1
CÔNG NGHỆ ENZYME
(Enzyme technology
Technologie des enzymes
Enzymtechnologie)
Người trình bày:
Bùi Văn Ngọc
Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm
KH&CN Việt Nam
Email: [email protected] hoặc [email protected]
Hà Nội, tháng 8 năm 2016
Chương 4: Enzyme cố định (immobilized enzymes)
4.1 Giới thiệu về enzyme cố định
4.2 Các phương pháp điều chế enzyme cố định
4.3 Tính chất của enzyme cố định
4.4 Các bioreactor chứa enzyme cố định
4.5 Sử dụng enzyme cố định trong công nghiệp thực phẩm
4.1 Giới thiệu về enzyme cố định
• Khái niệm: enzyme cố định (enzyme không tan) là enzyme
được định vị vật lý vào một hoặc vài vùng xác định trên chất
mang mà vẫn giữ được hoạt tính và có thể tái sử dụng nhiều
lần. Nói cách khác, là enzyme được gắn lên các chất mang
không hoà tan hoặc chúng được gắn với nhau bằng liên kết
đồng hoá trị tạo nên đại phân tử enzyme không hoà tan
• Ưu điểm của enzyme cố định:
- Tái sử dụng nhiều lần
- Không tan lẫn vào sản phẩm, có thể tách khỏi cơ chất khi dừng phản ứng, không ảnh hưởng đến màu sắc, mùi vị sản phẩm
- Bền với nhiệt độ, pH, dung môi hữu cơ
• Nhược điểm của enzyme cố định:
- Hạn chế sự chuyển khối giữa 2 pha
- Không hiệu quả đối với cơ chất rắn
4.2 Các phương pháp điều chế enzyme cố định
• Có 3 phương pháp: Hấp phụ (adsorption), gói hay bọc
(entrapment, encapsulation), và gắn bằng liên kết đồng hoá trị
(covalent binding) hoặc
• Có hai phương pháp: Vật lý và hoá học
Điều chế
enzyme cố
định
Phương pháp
Phương pháp
vật lý
hoá học
Gói (bẫy)
Gói trong bao
Liên kết đồng
Liên kết chéo
Hấp phụ
trong khuôn
nang (bao vi
hoá trị với giá
giữa các phân
gel
thể)
thể không tan
tử enzyme
Các phương pháp điều chế enzyme cố định
Cố định enzyme
Gói (bẫy) trong Gói (bọc) trong
khuôn gel
bao vi nang (bao
vi thể)
Hấp phụ lên
Liên kết đồng hoá trị
Liên kết chéo
chất mang
với chất mang
Các chất mang (support) sử dụng để cố định enzyme
• Chất mang thường sử dụng để cố định
enzyme bằng phương pháp hấp phụ
(nhờ lực van der Waals) có thể là:
- Vô cơ: silic, thuỷ tinh xốp, oxyt kim loại...
- Hữu cơ: than hoạt tính, cel ulose, dextran,
agarose...
• Các chất mang sử dụng để cố định enzyme theo phương
pháp gắn enzyme bằng liên kết đồng hoá trị là:
- Các polymer hữu cơ: polypeptide, polysaccharide (dextran, agarose)
- Các chất vô cơ: silicagel, bentonite, nhôm hydroxide
- Các dẫn xuất của cel ulose: DEAE-cel ulose, DEAE-sephadex, CM-
sephadex
- Các polymer tổng hợp: polyacrylamide, polystyrol, polyamide, polyvinyl
Yêu cầu của chất mang
• Hoà tan thấp và bền vững đối với các tác động cơ học, hoá
và sinh học
• Không gây ức chế hoạt động của enzyme
• Không hấp phụ phi chọn lọc đối với các protein khác
• Mang điện tích trái dấu với enzyme
Sự hình thành liên kết đồng hoá trị giữa chất mang và
protein enzyme
• Chất mang thường tạo liên kết đồng hoá trị với các nhóm
chức của amino acid thuộc phân tử protein enzyme như:
nhóm –COOH (aspartic acid, glutamic acid), –NH2 (lysine,
arginine), –SH (cystein), –OH (serine), nhân idole
(tryptophan), nhân imidazole (histidine)
(xem lại Bảng phân loại các amino acid trang 27, chương 1)
Sự hình thành liên kết đồng hoá trị giữa chất mang và
protein enzyme (tiếp)
• Diazo hoá:
Chất mang–N = N–Enzyme
• Tạo cầu amide:
Chất mang–CO = NH–Enzyme
• Alkyl hoá và aryl hoá:
Chất mang–CH2 = NH2–Enzyme
• Tạo schiff base:
Chất mang–CH = N–Enzyme
• Trao đổi thiol-disulfide:
Chất mang–S – S–Enzyme
(xem lại Bảng phân loại các amino acid trang 27, chương 1)
Gel sử dụng để gói enzyme
• Gel có thể được điều chế từ polyacrylamide
để tạo gel dạng chất nền (matrix)
• Gel có thể là cel ulose triacetate, col agen,
chitosan tạo gel dạng sợi (fiber)
Gói enzyme trong bao vi thể (microcapsule)
• Gel có thể được điều chế từ
polyethyleneimine (PEI) để tạo màng
bán thấm, màng này có kích thước lỗ
đủ nhỏ để enzyme không khuếch tán
ra ngoài và đủ lớn để cơ chất đi qua
trong qúa trình phản ứng
Gắn các enzyme với nhau bằng liên kết đồng hoá trị (cross-linking)
• Là qúa trình tạo liên kết chéo đồng hoá
trị giữa các phân tử enzyme tạo thành
cấu trúc đại phân tử mà không cần đến
các chất mang. Tác nhân gắn thường
là glutaraldehyde với tỷ lệ 10% (w/w)
so với enzyme
So sánh các phương pháp cố định enzyme
Đặc điểm
Phương
Phương
Phương
Phương
pháp hấp
pháp gói
pháp gói
pháp liên
phụ
trong khuôn trong bao vi kết đồng
gel
thể
hoá trị
Phương pháp điều chế
Đơn giản
Phức tạp
Đơn giản
Phức tạp
Chi phí
Thấp
Vừa phải
Cao
Cao
Lực cố định
Thay đổi
Yếu
Mạnh
Mạnh
Hiện tượng nhả enzyme
Có
Có
Không
Không
Sự cố khi tiến hành
Cao
Cao
Cao
Thấp
Ảnh hưởng của chất mang Có
Có
Không
Có
Cản trở khuếch tán
Không
Có
Có
Không
Khả năng áp dụng
Rộng rãi
Rộng rãi
Rất rộng rãi
Chọn lọc
4.3 Tính chất của enzyme cố định
• Enzyme cố định có hoạt độ riêng thấp hơn hoạt độ riêng của
enzyme tự do là do một số nguyên nhân sau (???):
- Khi enzyme gắn vào chất mang, dưới tác động của điện tích cấu hình không gian của enzyme sẽ bị thay đổi, ảnh hưởng đến TTHĐ và khả
năng xúc tác cuả enzyme
- Khi enzyme được gói trong khuôn gel (chất nền, sợi) hoặc bao vi thể, các cơ chất có kích thước phân tử lớn sẽ không tiếp xúc được với
enzyme, do đó hoạt lực của enzyme cũng giảm
- Khi các phân tử enzyme liên kết với nhau tạo thành đại phân tử, qúa trình tương tác protein-protein giữa các enzyme có thể làm biến dạng cấu hình không gian của từng phân tử enzyme đơn lẻ, qua đó cũng
ảnh hưởng đến TTHĐ và khả năng xúc tác của enzyme nói chung
4.3 Tính chất của enzyme cố định (tiếp)
• Hằng số động học của enzyme cố định tuân theo động học
Michaelis Menten. Tuy nhiên cũng có những sai khác:
- Ảnh hưởng đến giá trị Km (ái lực enzyme–cơ chất): Việc cố định enzyme lên chất mang gây cản trở cơ chất tiếp xúc với TTHĐ của enzyme, giảm ái lực enzyme và cơ chất (giá trị Km?), do đó làm giảm vận tốc phản ứng (v)
- Ngoài ra, hoạt độ xúc tác của enzyme cũng bị ảnh hưởng bởi tốc độ
khuếch tán của cơ chất (S) và sản phẩm (P). Tốc độ khuếch tán lại phụ
thuộc vào kích thước lỗ gel hoặc bao vi nang, khối lượng phân tử của cơ
chất và sản phẩm tạo thành
• Enzyme cố định có tính bền nhiệt cao hơn enzyme tự do
• pH tối ưu của enzyme cố định thường bị chuyển sang miền
kiềm hoặc acid so với pH tối ưu của enzyme tự do (?? Phụ
thuộc vào trường tĩnh điện của chất mang)
• Enzyme cố đính có thời gian bảo quản lâu hơn và bền với các
tác nhân kìm hãm và biến tính hơn enzyme tự do (??)
14
4.4 Thiết bị phản ứng (Bioreactor)của enzyme cố định
Là nơi diễn ra các phản ứng chuyển hoá các hợp chất (cơ chất)
thông qua qúa trình xúc tác enzyme. Thiết bị phản ứng enzyme
được lựa chọn tuỳ thuộc vào đặc điểm của từng phản ứng và mục
đích sử dụng
• Thiết bị phản ứng liên tục
• Thiết bị phản ứng enzyme dạng màng
• Thiết bị phản ứng dạng cột
• Thiết bị phản ứng tầng sôi
15
• Thiết bị phản ứng liên tục (continuous flow reactor)
- Cấu trúc như thiết bị gián đoạn, nhưng được
vận hành liên tục với vận tốc dòng cơ chất
(feeding pump) vào thiết bị bằng với vận tốc
dòng sản phẩm và cơ chất (chưa được
chuyển hoá hết) ra khỏi thiết bị (effluent).
Thường sử dụng hệ thống thiết bị nối tiếp
nhau (?)
- Thời gian lưu trung bình của cơ chất: V/F,
trong đó V là thể tích của thiết bị, F là vận tốc
dòng cơ chất (?)
- Thích hợp khi vận hành với enzyme cố định
- Ưu điểm: Năng suất làm việc lớn hơn thiết bị
gián đoạn khi sử dụng cùng 1 lượng enzyme.
Cho phép sử dụng cơ chất có độ hoà tan
thấp, phản ứng enzyme không đổi trong suốt
qúa trình
- Nhược điểm: Chi phí nhiều hơn (nhiều bình
phản ứng nối tiếp nhau). Chỉ sử dụng cho
qúa trình có vận tốc chuyển hoá thấp (?)
16
• Thiết bị phản ứng enzyme dạng màng (membrane reactor –
MR)
- Được trang bị một màng bán thấm chỉ cho phép sản phẩm đi qua mà ngăn không cho enzyme đi qua. Màng thường dùng là màng cel ophane chứa
các sợi nhỏ có đường kính 200 µm, độ dày 50 µm.
- Thiết bị này có thể hoạt động gián đoạn hoặc liên tục, có thể dùng cho enzyme dạng tự do (hình trái) hoặc enzyme cố định (hình phải). Trong trường hợp cơ chất không khuếch tán qua màn (?) hoặc có thể khuếch tán qua màng, thì cơ chất và enzyme nên bố trí như thế nào?
- Ưu điểm: Thích hợp với quy mô nhỏ, dễ dàng thay thế enzyme (khi enzyme không bền)
- Nhược điểm: Thay thế màng định kỳ, giá thành màng thường cao
17
• Thiết bị phản ứng dạng cột (packed bed reactor)
- Có dạng hình trụ, được lấp đầy chất mang có gắn enzyme (cố định)
- Cơ chất (substrate, reactants, inlet) chảy qua khối enzyme cố định theo chiều từ dưới lên song song với trục dọc của thiết bị và không bị khuấy trộn ngược.
- Ưu điểm: Cơ chất được tiếp xúc đều với enzyme, thời gian lưu như nhau
- Nhược điểm: Lớp lọc dễ bị bịt kín do sự tạo keo hoặc do qúa trình liên kết, kết tủa của cơ chất, dẫn đến khó kiểm soát nhiệt, pH. Khó thu hồi enzyme sau phản ứng
18
• Thiết bị tầng sôi (Fluidized Bed Reactor):
- Là dạng trung gian giữa thiết bị dạng cột và thiết bị phản ứng liên tục có khuấy trộn. Bao gồm một lớp hạt enzyme cố định được thổi ngược lên phía trên nhờ
dòng cơ chất (feed) hoặc/và kết hợp với dòng khí (air, nitrogen, oxy), do đó các hạt enzyme luôn giữ ở trạng thái lơ lửng nhờ dòng cơ chất hoặc/và dòng khí (trạng thái sôi)
- Ưu điểm: Phù hợp với sản phẩm dạng khí, tăng khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất
- Nhược điểm: Kích thước và mật độ hạt enzyme cần đủ lớn để không bị rửa trôi khỏi thiết bị. Không thích hợp với vận tốc dòng lớn. Khó khăn khi nâng cấp thiết bị, do đặc tính thuỷ lực dòng chảy thay đổi khi thay đổi kích thước thiết bị
4.5 Ứng dụng của enzyme cố định
• Trong y học:
- Điều trị các bệnh thiếu hệ enzyme (tiêu hoá): Sử dụng enzyme
gói trong bao vi thể để tránh sự phá huỷ bởi các protease của cơ
thể (do phản ứng miễn dịch của cơ thể)
- Điều trị bệnh bạch cầu: Gói L-asparaginase trong bao vi thể
(microcapsule) để thuỷ phân L-asparagin (??)
- Làm tan các cục máu đông gây tác nghẽn động mạch bằng
streptokinase... hoặc
- Loại urea trong máu trong chạy thận nhân tạo bằng urokinase
gói trong bao vi thể
(Tham khảo thêm "Công nghệ enzyme" của Đặng Thị Thu,
2012, trang 67-90)
4.5 Ứng dụng của enzyme cố định (tiếp)
• Trong công nghệ hoá học, thực phẩm, dược phẩm: Tổng hợp
các chất dinh dưỡng, dược liệu, kháng sinh...
Enzyme cố định
Sản phẩm
Aminoacylase
L-amino acid
Aspartate amonialyase
L-aspartic acid
Aspartate decarboxylase
L-alanine
Glucoamylase
D-glucose
Gluco-isomerase
Siro nồng độ fructose cao
Invertase
Đường nghịch đảo
Lactase (ß-galactosidase)
Sữa không có lactose
Raffinase
Đường không có raffinose
Penicil ium amidase
Penicil in
21
Kết thúc chương 4
Bạn đang đọc truyện trên: Truyen2U.Pro