà còn là nguồn cung cấp các hợp chất trung gian làm nguyên liệu cho các phản ứng tổng hợp và đóng vai trò hết sức quan trọng trong việc liên hợp các quá trình trao đổi chất. * Sự khác nhau giữa oxy hóa khử sinh học và oxy hóa khử thông thường: - Sự oxy hóa sinh học không phải là phản ứng phát nhiệt một giai đoạn như sự cháy mà là một chuỗi phản ứng - trong đó, năng lượng được giải phóng ra một phần dưới dạng nhiệt, còn phần lớn được tích lũy dưới dạng liên kết cao năng. - Quá trình oxy hóa sinh học luôn có enzyme xúc tác. - Khi đốt cháy các chất hữu cơ ở ngoài cơ thể, năng lượng giải thoát ra nhờ sự oxy hóa carbon đến CO 2 . Trong lúc đó, phản ứng oxy hóa từng bậc hydro đến H 2 O xảy ra trong quá trình oxy hóa sinh học ở cơ thể lại là phản ứng cung cấp năng lượng. Phản ứng oxy hóa này ở điều kiện thường là phản ứng nổ. 3.1.2.2. Thế oxy hóa khử Sự chuyển dịch điện tử có thể thực hiện được khi trong tế bào cơ chất có khả năng thu nhận điện tử, nghĩa là có ái lực đối với điện tử. Trong phản ứng oxy hóa khử, các chất tham gia phản ứng có ái lực đối với điện tử khác nhau. Chất nào có ái lực đối với điện tử lớn hơn thì chất đó là chất nhận. Người ta đo ái lực đối với điện tử cho từng chất trong mạch điện thế kế với điện cực chuẩn hydro có điện thế bằng không. đại lượng này phản ánh khả năng thu hay nhường điện tử, tức là khả năng oxy hóa khử của chất và được gọi là thế oxy hóa khử. SINH HỌC đẠI CƯƠNG 2007 TRANG 40 Thế oxy hóa khử có thể tính được theo phương trình sau: RT [dạng oxyhóa] E = Eo + ln nF [dạng khử] Trong đó: • E : Thế oxy hóa khử của một chất nhất định trong những điều kiện xác định • Eo: Thế oxy hóa khử ở các điều kiện tiêu chuẩn (nồng độ của hai dạng bằng nhau) • R : Hằng số khí (1,98 calo/ mol. ºC ) • T : Nhiệt độ tuyệt đối • n : Số điện tử được di chuyển • F : Số Faraday (95.500 culong/ptg hay 23,066 Kcalo/mol Thế oxy hóa khử còn có thể dùng để tính năng lượng tự do được giải phóng ra trong quá trình oxy hóa khử bằng phương trình sau: ΔG nF . ΔE Trong đó: ΔΔΔΔG : Năng lượng tự do ΔΔΔΔE : Hiệu thế oxy hóa khử của hai hệ 3.1.3. Năng lượng hoạt hoá đối với bất kỳ một phản ứng hóa học nào, thậm chí đối với phản ứng tỏa nhiệt với ΔG âm cũng có hàng rào năng lượng phải vượt qua trước khi phản ứng bắt đầu. Hàng rào năng lượng ấy gọi là năng lượng hoạt hóa. để làm tăng tốc độ phản ứng cần phải làm tăng năng lượng của phần lớn số phân tử trong quần thể để vượt qua hàng rào năng lượng. Năng lượng hoạt hóa càng cao, phản ứng càng khó thực hiện (tốc độ phản ứng càng nhỏ), ngược lại năng lượng hoạt hóa nhỏ, phản ứng dễ thực hiện (tốc độ phản ứng lớn). Các chất xúc tác có tác dụng làm tăng vận tốc phản ứng, như vậy chất xúc tác bằng con đường nào đó làm giảm năng lượng hoạt hóa của phản ứng. Chất xúc tác thực hiện được điều ấy bằng cách tạo thành phức hợp trung gian không bền vững với cơ chất, gây những biến đổi trong nội phân tử cơ chất làm cho cơ chất dễ dàng tham gia vào phản ứng và sau đó phức hợp ấy phân hủy thành sản phẩm của phản ứng và giải phóng chất xúc tác tự do 3.1.4. Enzyme 3.1.4.1. đại cương về enzyme SINH HỌC đẠI CƯƠNG 2007 TRANG 41 Enzyme là hợp chất protein có khả năng xúc tác đặc hiệu các phản ứng hóa học. Chúng có trong tất cả các tế bào của động thực vật và vi sinh vật, và thường được gọi là chất xúc tác sinh học. 3.1.4.2. Bản chất của enzyme Bản chất hóa học của enzyme là protein hay nói cách khác enzyme là những protein đặc hiệu làm nhiệm vụ xúc tác các phản ứng hóa sinh học trong cơ thể sống. 1,- Enzyme có đầy đủ mọi tính chất của protein: • Tính tan: đa số tan trong H 2 O, dung dịch muối lỏng, • Không bền đối với tác dụng của nhiệt độ, • Mất khả năng hoạt động nếu protein bị biến tính dưới tác dụng lý, hóa khác nhau, • Tính lưỡng tính - có thể phân tách bằng phương pháp điện di. 2,- Cấu trúc: Dựa vào cấu tạo phân tử enzyme người ta chia enzyme thành 2 nhóm: • Enzyme một cấu tử là những enzyme mà trong phân tử chỉ chứa protein. • Enzyme hai cấu tử: Là những enzyme mà ngoài protein, trong phân tử còn có chứa một nhóm ngoại không có bản chất của protein. Phần protein được gọi là Apoenzyme còn phần không phải protein được gọi là Coenzyme hay còn gọi là nhóm ngoại. Trong phân tử enzyme, phần protein và phần Coenzyme được liên kết chặt chẽ với nhau - Ví dụ: Enzyme 1 cấu tử như Pepxin, Amilaza, Ureaza, ... đối với các enzyme 2 cấu tử thì coenzyme trực tiếp tham gia phản ứng xúc tác, giữ vai trò quyết định kiểu phản ứng mà enzyme xúc tác còn apoenzyme có tác dụng nâng cao lực xúc tác của coenzyme và quyết định tính đặc hiệu của enzyme - Ví dụ enzyme 2 cấu tử như: Catalase, Peroxydase (2 enzyme này có nhóm ngoại giống nhau - nhân Hem.Fe ) nhưng phần apoenzyme khác nhau nên xúc tác 2 phản ứng hóa học khác nhau: Catalase: phân ly → 2 H 2 O 2 →→→→ 2 H 2 O + O 2 Peroxidase: phản ứng oxy hóa khử → 2 H 2 O 2 →→→→ 2 H 2 O + 2 O Trong nhóm enzyme 2 cấu tử, nhiều enzyme có coenzyme là những vitamin: • Coenzyme của aminotransferase là vitamin B 6 • Dehydrogenase hiếu khí chứa vitamin B 2 SINH HỌC đẠI CƯƠNG 2007 TRANG 42 • Dehydrogenase kỵ khí chứa vitamin PP 3,- Cấu trúc trung tâm hoạt động của enzyme: Trong quá trình xúc tác của enzyme có giai đoạn tạo thành phức enzyme cơ chất. Sự kết hợp đặc hiệu giữa enzyme và cơ chất chỉ xảy ra trên một phần xác định của phân tử enzyme. Phần của enzyme tham gia trực tiếp vào phản ứng để kết hợp vào cơ chất được gọi là trung tâm hoạt động của enzyme. • Ở các enzyme 1 cấu tử, trung tâm hoạt động của enzyme do 1 số nhóm chức của axit amin trong thành phần phân tử của enzyme phối hợp tạo thành (thông qua các cấu trúc bậc 2, 3, 4 mà các nhóm chức có điều kiện nằm kề nhau), các nhóm đó như : −OH, −SH, −COOH, ε−NH 2 , ... • Ở các enzyme 2 cấu tử, ngoài phần mạch polypeptit thực hiện nhiệm vụ kết hợp, đặc biệt tham gia vào việc tạo thành trung tâm hoạt động, còn có các nhóm chức của coenzyme hoặc nhóm ngoại của phân tử enzyme. • Ở một số enzyme, trong phân tử có thể chứa 2 hoặc nhiều trung tâm hoạt động - Ví dụ: Alcoldehydrogenase của nấm men có 4, của gan có 2 (tthđ). • Giữa các nhóm chức tham gia tạo thành tâm hoạt động của enzyme thường phân biệt các nhóm của" tâm xúc tác" tham gia trực tiếp vào hoạt động xúc tác của enzyme và các nhóm của " miền tiếp xúc" làm nhiệm vụ đảm bảo tính đặc hiệu của enzyme, nghĩa là sự kết hợp đặc hiệu để tạo thành phức E−S. Sự phân biệt này chỉ là tương đối vì lúc nào cũng có tác dụng tương hỗ. • Ngoài ra, ở một số enzyme còn có "tâm dị không gian"- là phần của enzyme, khi kết hợp với các chất có phân tử nhỏ nào đó thì cấu trúc bậc 3 của toàn bộ phân tử enzyme sẽ bị biến đổI dẫn đến làm biến đổi cấu trúc của tâm hoạt động, do đó kèm theo sự biến đổi hoạt tính của enzyme. • Ở một số loại enzyme còn tồn tại dưới dạng tiền enzyme (dạng không hoạt động được) gọi là các Zimogen, ví dụ: Pepxinogen, Tripxinnogen, Kimo tripxinogen, ... để chuyển chúng sang dạng hoạt động, phải qua quá trình hoạt hóa: quá trình này thường xảy ra sự đứt một số liên kết peptit trong phân tử zimogen. Loại bỏ đi đoạn peptit có tác dụng kìm hãm hoặc bao vây các nhóm hoạt động của enzyme - khi cắt bỏ đoạn peptit kìm hãm đi dẫn đến sự sắp xếp lại nội tại phân tử, hình thành trung tâm hoạt động. 3.1.4.3. Cường lực xúc tác của enzyme SINH HỌC đẠI CƯƠNG 2007 TRANG 43 Tốc độ của một phản ứng hóa học được xác định bởi giá trị của năng lượng hóa học (năng lượng dư thừa) mà các phản ứng phải có trên mức độ năng lượng tế bào của các phân tử để có thể phá vỡ các liên kết có trong chúng và sau đó có thể xuất hiện các loại mới. Năng lượng hóa học của phản ứng nào đó càng lớn, tốc độ của phản ứng sẽ càng nhỏ và ngược lại năng lượng hóa học càng nhỏ, tốc độ phản ứng hóa học sẽ càng lớn - như vậy, chất xúc tác bằng con đường nào đó làm giảm năng lượng hóa học của phản ứng hóa học. để có thể hình dung được cụ thể về sự sai khác của năng lượng giữa năng lượng tự do ở đầu và cuối phản ứng, chúng ta so sánh với thế năng của một vật nặng bất kỳ nào đó: nếu vật nặng này nằm ở sườn núi trong các hố thì lúc đầu phải nâng nó lên tới miệng hố để rồi sau đó khi lăn xuống thấp nó sẽ chuyển vào một hố khác đạt tới trạng thái ổn định.

I - Năng lượng hoạt hóa II - Sự thay đổi năng lượng tự do A - Phản ứng không có xúc tác B - Phản ứng có xúc tác - Chất xúc tác có tác dụng hạ thấp năng lượng hóa học → làm tăng vận tốc phản ứng (các chất xúc tác không ảnh hưởng đến trạng thái cân bằng của phản ứng). - Trong các phản ứng sinh học thì enzyme là những chất xúc tác. So với các chất xúc tác vô cơ thì enzyme có cường lực xúc tác mạnh hơn nhiều lần. Ví dụ như sự thủy phân đường mía: Bằng ion H + thì năng lượng hoạt hóa là 25.600 kcal / phân tử Bằng β−fructofuranolidase của nấm men : 9.400 kcal / phân tử Bằng β−fructofuranolidase của đại mạch: 13.000 kcal / phân tử 3.1.4.4. Tính tác dụng đặc hiệu của enzyme Khác với chất xúc tác vô cơ, enzyme chỉ tác dụng lên một cố cơ chất và kiểu nối hóa học nhất định trong phân tử: tính chất đó được gọi là tính đặc hiệu. Người ta phân biệt các dạng đặc hiệu sau: 1,- đặc hiệu quang học SINH HỌC đẠI CƯƠNG 2007 TRANG 44 Enzyme chỉ có khả năng tác dụng lên một dạng đồng phân quang học nhất định (hoặc là dạng D hoặc là dạng L, có thể là dạng Cis hoặc dạng Trans, ...). Ví dụ: Axit L-malic Trans axit fumaric Fumarathydeatase HOOC H H +H O 2 −H O 2 CH OH C C COOH COOH COOH CH 2

Axit L-malic Axit fumaric Fumarat- dehydeogenase HOOC CH CH CH OH COOH COOH COOH CH 2

Enzyme này không tác dụng lên dạng D của axit malic - vì trung tâm hoạt động của enzyme có cấu trúc tương ứng với cơ chất dạng đồng phân L (tạo E−S). Theo thuyết đa ái lực của Berman và Fruton trong cơ chế đặc hiệu quang học là E phải kết hợp với cơ chất ít nhất ở 3 điểm. 2,- đặc hiệu tuyệt đối Enzyme chỉ có khả năng tác dụng lên một cơ chất nhất định: COOH Thay Dạng este L arginin − L ornitin − U rê Argininase NH NH H O 2 C CH C O COOH CH NH 2 NH 2 NH 2 NH 2 (CH ) 2 3 (CH ) 2 3 NH 2 COOCH 3 NH 2

SINH HỌC đẠI CƯƠNG 2007 TRANG 45 Trong trường hợp này thì cấu trúc trung tâm hoạt động của enzyme tương ứng chặt chẽ với cơ chất, nếu có một sự sai khác nhỏ nào đó thì cũng đủ làm cho enzyme không thể sai khác được. Nếu ta thay đổi bất kỳ nhóm nào trong phân tử thì cũng đủ làm cho phân tử enzyme không hoạt động được như dạng este metylic của arginin. 3,- đặc hiệu tương đối Là trường hợp enzyme có khả năng tác dụng lên một kiểu nối hóa học nhất định mà không phụ thuộc vào bản chất hóa học của các cấu tử tham gia tạo thành mối liên kết đó. Ví dụ: lipase → thủy phân tất cả các liên kết este aminopeptidase → thủy phân nhiều liên kết peptit 4,- đặc hiệu nhóm Enzyme có khả năng tác dụng lên một kiểu nối hóa học nhất định với điều kiện một trong hai cấu tử tham gia tạo thành liên kết phải có cấu tạo xác định. Ví dụ: Enzyme protease cắt đầu hoặc cuối chuổi protit: CH CH CO COOH CO NH 2 NH R Aminopeptidase Cacboxypeptidase R •••••••••• CO

3.1.4.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme 1,- Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất Nếu làm thay đổi nồng độ của cơ chất và xác định xem điều đó ảnh hưởng thế nào tới tốc độ của phản ứng enzyme thì nói chung sẽ thấy rằng, với một lượng E không đổi, ở pH không đổi, lực ion không đổi, để đạt được tốc độ ban đầu cực đại cần phải có một lượng tương đối lớn cơ chất. đối với nhiều enzyme, nồng độ nâng cao hơn so với nồng độ của các chất nhất định của cơ thể. Tình trạng này rất quan trọng vì nó chứng tỏ rằng: Enzyme trong điều kiện của cơ thể thường tác dụng ít hiệu quả hơn so với trường hợp có những điều kiện nhân tạo, ở đó, enzyme được bão hòa bởi một lượng cơ chất lớn. Sự phụ thuộc giữa tốc độ của phản ứng enzyme và nồng độ của cơ chất được giải thích như thuyết của Michaelis và Menten:

E k 1 k 2 k 3 S P (1) E ES SINH HỌC đẠI CƯƠNG 2007 TRANG 46 Trong đó: k 1 → hằng số vận tốc của phản ứng tạo phức " ES " k 2 → hằng số vận tốc của phản ứng phân ly phức " ES " k 3 → hằng số vận tốc của phản ứng phân ly phức " ES " để tạo thành sản phẩm Gọi: v 1 là vận tốc của phản ứng tạo thành phức " ES ", v 2 là vận tốc của phản ứng phân ly phức " ES ", v 3 là vận tốc của phản ứng phân ly tạo thành sản phẩm, Ta có: v 1 = k 1 [ E ] [ S ] v 2 = k 2 [ E S ] v 3 = k 3 [ E S ] Khi hệ đạt tới trạng thái cân bằng, nghĩa là sự phân ly của phức " ES " theo phản ứng (3) và (2) cân bằng với sự tạo thành phức chất đó theo phản ứng (1), ta có: k 2 [ ES ] + k 3 [ ES ] = k 1 [ E ] [ S ] ( 2 ) →→→→ [ ES ] ( k 2 + k 3 ) = k 1 [ E ] [ S ] Gọi nồng độ của enzyme khi bắt đầu phản ứng là E o , ta có: [ E o ] = [E ] + [E ] ( 3 ) [ E ] = [ E o ] −−−− [ ES ]

Thay E của phương trình (3) vào phương trình (2), ta có:

[ ES ]( k 2 + k 3 ) = k 1 ([ E o ] −−−− [ ES ]) [ S ] k 1 [ E o ] [ S ] k 2 + k 3 [ ES ] = ---------------- →→→→ đặt: -------- = k m , ta có: k 2 + k 3 + k 1 [ S ] k 1 1 k 2 + k 3 + k 1 [ S ] k m 1 ----- = ----------------- = -------- + ---- [ ES ] k 1 [ E o ] [ S ] [ E o ] [ S ] [ E o ]

[ E o ] [ S ] [ ES ] = ---------- k m + [ S ] SINH HỌC đẠI CƯƠNG 2007 TRANG 47 Mặt khác, vận tốc của phản ứng enzyme tính theo sự tạo thành sản phẩm, ta có: [ E o S ] v = k 3 [ E S ] và v = k 3 x --------- ( 4 ) k m + [ S ]

Nồng độ của phản ứng càng cao kém nồng độ của ES càng lớn và độ lớn cực đại sẽ bằng nồng độ của enzyme ban đầu là E o : v max = k 2 [ E o ] ( 5 ) Thay (5) vào (4) ta có: v max [ S ] v = ---------- ( 6 ) k m + [ S ] Phương trình (6) biểu diễn sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng E vào nồng độ của cơ chất → đường biểu diễn có dạng hyperbol:

V max

V km

[S] ½ V

• k m : gọi là hằng số Michalic và đặc trưng cho mỗi enzyme, nó đặc trưng cho ái lực của enzyme với cơ chất • k m có trị càng nhỏ thì ái lực của enzyme đối với cơ chất càng lớn, nghĩa là vận tốc của phản ứng enzyme càng lớn v max Từ phương trình (6), ta thấy khi: v = ---- thì k m = (S) 2 Vậy hằng số Michalis có trị số bằng nồng độ của cơ chất khi vận tốc phản ứng bằng một nữa vận tốc cực đại. * k m : không phụ thuộc vào nồng độ E Ý nghĩa của hằng số Michalis là: • đánh giá đặc điểm của E, SINH HỌC đẠI CƯƠNG 2007 TRANG 48 • Cho phép tính được tác dụng của E trong những trường hợp khi ta không thể xác lập được bằng phương pháp thực nghiệm. Giả thiết của Michaelis-Menten: - Nếu k 2 >> k 3 thì k m = k 2 / k 1 - Khi [E] + [S] và [ES] ở trạng thái cân bằng - thì sự tạo thành sản phẩm sẽ ít và giá trị k m sẽ tỷ lệ nghịch với ái lực của enzyme với cơ chất - Nghĩa là k m càng nhỏ thì ái lực của enzyme với cơ chất càng lớn. - Nếu k 2 << k 3 - thì giả thiết của Michaelis-Menten không đúng nữa và k m không còn tỷ lệ với ái lực của enzyme với cơ chất nữa - Mà lúc này, phải coi k m như một số và bằng nồng độ của cơ chất khi vận tốc phản ứng bằng V max / 2 trong điều kiện thí nghiệm xác định. Phương trình Michaelis-Menten cũng có thể viết dưới dạng phương trình đường thẳng: 1 k m 1 1 --- = ---- x ---- + ----- V V max [ S ] V max * Cách biểu diễn đồ thị Có một số cách biểu diễn đồ thị phụ thuộc của vận tốc phản ứng enzyme vào nồng độ của cơ chất: V V a V km m m S

V V V 1 1 1 −1 k k b m m m m [S]

V độ dốc: k − m V V / S m m V k m c

V độ dốc: /K 1 m − k k m m m d S [S] v

- Hình 2-1-a: Theo Michaelis-Menten - dưới dạng sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng vào nồng độ cơ chất - Hình 2-1-b: Theo Lineweaver và Burk - dưới dạng đường thẳng - Hình 2-1-c: Theo Eadice - dưới dạng đường thẳng: V = f (v/s) - Hình 2-1-d: Theo Dixon - dưới dạng đường thẳng: s/v = f (s) SINH HỌC đẠI CƯƠNG 2007 TRANG 49 2,- Ảnh hưởng của nhiệt độ Cũng như các phản ứng hóa học, thường vận tốc của phản ứng tăng khi tăng nhiệt độ. Tuy nhiên, do enzyme có bản chất protein nên nó không bền đối với tác dụng của nhiệt, đa số enzyme bị mất khả năng hoạt động ở nhiệt độ trên 70ºC. Trong trường hợp phản ứng enzyme, khi tăng nhiệt độ: một mặt, vận tốc phản ứng tăng theo quy luật thông thường; mặt khác, tăng nhiệt độ tới một mức nào đó cũng đồng thời có tác dụng ngược lại, làm giảm vận tốc phản ứng do sự biến tính của enzyme do nhiệt độ gây ra. đường biểu diễn sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng và nhiệt độ như sau: T ( C) ° V

Nhiệt độ tối thích của các enzyme không giống nhau nhưng đa số nằm trong khoảng 35°C÷60°C (động vật là 35÷50°C, thực vật là 45÷60°C). * Nhiệt độ tối thích của mỗi enzyme không phải là một hằng số mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác, đặc biệt là thời gian tác dụng. Thời gian tác dụng càng dài, nhiệt độ tối thích của enzyme càng thấp. Ngoài ra, nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzyme cũng ảnh hưởng đến nhiệt độ tối thích của enzyme. 3,- Ảnh hưởng của pH pH V

Mỗi enzyme chỉ hoạt động mạnh nhất ở một vùng pH xác định gọi là pH tối thích (pH optimum). Hình trên là đường biểu diễn ảnh hưởng của pH đến hoạt động của enzyme. Cũng như nhiệt độ, pH tối thích của mỗi enzyme không cố định, có thể thay đổi tùy theo tính chất và nồng độ của cơ chất. Khi thay đổi pH → thay đổi trạng thái in hóa của các nhóm chức trong trung tâm hoạt động và đồng thời nó cũng làm thay đổi trạng thái ion hóa của cơ chất và vì vậy, làm thay đổi hoạt động của enzyme. SINH HỌC đẠI CƯƠNG 2007 TRANG 50 Vì các nhóm chức của trung tâm hoạt động của enzyme chỉ có thể hoàn thành chức năng xúc tác khi ở trạng thái ion hóa thích hợp nhất định nên bằng cách xác định hằng số ion hóa của các nhóm đó có thể nhận biết được sự có mặt của nhóm này hoặc nhóm khác trong trung tâm hoạt động của enzyme. cơ chất là casein →→→→ pH opitimum = 1,8 Ví dụ: pepxin cơ chất là hemoglobin →→→→ pH opitimum = 2,2 Thông qua nghiên cứu sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng enzyme và pH môi trường, có thể xác định được nhóm chức nào của phân tử enzyme đã tham gia quá trình xúc tác. 4,- Ảnh hưởng của các chất hoạt hoá Chất hoạt hóa là những chất có tác dụng làm cho enzyme từ trạng thái không hoạt động trở thành hoạt động hoặc từ trạng thái hoạt động yếu trở thành hoạt động mạnh hơn. Chất hoạt hóa có bản chất rất khác nhau, có thể là: • Các chất hữu cơ phức tạp làm nhiệm vụ vận chuyển một nhóm nào đó trong quá trình phản ứng, ví dụ: NAD, NADP (chuyển H 2 ). • Những chất có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phân tử tiền enzyme (zimogen) → loại bỏ một số liên kết → phá thế bị bao vây của các nhóm hoạt động trong trung tâm hoạt động của enzyme → trở lại dạng hoạt động. • Các chất có tác dụng làm phục hồi những nhóm chức hoạt động của trung tâm hoạt động của enzyme. Ví dụ: Trung tâm hoạt động của enzyme papain có chứa nhóm −SH: Dưới tác dụng của nhóm oxy hóa, nhóm −SH sẽ chuyển thành −S−S− . → Enzyme mất khả năng hoạt động. Nếu thêm vào môi trường các chất hoạt hóa có tính khử, nhóm −SH được phục hồi và enzyme sẽ hoạt động trở lại. 5,- Ảnh hưởng của các chất kìm hãm Chất kìm hãm là chất có khả năng làm yếu hoặc làm chấm dứt hoàn toàn tác dụng của enzyme. Các chất kìm hãm có bản chất hóa học khác nhau có thể là các ion kim loại, các anion, các hợp chất hữu cơ phân tử nhỏ hoặc là protein. SINH HỌC đẠI CƯƠNG 2007 TRANG 51 Chất kìm hãm có thể phản ứng thuận nghịch (kìm hãm thuận nghịch) hoặc không thuận nghịch (kìm hãm không thuận nghịch) với enzyme. Thường phân biệt 2 loại kìm hãm thuận nghịch là kìm hãm thuận nghịch cạnh tranh và thuận nghịch không cạnh tranh. a,- Kìm hãm thuận nghịch cạnh tranh Xảy ra khi enzyme thiếu tính đặc hiệu tuyệt đối. Trong trường hợp này, chất kim loại có cấu tạo rất giống cấu tạo của cơ chất. Nó kết hợp với phân tử enzyme cũng tại trung tâm hoạt động mà enzyme dùng để kết hợp tới cơ chất. Ví dụ: Axit malonic là chất kìm hãm cạnh tranh của enzyme sucxinat dehydrogenase, là enzyme xúc tác quá trình oxy hóa axit sucxinic thành axit fumaric, nó có cấu tạo gần giống cấu tạo của axit sucxinic: Axit suxinic Axit suxinic Axit fumaric COOH COOH COOH COOH COOH COOH CH 2 CH 2 CH CH 2 CH

đối với trường hợp trong phản ứng có mặt của các chất kìm hãm, việc tính toán vận tốc phản ứng enzyme phức tạp hơn nhiều. Chất kìm hãm và cơ chất cũng có khả năng kết hợp với trung tâm hoạt động - ta có 2 phương trình: k 1 k 3 k i + 1 E + S ⇔⇔⇔⇔ E S →→→→ E + P và E + I ⇔⇔⇔⇔ E I k 2 k i + 1 Bằng cách tính toán như phần trước người ta rút ra: V max x [ S ] V i = -------------------- k m (1 + [ I ] / k i ) + [ S ] → Viết dưới dạng phương trình đường thẳng: 1 k m 1 [ I ] 1 --- = ---- x ---- x ( 1 + --- ) + -------- V i V max [ S ] k i V max [ I i ]

[ I i ] Như vậy khi có chất kìm hãm cạnh tranh, gía trị của Km tăng lên (1 + ---- ) lần, có nghĩa là khi đó, ái lực giữa enzyme và cơ chất giảm, kết qủa k i vận tốc của phản ứng enzyme giảm. đường biểu diễn vận tốc: SINH HỌC đẠI CƯƠNG 2007 TRANG 52 V max V km [S] ½ V

1 /V V Không có kìm hãm k k

max m mi [S] V max = V i max 1 [ ]S [ ]I . V 0 V 1 k m k m k mi

b,- Trong trường hợp kìm hãm không cạnh tranh Trong trường hợp này, chất kìm hãm có thể gắn cả vào enzyme tự do cũng như vào phức hợp enzyme - cơ chất theo phản ứng sau: k 1 E + S ⇔⇔⇔⇔ E S →→→→ E + P k 2 k i + 1 E + I ⇔⇔⇔⇔ E I k i + 2 k i + 3 E S + I ⇔⇔⇔⇔ I E S k i + 4 k i + 5 E I + S ⇔⇔⇔⇔ I E S k i + 6 Giả thiết rằng k +3 rất nhỏ so với k +1 và k +2 , phức " E S " không tạo thành sản phẩm → bằng cách tính toán, người ta rút ra: V max [ S ] V i = -------------------- (k m + [ S ] ) (1 + [ I ] / k i ) Cũng có thể viết ra dưới dạng đường thẳng: 1 k m 1 [ I ] 1 [ I ] -- = --- x --- (1 + --- ) + ---- (1 + --- ) V i V max [S ] k i V max k i đồ thị biểu diễn trong trường hợp này có dạng: SINH HỌC đẠI CƯƠNG 2007 TRANG 53 V max Không có kìm hãm k m [S 1 2 ] 1 /V V Không có kìm hãm Có chất kìm hãm • max [S] 1 2

So sánh vận tốc khi không có chất kìm hãm với vận tốc phản ứng khi có chất kìm hãm, ta có: Kìm hãm cạnh tranh Kìm hãm không cạnh tranh V o k m / k i --- = 1 + -------- [ I ] V i k m + [ S ] V o [ I ] --- = 1 + --- V i k i → Sự biến đổi hoạt tính phụ thuộc vào nồng độ cơ chất và nồng độ chất kìm hãm → Không phụ thuộc vào nồng độ cơ chất và phụ thuộc vào nồng độ chất kìm hãm

3.2. HÔ HẤP TẾ BÀO 3.2.1. đại cương về hô hấp tế bào Hô hấp tế bào là một tập hợp những quá trình xảy ra trong từng tế bào do enzyme xúc tác, kết quả của những quá trình ấy là các phân tử gluxit, axit béo và axit amin cuối cùng bị phân hủy đến khí cacbonic và nước, còn năng lượng sinh học giải phóng ra một phần được sử dụng cho các hoạt động sống của tế bào, phần còn lại được tế bào tích lũy lại dưới dạng các liên kết cao năng. Tất cả các hoạt động sống: vận động, cảm ứng, sinh trưởng, sinh sản vv... đều cần đến năng lượng. Năng lượng cần thiết đó tế bào lấy tử các liên kết phosphat cao năng trong phân tử ATP (các liên kết ấy có năng lượng tự do thủy phân tương đối cao). Quá trình hô hấp tế bào hay quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ trong tế bào có thể tóm tắt như sau: - Ở cơ thể động vật và vi sinh vật gluxit, lipit, protein bị phân giải thành các cấu tử hợp phần dưới tác dụng của các hệ enzyme nội và ngoại bào. Tiếp đó các đơn cấu tử được thấm vào tế bào nhờ các cơ chế đặc biệt. Các hợp phần của protein, gluxit, lipit như glucose, axit amin và axit béo dưới tác dụng của các enzyme đặc hiệu đều tạo thành một sản phẩm chuyển hóa như nhau đó là axetilcoenzyme A. SINH HỌC đẠI CƯƠNG 2007 TRANG 54 - Axetilcoenzyme A được tiếp tục oxy hóa trong chu trình kín gọi là chu trình xitrat (chu trình Krebs hay chu trình axit xitric). Trong chu trình Krebs, axetilcoenzyme A bị oxy hóa hoàn toàn, giải phóng ra CO 2 còn các nguyên tử hydro giải phóng ra nằm trong các coenzyme khử NAD.H 2 , NADP.H 2 và coenzyme flavin khử. - Sản phẩm cuối cùng thứ hai là H 2 O được hình thành do sự oxy hóa các coenzyme khử trên. Sự oxy hóa này kèm theo sự giải phóng năng lượng và quá trình này xảy ra qua hệ chuyển vận điện tử và proton gọi là chuỗi hô hấp. Trong giai đoạn này xảy ra sự tổng hợp ATP hợp chất chứa liên kết cao năng. Quá trình giải phóng năng lượng trong giai đoạn này là do sự khử hóa hydro trong chuỗi hô hấp. Sản phẩm cuối cùng là H 2 O. Sơ đồ 3-1 minh họa chuỗi các phản ứng trao đổi chất, trong quá trình của các phản ứng đó điện tử được chuyển từ cơ chất đến oxy và năng lượng được tích lũy dưới dạng liên kết cao năng trong phân tử ATP. Isocitric Cis-aconitic Oxaloacetic Oxalosuxinic α-Cetoglutaric Malic Suxinic Fumaric NADPH 2 FAD.H 2 FAD.H 2 CoQ Cytb Cytc Cyta Cyta 3 H O 2 FS 2H + FN O 2 − 0,32 − 0,06 0,00 0,26 0,06 0,26 0,03 0,24 0,02 0,27 1 0 0 3 1 1 0 0 1 1 0,26 0,29 0,53 0,55 0,82 E' (v) 0 E' Δ ½ e e e e e TH ATP - ATP - Kh¶ n¨ng lý thuyÕt: §−îc thùc tÕ: TH NADH Citric

Ghi chú: b, c, a, a3: Là những xitocrôm Hình 3-1: Sơ đồ chuỗi các phản ứng trao đổi chất 3.2.2. Glicolis - Chu trình đường phân Glicolis là quá trình phân giải đường trong tế bào. Sự đường phân nằm trong quá trình dị hóa. Các phân tử đường, dưới tác dụng của các enzyme bị oxy hóa trong tế bào. Quá trình biến đổi này có sự tham gia của phân tử ATP đồng thời cũng có sự tổng hợp ATP. Sự phân giải đường trong tế bào có thể theo con đường Pentoso- phosphat hay theo sơ đồ Embden-Meyerhof để tạo thành axit piruvic. SINH HỌC đẠI CƯƠNG 2007 TRANG 55 3.2.2.1. Sự oxy hóa trực tiếp glucose - Chu trình Pentosophosphat Ở cơ thể sinh vật còn tồn tại một kiểu chuyển hóa glucose tới CO 2 và H 2 O không theo sơ đồ Embden-Meyerhof và chu trình Krebs. Người ta gọi con đường này là kiểu phân giải Hexosomonophosphat, và chu trình qua đó xảy ra sự chuyển hóa gọi là chu trình Pentosophosphat. Sơ đồ rút gọn của chu trình này có thể biểu diễn như sau: 1mol glucose-6-phosphat + 12NADP + 7H 2 O=6CO 2 + 12NADP.H 2 + H 3 PO 4 Trong quá trình biến đổi của chu trình này không có phản ứng nào tổng hợp trực tiếp ra phân tử ATP. Các phân tử ATP sẽ được tổng hợp nhờ sự chuyển hóa tiếp tục của NADP.H 2 qua chuỗi oxyhóa khử. 3.2.2.1. Sơ đồ Embden-Meyerhof - Quá trình chuyển hóa được biểu diễn trên sơ đồ 3-2. Ta nhận thấy: Cứ một phân tử NADP.H 2 chuyển hóa qua chuỗi oxyhóa khử sẽ tổng hợp được 3 phân tử ATP. Như vậy toàn bộ chu trình sẽ tổng hợp được 36 phân tử ATP. Qua quá trình biến đổi ta thấy: Từ một phân tử đường glucose sẽ tạo ra hai phân tử 3- phosphoglyxeraldehyd (phân tử thứ hai có được do sự chuyển hóa từ dioxyaxetophosphat), từ đó tạo thành hai phân tử axit piruvic. Trong quá trình biến đổi từ glucose đến axit piruvic hình thành 4 phân tử ATP, tuy nhiên hai trong số đó được sử dụng lại ngay trong quá trình đó. Như vậy cuối cùng còn lại hai phân tử ATP. Axit piruvic sau đó sẽ kết hợp với axetilcoenzyme-A tạo thành mạch hai carbon để đi vào chu trình Krebs. SINH HỌC đẠI CƯƠNG 2007 TRANG 56 CH OH 2 CHOH 2 3 CH CHOH 2 CHOH CHOH COOH CHOH COOH CH 2 CH 2 CH 2 HC 2 H H H H H H HO HO OH ATP ADP OH OH OH OH OH O Glucose Fructose-(1-6)-diphosphat Glucokinase Phospho hexose isomerase Glucose-6-phosphat Axit phosphoenolpiruvic Axit piruvic Glixeraldehyt-3- P Axit-(1-3) diphospho glyxerinic O O O O O O O O C HC C O O P P P P P P P CH 2 O CHO OH H C P ATP ADP Phospho-fructo kinase CH 2 HC 2 H H OH OH Fructose-(1-6)-diphosphat O O O P P HPO 3 4 NADH 2 NAD Phosphoglyxerndehyt- dehydrogenase-(SH) ADP ATP Phosphoglyxeratkinase ADP ATP Enolase 3 CH COOH O C CHOH 2 CHOH 2 CHOH 2 CHOH CHOH 2 CH 2 CH 2 HPO 4 NADH 2 HO 2 HO 2 NAD Triose- P -isomerase Glycero- P -dehydrogenase Phosphataza phosphoglixeratmutase Dioxyaxeton phosphat O O O O C C P P

Hình 3-2: Sơ đồ Embden-Meyerhof SINH HỌC đẠI CƯƠNG 2007 TRANG 57 3.2.3. Sự lên men Sự lên men theo nghĩa rộng là quá trình trao đổi chất, qua đó các chất hữu cơ mà trước tiên là đường bị biến đổi dưới tác dụng của vi sinh vật. Về bản chất thì lên men chính là quá trình oxyhóa khử sinh học cung cấp năng lượng và các hợp chất trung gian - như hô hấp. Trong quá trình đó, các nguyên tử carbon của cơ chất bị khử đến CO 2 còn các nguyên tử hydro được chuyển cho các hợp chất trung gian và sau đó được đưa đến chất tiếp nhận cuối cùng. điểm khác nhau cơ bản giữa lên men và hô hấp ở chỗ chất tiếp nhận hydro cuối cùng. Chất tiếp nhận hydro cuối cùng trong quá trình lên men thường là một hợp chất hữu cơ, hợp chất hữu cơ này sau khi tiếp nhận hydro không thể tiếp tục chuyển hóa tiếp và nếu tích tụ lại trong tế bào với nồng độ cao sẽ ảnh hưởng xấu đến quá trình sống của chúng nên và sau đó khuyếch tán ra ngoài môi trường và tích tụ lại trong môi trường. Chất tiếp nhận hydro cuối cùng của quá trình hô hấp là oxy. Như vậy sự lên men và hô hấp đều là những quá trình oxy hóa khử sinh học qua đó tế bào vi sinh vật thu được năng lượng. Sự lên men cũng như hô hấp quá trình biến đổi các hợp chất hữu cơ như đường, protein, lipit trong giai đoạn dị hóa là đặc biệt quan trọng. Các chu trình Embden-Meyerhof, chu trình Krebs, chu trình Pentosophosphat đóng vai trò quan trọng và là trung tâm của các quá trình lên men. Ví dụ lên men rượu: Các phân tử đường dưới tác dụng của hệ enzyme trong tế bào vi sinh vật biến đổi theo chu trình Embden-Meyerhof cho đến aldehydphosphoglyxerinic, sau đó quá trình biến đổi tiếp cho đến rượu. Trong quá trình đó có sự tạo thành sản phẩm phụ là glyxerin. Như vậy aldehydphosphoglyxerinic trong trường hợp này không chuyển thành axit piruvic như trong sơ đồ Embden-Meyerhof như chúng ta đã khảo sát trên đây. điều đó xảy ra được là do hệ enzyme của chính vi sinh vật đóng vai trò quyết định trong quá trình lên men và trong những điều kiện xác định. Quá trình đó được biểu diễn qua mô hình 3-3. Vi sinh vật thường hay được sử dụng trong quá trình lên men rượu và sản xuất bia là Sacharomyces cereviceae. Nếu nuôi chúng trong điều kiện đầy đủ oxy thì sự tích tụ rượu trong môi trường là hầu như không đáng kể. Vì trong điều kiện đó, quá trình hô hấp xảy ra mạnh mẽ, vi sinh vật phát triển sinh khối mạnh. Khi nuôi chúng trong điều kiện yếm khí, không đủ oxy thì chúng sẽ kém hoặc không phát triển. SINH HỌC đẠI CƯƠNG 2007 TRANG 58 CH 2 O P C O CH 2 OH CH 2 O P CHOH CH 2 OH CH 2 OH CHOH CH 2 OH H 2 PO 4 H 2 O NAD + NADH 2 Fructose 1-6 di P Glucose 2 ATP

2 ADP CH 2 O P CHOH CH 2 OH COOH C O CH 3 CH 3 CH 2 OH

CO 2 CHO CH 3

Decarbo- Xylase Dioxyaxeton phosphat Glyxealdehyd 3P Axetaldehyd Alcohol etylic

NAD + NADH 2

Hình 3-3: Sự chuyển hoá hoá học trong quá trình lên men rượu