1

CÔNG NGHỆ ENZYME

(Enzyme technology

Technologie des enzymes

Enzymtechnologie)

Người trình bày:

Bùi Văn Ngọc

Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm

KH&CN Việt Nam

Email: [email protected] hoặc [email protected]

Hà Nội, tháng 8 năm 2016

Chương 5: Một số enzyme chủ yếu và ứng dụng

của chúng trong chế biến thực phẩm

5.1 Amylase

5.2 Protease

5.3 Pectinase

5.4 Saccharase và gluco oxydase

5.1 Amylase

•  Định nghĩa: Là enzyme xúc tác phản ứng thuỷ phân (cộng nước)

tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose và dextrin hạn

chế

•  Nguồn amylase: amylase có trong nước bọt, trong dịch tiêu hóa

của người và động vật, trong hạt nảy mầm (malt). Amylase chủ yếu

được sản xuất từ vi sinh vật (nấm mốc, nấm men và vi khuẩn)

Phân loại amylase: α-, β-, và γ-amylase

•  α-amylase (EC 3.2.1.1): hay còn gọi là 1,4-α-D-glucan glucanohydrolase hoặc glycogenase thuộc các enzyme kim loại (metal oenzyme) chứa Ca2+

(cofactor, nhóm ngoại), α-amylase bị bất hoạt khi không có Ca2+, phân cắt ngẫu nhiên liên kết 1,4 glycodisde nội mạch

Ca2+

Cl-

Cấu trúc và TTHĐ của α-amylase

•  β-amylase (EC 3.2.1.2): hay 1,4-α-D-glucan maltohydrolase glycogenase hoặc saccharogen amylase, thuỷ phân liên kết 1,4 glycoside bắt đầu từ liên kết thứ 2 tính từ đầu không khử (non-reducing end) tạo thành sản phẩm

mang 2 đơn vị glucose hay maltose (!?)

•  γ-amylase (EC 3.2.1.3): hay còn họi là glucan 1,4-α-glucosidase,

amyloglucosidase, exo-1,4-α-glucosidase, glucoamylase, lysosomal α-

glucosidase, 1,4-α-D-glucan glucohydrolase, phân cắt liên kết 1,6

glycoside và 1,4 glycoside tại đầu không khử của phân tử amylose và

amylopectin tạo thành các phân tử glucose

Sơ đồ phân loại amylase:

Amylase

Endoamylase

Exoamylase

(E phân cắt nội phân tử)

(E phân cắt ngoại phân tử)

Enzyme

α - Amylase

ß - Amylase

γ - Amylase

khử nhánh

Khử trực tiếp

Khử gián tiếp

•  Pullulanase

•  Transglucosylase

•  Amylose-1,6 glucosidase

Quá trình thuỷ phân tinh bột của amylase

•  α-amylase

α-amylase

Amylose

87% Maltose + 13% Glucose

α-amylase

72% maltose + 19% glucose + 8% Isomaltose +

Amylopectin

1% dextrin phân tử thấp

•  β-amylase

β - amylase

Amylose

100% Maltose

β - amylase

Amylopectin

(54-58%) Maltose + ( 42-46%) dextrin phân tử lớn

Quá trình thuỷ phân tinh bột của amylase (tiếp)

•  γ-amylase của Rh. delamar

γ - amylase

Tinh bột

100% Glucose

•  γ-amylase của A. niger

γ - amylase

Tinh bột

80% Maltose + 20% Dextrin

Đặc tính của α-amylase:

•  Trọng lượng phân tử trung bình từ 40000 – 60000 Da.

•  Bền nhiệt hơn so với các loại enzyme khác (do có ion Ca2+ giữ

vai trò ổn định cấu trúc bậc ba của phân tử enzyme)

•  Bị kiềm hãm bởi các ion kim loại nặng Cu2+, Pb2+, Hg2+. Các

ion Mn2, Na+, Mg2+ không ảnh hưởng đến hoạt tính.

•  Có thể thu nhận nấm mốc, vi khuẩn, thực vật, mầm lúa

•  Thường thể hiện hoạt tính trong vùng acid yếu

Ví dụ:

α-amylase nấm mốc hoạt động ở pH 4,5 - 5,8

α-amylase vi khuẩn hoạt động ở pH 5,8 – 6,1

α-amylase của đại mạch hoạt động ở pH 4,7 -5,4

•  Qúa trình hồ hoá diễn ra 2 giai đoạn: Dextrin hoá và đường

hoá

-  Dextrin hoá: Chỉ một số liên kết trong phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng dextrin, độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh

-  Đường hoá: Các dextrin vừa được tạo thành bị thủy phân, tiếp tục tạo ra các dextrin phân tử thấp hơn, maltose, isomaltose và glucose

Đặc tính của β-amylase:

•  β-amylase không có khả năng thủy phân tinh bột sống, mà

chỉ có khả năng thủy phân các tinh bột đã hồ hóa

•  β-amylase vẫn giữ được hoạt tính khi không có Ca 2+ , và bị

kiềm hãm bởi Cu2+, Hg 2+, urea, iodine, ozon,...

•  β-amylase chịu nhiệt kém hơn α – amylase nhưng bền với

acid hơn. β-amylase bị bất hoạt ở nhiệt độ 70oC. Nhiệt độ

hoạt động thích hợp của β-amylase là 50-60oC.

•  β-amylase hoạt động pH thích hợp 4,2-5,6.

•  β-amylase có nguồn gốc từ vi khuẩn thì bền nhiệt hơn của

thực vật và nấm mốc.

Đặc tính của γ-amylase (glucoamylase):

•  Tiến hành tuần tự ở từng liên kết một, bắt đầu từ đầu

không khử của mạch, tách dần từng phân tử của glucose.

•  Có khả năng thủy phân cả maltose, isomaltose và dextrin

•  Nhiệt độ hoạt động tối thích 50-600C, hầu như bị mất hoạt

tính khi đun nóng trên 700C

•  γ-amylase hoạt động pH thích hợp 4,5-5.

•  γ-amylase bền trong acid kém bền trong ethanol, cetone.

•  Không bị ức chế bởi các ion kim loại nặng Ag+, Hg 2+.

•  Những chủng VSV có khả năng sinh tổng hợp γ-amylase

có ý nghĩa công nghiệp: nấm mốc: A. niger, A. awamori,

nấm men: Endomycopsis.

Đặc tính của các amylase (tiếp):

4

5

6

Pullulanase

Oligo-1,6glucosidase Amylo 1,6-glucosidase

Có thể thủy phân

Thủy phân liên kết

Nhiều loại nấm sợi sản

các liên kết α - 1,6

1,6-glucoside trong

sinh ra các enzyme này

của tinh bột,

dextrin tới hạn và có

thủy phân maltose

glucogen, pullulan

isomaltose, panose,

thành glucose nhưng

và các dextrin tới

thể chuyển hóa chúng

không thủy phân tinh

hạn

đến các loại đường có

bột

thể lên men được

Thuỷ phân polysaccharide (pullulan) bởi pullulanase

Ứng dụng amylase trong công nghệ thực phẩm

•  Trong sản xuất bia, cồn

•  Trong sản xuất mì chính

•  Trong sản xuất bánh mì

•  Trong sản xuất bánh kẹo

•  Trong sản xuất siro

•  Trong sản xuất nước giải khát

(Tham khảo, tự đọc tài liệu gửi kèm)

5.2 Protease (xem thêm chương 3, mục 3.2)

•  Hay còn gọi là peptidase thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (EC

3.4)

•  Được phân thành 2 nhóm chính endopeptidase và

exopeptidase:

-  Endopeptidase: serine protease (chứa nhóm –OH, chymotrypsin,

trypsin...), cysteine protease (chứa nhóm –SH, papain, bromelain),

aspartic protease (pepsin, rennin...),

-  Exopeptidase: aminopeptidase (?), carboxypeptidase (?)

•  Hoặc được phân thành 3 nhóm: protease acid (?), kiềm (?),

trung tính (?)

Ứng dụng của protease trong công nghệ thực phẩm

•  Trong công nghiệp chế biến sữa

•  Trong sản xuất pho mai (fromage)

•  Trong sản xuất nước mắm

•  Trong sản xuất tương

•  Trong sản xuất chao

•  Trong công nghệ chế biến thịt và đồ hộp

•  Trong sản xuất bia và bánh mì...

(tham khảo, đọc các tài liệu gửi kèm)

5.3 Pectinase (xem bài giảng gửi kèm)

5.4 Saccharase và glucooxydase

•  Saccharase (EC 3.2.1.26): hay còn gọi là invertase hoặc

glucosucrase, beta-fructosidase, sucrase, alkaline invertase,

acid invertase, beta-fructofuranosidase... là enzyme chuyển

saccharose thành glucose và fructose. Có thể dùng trong sản

xuất mứt cho khả năng giữ ẩm tốt hơn mà không tạo màu

như trong trường hợp thuỷ phân bằng acid

•  Saccharase (invertase) được thu nhận từ nấm men

Saccharomyces cerevisiae hoặc S. carlbegensis. Khi được cố

định (lên chất mang hoặc liên kết chéo), 1 L enzyme dạng

viên có thể sản xuất được 15 tấn siro nghịch đảo (theo tính

chất khô)

•  (xem thêm tài liệu enzyme invertase gửi kèm)

Cơ chế phản ứng của saccharase (sucrase)

Glucose oxidase (EC 1.1.3.4)

•  Xúc tác phản ứng oxi hoá đường (glucose) thành hydrogen

peroxide (H2O2) và D-glucono-δ-lactone

•  Glucose oxidase chủ yếu ứng dụng trong việc xác định lượng

đường tự do trong huyết tương, trong máu hoặc trong môi

trường nuôi cấy tế bào hay đánh giá khả năng tiêu thụ đường

của tế bào hoặc sinh tổng hợp đường dưới dạng glycogen,

trehalose trong trao đổi chất tế bào

Cơ chế xúc tác phản ứng của glucose oxidase trong

việc xác định lượng đường tự do

•  Oxi hoá đường (glucose) thành hydrogen peroxide (H2O2) và

D-glucono-δ-lactone (sau đó bị thuỷ phân thành gluconic

acid)

•  H2O2 phản ứng với cơ chất phản ứng o-dianisidine dạng khử

dưới sự xúc tác của peroxidase tạo thành o-dianisidine dạng

oxi hoá (màu nâu đỏ, hấp thụ tại bước sóng 450 nm)

Khả năng tiêu thụ đường và sinh trưởng của tế bào

Khả năng tiêu thụ đường và sinh tổng hợp glycogen

Thảo luận:

4.3 Tính chất của enzyme cố định (tiếp)

•  Hằng số động học của enzyme cố định tuân theo động học

Michaelis Menten. Tuy nhiên cũng có những sai khác:

-  Ảnh hưởng đến giá trị Km (ái lực enzyme–cơ chất): Việc cố định enzyme lên chất mang gây cản trở cơ chất tiếp xúc với TTHĐ của enzyme, giảm

ái lực enzyme và cơ chất (giá trị Km?), do đó làm giảm vận tốc phản ứng

(v)

-  Ngoài ra, hoạt độ xúc tác của enzyme cũng bị ảnh hưởng bởi tốc độ

khuếch tán của cơ chất (S) và sản phẩm (P). Tốc độ khuếch tán lại phụ

thuộc vào kích thước lỗ gel hoặc bao vi nang, khối lượng phân tử của cơ

chất và sản phẩm tạo thành

•  Enzyme cố định có tính bền nhiệt cao hơn enzyme tự do

•  pH tối ưu của enzyme cố định thường bị chuyển sang miền

kiềm hoặc acid so với pH tối ưu của enzyme tự do (?? Phụ

thuộc vào trường tĩnh điện của chất mang)

•  Enzyme cố đính có thời gian bảo quản lâu hơn và bền với các

tác nhân kìm hãm và biến tính hơn enzyme tự do (??)

26

•  Thiết bị phản ứng enzyme dạng màng (membrane reactor –

MR)

-  Được trang bị một màng bán thấm chỉ cho phép sản phẩm đi qua mà ngăn

không cho enzyme đi qua. Màng thường dùng là màng cel ophane chứa

các sợi nhỏ có đường kính 200 µm, độ dày 50 µm.

-  Thiết bị này có thể hoạt động gián đoạn hoặc liên tục, có thể dùng cho enzyme dạng tự do (hình trái) hoặc enzyme cố định (hình phải). Trong

trường hợp cơ chất không khuếch tán qua màng (?) hoặc có thể khuếch

tán qua màng, thì cơ chất và enzyme nên bố trí như thế nào?

-  Ưu điểm: Thích hợp với quy mô nhỏ, dễ dàng thay thế enzyme (khi enzyme không bền)

-  Nhược điểm: Thay thế màng định kỳ, giá thành màng thường cao

27

Kết thúc chương 5