1. các lĩnh vực của bệnh cây có thể áp dụng CNSH
Bệnh cây học (phytopathology = plant patho logy) nghiên cứu 4 lĩnh vực chính:
1. Tác nhân gây bệnh (pathogens): nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học, phân loại, di truyền, tiến hóa của tác nhân gây bệnh.
2. Tương tác giữa tác nhân gây bệnh và cây ký chủ (plant-pathogen interaction): nghiên cứu cơ chế tấn công của tác nhân gây bệnh và cơ chế phòng thủ của cây, hậu quả của mối tương tác này đối với cây (các biến đổi cấu trúc và chức năng của tế bào và mô cây bị bệnh).
3. Dịch bệnh học (phytopathological epidemiology): nghiên cứu động thái phát triển của bệnh cây theo không gian và thời gian, các yếu tố của cây ký chủ, môi trường , tác nhân gây bệnh và con người ảnh hưởng đến sự hình thành và phát triển của bệnh.
4. Phòng chống: nghiên cứu các nguyên lý phòng chống, các biện pháp phòng chống.
2. đối tượng NC và ranh giới của di truyền quần thể, phả hệ học;
Di truyền quần thể nghiên cứu các quá trình vi tiến hóa (microevolution) xảy ra trong loài nhằm giải thích sự phân bố biến dị di truyền bên trong các quần thể hoặc giữa các quần thể của cùng loài. Phả hệ học nghiên cứu các quá trình đại tiến hóa (macroevolution) xảy ra trong loài nhằm giải thích mối quan hệ phả hệ (quan hệ tổ tiên – con cháu) dẫn tới sự phân bố của loài hiện tại theo không gian và thời gian
Phả hệ học và di truyền quần thể sử dụng các các công cụ phân tích di truyền khác nhau. Phân tích phả hệ sử dụng các đặc điểm đặc trưng cho loài nhằm xác định các đơn vị phân loại dựa trên 2 phương pháp là phương pháp phân nhánh (cladistics) và phương pháp kiểu hình (phenetics). Di truyền quần thể sử dụng các tần số allele tại các vị trí đa hình (polymorphic loci) nhằm xác định cấu trúc di truyền và ranh giới quần thể. Cả 2 lĩnh vực nghiên cứu trên đều nhằm làm sáng tỏ quá trình dẫn tới thành phần quần thể và loài hiện tại
3. khái niệm và hậu quả của đột biến (tần số đột biến chung)
Đột biến là 1 thay đổi trong DNA ở một locus nào đó của sinh vật
- Đột biến là một lực tiến hóa yếu để có thể làm thay đổi tần số allele nhưng là một lực tiến hóa mạnh để tạo ra một allele mới. Đột biến là nguồn chủ yếu để tạo thành các allele mới trong quần thể tác nhân gây bệnh. Do vậy, đột biến cũng cũng là nguồn chủ yếu để tạo thành các allele mới có khả năng tạo ra các kiểu gen mới của một tác nhân gây bệnh
- Đột biến đóng một vai trò quan trọng trong tiến hóa. Nguồn chủ yếu các biến dị di truyền là đôt biến. Đột biến quan trọng vì là bước đầu tiên của tiến hóa khi nó tạo ra các trình tự DNA mới cho môt gene
- Đối với tác nhân gây bênh có mối quan hệ gene-đối-gene đối với cây thì chúng ta đặc biệt quan tâm tới các đột biến làm tác nhân gây bệnh chuyển từ tính không độc sang tính độc vì đây là các đột biến dẫn tới mất tính kháng di truyền của cây ở cả hệ sinh thái nông nhiệp và hệ sinh thái tự nhiên. Tuy nhiên các đột biến làm tác nhân gây bệnh chuyển từ trạng thái mẫn cảm thuốc sang trạng thái kháng thuốc cũng quan trọng trong hệ sinh thái nông nghiệp vì chúng ảnh hưởng tới tính thích nghi của tác nhân gây bệnh.
4. khái niệm và ví dụ trôi dạt di truyền
Trôi dạt di truyền là 1 quá trình trong đó tần số allele của một quần thể bị thay đổi qua các thế hệ một cách hoàn toàn ngẫu nhiên
Một ví dụ về trôi dạt di truyền trong bệnh cây là trường hợp nấm Puccina striiformis gây bệnh gỉ sắt dạng sọc lúa mỳ ở Úc. Thông qua các phân tích phân tử, các nhà khoa học phát hiện thấy rằng nấm này đã tới Úc vào năm 1979 bằng 1 clone từ châu Âu vì trong 2 năm 1979-1980, chỉ 1 race của nấm này được phát hiện tại Úc và giống với 1 race của Châu Âu
5. khái niệm và ví dụ chọn lọc
Chọn lọc là một quá trình có định hướng dẫn tới tăng hoặc giảm tần số gen hay tần số kiểu gen. Chọn lọc xuất hiện nhằm phản ứng lại một yếu tố môi trường đặc biệt nào đó. Hậu quả của chọn lọc lên cấu trúc và tiến hóa của sinh vật là phức tạp.
Chọn lọc có thể làm giảm biến dị di truyền trong quần thể sinh vật bằng giữ lại hoặc loại bỏ 1 gen hoặc 1 tổ hợp gen đặc biệt nào đó (chọn lọc có định hướng).
Chọn lọc có thể làm tăng biến dị di truyền trong quần thể nhờ giữ lại nhiều gen hoặc tổ hợp gen đặc biệt nào đó và loại bỏ các dạng trung gian (chọn lọc ngắt quãng, chọn lọc cân bằng).
Chọn lọc có thể dẫn tới biệt hóa loài nhờ tích lũy các biến dị di truyền thích nghi trong quần thể biệt lập về sinh sản.
Chọn lọc có thể ngăn sự biệt hóa loài bằng cách đồng nhất cấu trúc di truyền của các quần thể tại các địa điểm khác nhau.
Chọn lọc trong bệnh cây chủ yếu được xét trong phạm vi quá trình đồng tiến hóa gen-đối gen. Nó là quá trình làm tăng tần số allene kháng trong hệ sinh thái tự nhiên thông qua quá trình đồng tiến hóa, làm tăng tần số allele độc trong hệ sinh thái nông nghiệp qua chu trình “đỉnh – đáy”
Có 2 mô hình chọn lọc các biến dị di truyền có thể trả lời câu hỏi này là mô hình cân bằng và mô hình trung tính
6. khái niệm và mô hình giao lưu gen
Giao lưu gene/kiểu gen (hay di cư gen/kiểu gen) là quá trình chuyển vật liệu di truyền (dưới dạng gen/kiểu gen) từ quần thể này sang quần thể khác của cùng loài
A)Mô hình lục địa – đảo (Continent-island);
B) Mô hình toàn đảo (Full island);
C) Mô hình bắc cầu một hướng (One-dimensional stepping stone);
D) mô hình bắc cầu hai hướng (two-dimensional stepping stone
Mô hình Lục địa – Đảo do Sewall Wright, một nhà di truyền quần thể, đề xuất.
Diễn giải mô hình
Mô hình giả thiết giao lưu gen chỉ xảy ra một chiều từ quần thể cho (lục địa) sang quần thể nhận (đảo).
Giả sử a là một allele mang đột biến độc xuất hiện tại một locus (A là allele không độc tương ứng). Giả sử tần số của allele a là f(a) = q và tần số tương ứng của A là f(A) = p.
m = là tỷ lệ quần thể di cư ra đảo
1-m = tỷ lệ quần thể bản địa có sẵn trên đảo
Q = Tần số allele a của quần thể di cư ra đảo
qo = Tần số allele a của quần thể bản địa tiếp nhận allele a từ quần thể di cư
Sau một chu kỳ giao lưu gen chúng ta có:
q1 = (1-m)qo + mQ
q = -m(qo - Q)
Trong đó q = q1-q0
Công thức này có thể được dùng để tính tốc độ thay đổi tần số allele do giao lưu gen.
7. siêu quần thểkhái niệm ;
Một siêu quần thể (metapopulation) là 1 tập hợp các quần thể địa phương liên hệ với nhau bởi sự di cư của các cá thể. Các quần thể địa phương có thể trải qua các chu trình diệt vong và tái phục hồi; trái lại siêu quần thể có thể tương đối ổn định. Một siêu quần thể là một quần thể của các quần thể.
Các mô hình siêu quần thể có thể giúp giải thích các tác nhân gây bệnh đã tiến hóa như thế nào trong hệ sinh thái nông nghiệp
Mô hình siêu quần thể nhìn chung không áp dụng cho các nhóm tác nhân gây bệnh luôn tạo ra các cấu trúc (dạng bảo tồn) lâu dài, có thể tồn tại qua đông hoặc chuyển vụ ngay tại chỗ.
Một ví dụ rất tốt về mô hình siêu quần thể là mô hình bệnh gỉ sắt cây cốc (lúa mỳ, lúa miến và yến mạch (wheat, barley, and oats) hàng năm theo đường hướng Puccinia "Puccinia pathway" ở Bắc Mỹ.
8. khái niệm hệ thống sinh sản-ghép cặp, đối tượng áp dụng (chú ý Phytophthora
Hệ thống ghép căp (Mating systems) thường được định nghĩa là lượng tự phối xuất hiện trong quần thể các sinh vật sinh sản hữu tính và được đánh giá bằng hệ số tự phối (inbreeding coefficient) thường được viết tắt là F (hay chỉ số cố định Fixation index = F)
Một số tác nhân gây bệnh cũng có kiểu ghép cặp tương hợp di truyền. Một ví dụ là các loài nấm Phytophthoa nhóm đồng tản có nghĩa là tự thụ (bảng ). Kết quả của sự ghép cặp tương hợp di truyền là một quần thể có cấu trúc di truyền được đặc trưng bởi sự chiếm ưu thế của các cá thể đồng hợp tử và có mức đa dạng kiểu gen thấp. Nhiều chu kỳ tự phối sẽ tạo ra các dòng thuần nhất (clonal lines) trong các quần thể này
9. đặc điểm (kích thước) bộ gien nấm, vi khuẩn, virus và tuyến trùng
1.1. Bộ gen virus
Virus thực vật có bộ gen cũng rất nhỏ, mã hóa ít gen. Mặc dù bộ gen virus rất đơn giản nhưng cực kỳ đa dạng.
Khoảng 25% số virus thực vật có bộ gen dạng DNA dạng vòng, sợi đơn hoặc kép. Các gen trên bộ gen virus có thể được mã hóa cùng chiều hay ngược chiều kim đồng hồ
Khoảng 75% các virus thực vật còn lại là các virus RNA. Các virus RNA cũng có thể có bộ gen sợi đơn hoặc sợi kép. Bộ gen của chúng có thể được gọi là cực (+) nếu được dịch mã trên sợi virus hoặc cực (-) nếu được dịch mã trên sợi trung gian trong quá trình tái sinh, hoặc lưỡng cực. Phần lớn virus thực vật có bộ gen RNA sợi đơn, cực +.
Bộ gen của virus có thể phân mảnh hoặc không phân mảnh. Đối với các virus có bộ gen phân mảnh thì các phân tử genome của chúng có thể được lắp ráp trong cùng một phân tử hoặc được lắp ráp trong các phân tử khác nhau.
Các gen của virus không chứa intron. Đối với một số virus, protein của chúng có thể có thể được xử lý hậu dịch mã để hình thành các protein chức năng.
Một số virus RNA trong quá trình tái sinh có thể hình thành các phân tử RNA có kích thước nhỏ hơn kích thước bộ gen virus gọi là bộ gen phụ (subgenomic). Các phân tử bộ gen phụ này cũng mã hóa các protein như của bộ gen chính.
Một số virus (cả DNA và RNA) có thể có các phân tử vệ tinh (satellite). Các phân tử vệ tinh này phải nhờ virus để tái sinh và phát tán.
Một số ví dụ
1. Các begomovirus nhóm bộ gen đơn (gây bệnh xoăn vàng lá cà chua): bộ gen sợi vòng đơn (gọi là DNA-A), kích thước ~ 2.7 kb; bộ gen gồm 6 gen mã hóa theo 2 chiều ngược nhau.
1.2. Bộ gen của vi khuẩn và phytoplasma
có cấu trúc đơn giản. Phần lớn chúng có bộ gen là một phân tử DNA sợi kép dạng vòng. Gần đây người ta đã chứng minh một số vi khuẩn có bộ gen dạng sợi thẳng (chẳng hạn phần lớn vi khuẩn thuộc chi Streptomyces). Ngoài DNA genome, đa số vi khuẩn còn mang một hoặc nhiều phân tử plasmid.
Bộ gen vi khuẩn nhìn chung có kích thước nhỏ (trong phạm vi từ 0.5 tới 10 Mb).
Bộ gen không chứa intron dẫn tới các gen có thể được gọi là các ORF. Một số gen có thể gối lên nhau. Một số gen có kích thước rất nhỏ (<60 bp).
Ví dụ. Bô gen của Ralstonia solanacearum (gây bệnh héo xanh vi khuẩn nhiều loại cây trồng). Bộ gen của R. solanacearum gồm 2 phân tử DNA vòng có kích thước lớn. Phân tử thứ nhất là nhiễm sắc thể của vi khuẩn (có kích thước 3.7 Mb) còn phân tử kia gọi là siêu plasmid (megaplasmid, có kích thước 2.1 Mb). Phân tử plasmid này cũng mã hóa nhiều gen quan trọng của vi khuẩn.
1.3. Bộ gen nấm
Nấm là các sinh vật nhân thật, các gen cũng được mã hóa trên các nhiễm sắc thể khác nhau. Phần lớn nấm có kích thước bộ gen nhỏ hơn so với thực vật. Kích thước bộ gen trung bình của nấm khoảng 14 Mb.
So với thực vật và động vật bậc cao, nấm có tỷ lệ DNA không mã hóa thấp hơn nhiều (chỉ khoảng 10 – 20 %).
Khoảng 30 % bộ gen nấm chứa các chuỗi lặp. Các chuỗi lặp này có tiềm năng là marker phân tử vì chúng có số copy cao.
Một điểm rất quan trọng (khi xét đến việc lựa chọn marker phân tử): ngoại trừ nấm đảm (ví dụ như nấm than đen, gỉ sắt), thì ở các loại nấm khác, giai đoạn đơn bội (haploid) chiếm ưu thế trong chu kỳ phát triển.
Ngoài ra, bộ nhiễm sắc thể của nấm có thể rất đa dạng. Ở nhiều loài nấm, thậm chí số lượng và kích thước nhiễm sắc thể có thể khác nhau giữa các isolate (vd như đối với nấm Colletotrichum type B và Fusarium oxysporum fsp.cubense
10. đặc điểm bộ gien (bản chất, kích thước, số protein) của begomovirus, potyvirus;
. Các begomovirus nhóm bộ gen đơn (gây bệnh xoăn vàng lá cà chua): bộ gen sợi vòng đơn (gọi là DNA-A), kích thước ~ 2.7 kb; bộ gen gồm 6 gen mã hóa theo 2 chiều ngược nhau
Các potyvirus như papaya ringspot virus (PRSV), potatovirus Y (PVY): bộ gen RNA sợi đơn cực dương, kích thước khoảng 10 kb, chứa 1 đầu 5’UTR và 1 đầu 3’UTR. Đầu 3’UTR tận cùng bằng 1 chuỗi polyadenine. Bộ gen chứa 1 ORF lớn mã hóa 1 polyprotein và được xử lý sau dịch mã thành 10 protein chức năng
11. vùng gien thường được lựa chọn của virus thực vật
Virus nói chung có kích thước bộ gen rất nhỏ, mã hóa chỉ một số ít gen chịu trách nhiệm nhiều chức năng sống của virus trong đó có 4 chức năng quan trọng là cấu trúc (lắp ráp phân tử virus), tái sinh, di chuyển (trong nội bộ tế bào, giữa các tế bào và hệ thống trong cây).
Một trong các gen được sử dụng phổ biến nhất trong nghiên cứu đa dạng và phân loại đối với virus thực vật là gen mã hóa vỏ protein (CP gen). Thông thường, gen CP của virus là một protein đa chức năng, trong đó chức năng chủ yếu nhất là cấu trúc.
Ví dụ, đối với potyvirus, nhóm virus chiếm tới 20% tổng số virus thực vật, người ta thường nghiên cứu mức đa dạng dựa trên phân tích chuỗi gen CP.
12. phạm vi áp dụng và lý do chọn vùng DNA ribosome
DNA ribosome (rDNA), đặc biệt là vùng mã hóa các tiểu phần rRNA và các spacers liên quan của nó, là một trong các vùng DNA được sử dụng phổ biến nhất trong nghiên cứu đa dạng đối với sinh vật nhân thật (karyote) và tiền nhân (prokaryote)
rDNA là một vùng gen quan trọng trong nghiên cứu đa dạng và phân loại vì
- Là một vùng gen có mặt ở tất cả các đối tượng có cấu tạo tế bào.
- Các gen nằm trên rDNA có cả cùng bảo thủ lẫn vùng biến động và do vậy có thể được dùng để so sánh các chi khác nhau.
- Các vùng spacer biến động hơn rất nhiều và do vậy có thể dùng để so sánh các loài khác nhau, và trong một số trường hợp có thể ở mức dạng chuyên hóa.
Về mặt kỹ thuật, trên rDNA của có nhiều vị trí cắt giới hạn, do vậy tạo điều kiện thuận lợi cho cloning.
Các nghiên cứu đầu tiên đối với rDNA thường áp dụng kỹ thuật RFLP + lai hóa bằng dò + DNA tổng số được cắt bằng RE
Gần đây hơn (khoảng 1990>+, các kỹ thuật trên được thay thế bằng PCR và có thể được sử dụng ngay trên mẫu cây nhiễm tác nhân gây bệnh (nấm, vi khuẩn)
13. nấm và vi khuẩn được sử dụng
Đối với nấm, một số gen phổ biến đã được sử dụng là các gen mã hóa actin, tubulin, yếu tố qui định kéo dài sự dịch mã (elongation factors), cytochromes, proteases, và nhiều protein khác. Các gen này nhìn chung bảo thủ cao thậm chí gữa các sinh vật thuốc các đơn vị phân loại khác nhau. Tuy nhiên, vì chúng chứa các chuỗi intron ngắn rất biến động về số lượng cũng như vị trí trên gen nên có thể được sử dụng làm marker phân tử nhằm nghiên cứu các sinh vật có quan hệ gần. Ví dụ: nhiều nấm đã được nghiên cứu dựa trên các gen mã hóa là Fusarium, Ascochyta, và Phoma.
Đối với vi khuẩn, nhiều loại gen mã hóa có thể được sử dụng. Một số ví dụ là gen virD2 (Agrobacterium), gen mã hóa pectate lyase (pel) (Erwinia carotovora), gen mã hóa protein không độc avrBS2 (Xanthomonas).
14. phân loại và ví dụ các chuỗi lặp
1.1.1 Các chuỗi lặp liền kề (tandem repetitive sequences)
- Chuỗi DNA vệ tinh đơn (satellite DNA). Gồm các đoạn 5 – 10 bp, lặp lại khoảng 100 lần
- Minisatellites. Gồm các đoạn 15-100 bp, lặp lại khoảng 20-50 lần
- VNTR (variable number tandem repeat): gồm các đoạn lặp có chiều dài rất thay đổi ( ~ 1-2000 bp)
- Microsatellites: gồm các đoạn lặp 2-4 bp, lặp lại khoảng 20-50 lần. Các microsatellite là các các chuỗi lặp rất quan trọng, đặc biệt trong nghiên cứu đa dạng của eukaryote nên được trình bày riêng.
1.1.2 Các chuỗi lặp phân bố rải rác (Dispersed repetitive sequences)
Đây là các chuỗi DNA có kích thước khác nhau và lặp lại nhiều lần nhưng không liền kề nhau mà phân bố rải rác khắp bộ gen. Một ví dụ điển hình là các yếu tố di động (mobile elements = gen nhảy).
Đối với eukaryote, các chuỗi lặp phân bố rải rác có thể có kích thước ngắn (Short interspersed elements, SINES) từ 150 - 300 bp (ví dụ chuỗi lặp Alu ở người có kích thước 300 bp, lặp lại từ 0.5 – 1 triệu lần trong bộ gen, chiếm ~5% tổng DNA). Các chuỗi lặp có thể có kích thước dài (Long interspersed elements (LINES)) với kích thước 5000 - 7000 bp.
Đối với prokaryote, bộ gen của chúng cũng chứa nhiều loại chuỗi lặp phân bố rải rác. Một số chuỗi lặp có ý nghĩa trong nghiên cứu đa dạng và phân loại vi khuẩn là:
- Các chuỗi lặp đối song (REP, repetitive extragenic palindromic) có kích thước 35 - 40 bp.
- Các chuỗi lặp bảo thủ vùng liên gen (ERIC, enterobacterial repetitive intergenic consensus) có kích thước 124 - 127 bp.
- Nguyên tố BOX có kích thước 54-bp.
15. khái niệm marker phân tử
Một marker di truyền có thể được định nghĩa theo 1 trong các cách sau:
- Một dấu hiệu trên nhiễm sắc thể hoặc allele cho phép xác đinh một vùng DNA đặc biệt.
- Một đoạn DNA đặc biệt với vị trí đã biết trên genome
- Một gen mà biểu hiện kiểu hình của nó thường được phân biệt dễ dàng, được sử dụng xác định một cá thể hoặc 1 tế bào mang nó, hoặc như một dò để đánh dấu 1 nhân, nhiễm sắc thể hay locus (King and Stansfield, 1990).
Marker di truyền có thể được chia làm 3 nhóm chính:
- Các tính trạng hình thái có thể quan sát bằng mắt.
- Các marker sinh hóa dựa trên sản phẩm gen (isozyme, allozyme, acit béo…)
Các marker phân tử dựa trên các thử nghiệm liên quan đến DNA
16.trình tự và ưu nhược điểm của RFLP, AFLP, SSR;
. RFLP
- Cắt DNA mẫu bằng 1 hoặc nhiều RE
- Tách sản phẩm cắt bằng điện di agarose
- Chuyển các sản phẩm đã tách từ gel agarose sang màng bằng Southern bloting.
- Phát hiện các đoạn bằng lai DNA với dò (probe) thích hợp.
- Hình ảnh hóa (autoradiography) phụ thuộc nhãn dò (bức xạ hay huỳnh quang)
RFLP: Các ưu điểm chính
- Có khả năng lặp lại cao (giữa các phòng thí nghiệm)
- Xác định được di truyền đồng trội
- Marker có tính đặc hiệu locus (nên trình tự bảo thủ của các gen của các sinh vật có quan hệ gần gũi có thể được xác định)
- Không yêu cầu thông tin chuỗi
- Dễ ghi điểm do kích thước các băng thường khác nhau đáng kể
RFLP: Các hạn chế chính
- Yêu cầu số lượng và chất lượng DNA cao
- Việc xây dựng bộ dò khá phức tạp
- Không thể tự động hóa được (nên tốn công sức và chi phí)
- Mức độ đa hình thấp, chỉ một số ít locus được nghiên cứu trong một lần thử
- Tốn thời gian, lao động và đắt
- Dò yêu cầu gán nhãn bức xạ nên độc hại (hiện nay thường gán nhãn huỳnh quang an toàn hơn nhưng đắt)
15.2. AFLP
- Tinh chiết DNA của tác nhân gây bệnh. Vì bước tiếp theo là cắt bằng enzyme cắt giới hạn nên, giống như đối với kỹ thuật RFLP, chất lượng DNA là yêu cầu quan trong.
- Cắt DNA bằng 2 RE, thường 1 ER có chuỗi cắt hiếm (như EcoRI) còn ER kia có chuỗi cắt phổ biến hơn.
- Nối sản phẩm cắt với adaptor (chứa chuỗi ER). Sản phẩm nối là khuôn cho phản ứng PCR tiếp theo. Trình tự adapter và trình tự của RE là trình tự găn mồi của bước tiếp theo.
- PCR lần 1 (preselective amplification): sử dụng 2 mồi tiền chọn lọc. Trình tự mồi tiền chọn lọc là trình tự adapter + trình tự của RE + 1 nucleotid được thêm vào đầu 3’. Sản phẩm PCR lần 1 (hòa loãng) được sử dụng làm khuôn cho PCR lần 2. Chú ý: đối với một số protocol, mồi tiền chọn lọc có thể không chứa 1 nucleotid bổ sung.
- PCR lần 2 (selective amplification): sử dụng 2 mồi chọn lọc. Trình tự mồi chọn lọc là trình tự mồi tiền chọn lọc + 2 nucleotid được thêm vào đầu 3’. Số lượng nucleotid (1,2,3) thêm vào đầu 3’ sẽ tăng mức độ chọn lọc đồng thời giảm số sản phẩm PCR tương ứng từ 4, 16 và 64 lần). Một trong 2 mồi chọn lọc thường được đánh dấu bức xạ hoặc huỳnh quang nhằm phân tích điện di tự động. Nhiều cặp mồi chọn lọc có thể được được sử dụng để đánh giá chính xác mức độ đa hình.
- Sản phẩm PCR là các băng chung + các băng khác nhau giữa các mẫu. Sản phẩm PCR có thể được điện di agarose nhưg phổ biến hơn là điện di poyacrylamide (+ nhuộm AgNO3 hoặc đánh dấu bức xạ, huỳnh quang) hoặc điện di dùng sequencer. Các băng khác nhau này là các DNA đa hình và sẽ được đánh giá dùng phần mềm thích hợp.
AFLP: ưu điểm
- Độ tin cậy và khả năng lặp lại cao
- Không cần biết trước về thông tin genome của đối tượng nghiên cứu.
- Rất giàu thông tin vì có thể đánh giá đồng thời nhiều locus (có nghĩa có khả năng đánh giá đa hình trên toàn bộ bộ gen) với chỉ một cặp mồi và trên một lần chạy điện di (lợi thế quan trọng nhất so với RFLP, RAPD và microsatellite + các kỹ thuật tương tự)
- Các sản phẩm cùng kích thước phần lớn là cùng nguồn (homology) và đặc hiệu locus (trừ ngoại lệ là các loài đa bội)
AFLP: nhược điểm
- Yêu cầu nhiều bước để thực hiện
- Giống như đối với kỹ thuật RFLP, chất lượng DNA yêu cầu cao (vì bước đầu tiên sau khi chiết DNA là cắt bằng RE).
- Phát hiện sản phẩm bằng điện di polyacrylamide (+ nhuộm AgNO3 hoặc đánh dấu bức xạ hoặc đánh dấu huỳnh quang) hoặc điện di bằng sequencer <=> đắt và tốn lao động hơn
- Đắt hơn vì phải thêm chi phí RE + adapter.
- Giống như đối với RAPD, phần lớn các locus AFLP là trội nên không phân biệt được cá thể đồng hợp tử trội với cá thể dị hợp tử. Điều này làm giảm tính sát thực (accuracy) trong phân tích di truyền quần thể, lập bản đồ di truyền và chọn lọc bằng marker phân tử đối với các loài giao phối bắt buộc.
15.3. SSR
Các bước chính trong phân tích microsatellite bao gồm
Xây dựng thư viện microsatellite
Xác định loci microsatellite duy nhất
Xác định vùng thích hợp để thiết kế mồi
Thử PCR
Đánh giá và diễn giải các băng
Đánh giá sản phẩm PCR tao sự đa hình.
Microsattelite: ưu điểm chính
- Là marker đồng trội => cực kỳ tuyệt vời cho phân tích di truyền quần thể đối với các sinh vật giao phối.
- Có thể tự động hóa nếu mồi được gán nhãn huỳnh quang và được phân tích trên máy sequencer tự động.
- Nếu bộ mồi đã được lựa chọn thì việc áp dụng tương đối dễ dàng.
Microsattelite: nhược điểm chính
- Như đã trình bày, việc xây dựng thư viện microsattelite và chọn lựa mồi thích hợp là cực kỳ tốn kém công sức và tiền bạc.
- Các sản phẩm PCR trong phân tích microsatellite thường có kích thước nhỏ (một vài trăm bp) và chênh lêch kích thước nhiều khi không nhiều dẫn tới phải điện di agarose nồng độ cao (~3 %) hoặc điện di polyacrylamide hoặc phân tích dùng máy sequencer tự động (đắt).
17.đặc điểm và phân loại microsatellite
Microsatellite (còn được gọi là các chuỗi lặp đơn giản = simple sequence repeats (SSRs), các chuỗi lặp liền kề ngắn = short tandem repeats (STRs) hay các đoạn đa hình chuỗi đơn giản = simple sequence length polymorphisms (SSLPs) là nhóm các chuỗi DNA đơn giản lặp lại nhỏ nhất. Microsatellite là các chuỗi lặp, tùy theo tác giả, 1-5, 1-6 hoặc 2 - 8 nts.
Các chuỗi lặp thường đơn giản, bao gồm 2, 3, 4 nucleotid (gọi là di-, tri-, and tetranucleotide repeats). Một ví dụ phổ biến của microsatellite là 1 dãy chuỗi lặp 2 dinucleotide (CA)n, trong đó n là tổng số chuỗi lặp nằm trong phạm vi từ 10 – 100. Các marker này thường tạo ra mức đa hình cao trong nội bộ loài và giữa các loài, đặc biệt khi số chuỗi lặp n bằng 10 hoặc lớn hơn.
Microsatelite là một trong các marker phân tử được sử dụng rộng rãi nhất vì nó có một đặc điểm quan trọng là có tốc độ đột biến cao hơn các phần khác của bộ gene.
Các microsatellite được phân loại theo loại chuỗi lặp như sau:
- Microsatellite hoàn hảo: gồm các chuỗi lặp đều đặn chẳng hạn TATATATATATATATA.
- Microsatellite không hoàn hảo: có một bp nằm xen giữa các chuỗi lặp (Vd TATATATACTATATA).
- Microsatellite gián đoạn: có các chuỗi nhỏ khác nằm bên trong (Vd TATATACGTGTATATATATA).
Microsatellite phức: gồm 2 chuỗi lặp khác nhau (Vd TATATATATAGTGTGTGT
18.khái niệm và đối tượng áp dụng của marker trội và đồng trội
19.phân loại các kỹ thuật dựa trên số băng điện di;
Các loại marker phân tử khác nhau sẽ cho các kết quả điện di khác nhau. Ví dụ kỹ thuật RFLP và một số kỹ thuật fingerprinting khác như microsatellite (SSR) nhìn chung sẽ tạo các băng điện di đơn, thường từ 1 – 20 băng. Các băng này có thể dễ dàng chuyển sang dạng số liệu nhị nguyên (có băng = 1, không có băng = 0). Dựa trên số liệu này, người ta có thể tính toán mức tương đồng di truyền S (xem các công thức tính hệ số tương đồng) và khoảng cách di truyền D (=1-S), cuối cùng là xây dựng một cây phả hệ thường thông qua phân tích cụm.
Phân tích dựa trên băng điện di giống nhau cho 2 nhóm phân tích.
- Nhóm 1 thường tạo ít băng (điển hình RFLP, microsatellite, ISSR)
- Nhóm 2 thường tạo rất nhiều băng phức tạp (điển hình AFLP, rep-PCR). Mặc dù các băng có thể được đánh giá và ghi bằng tay thì thông thường người ta dùng một 1 phần mềm hình ảnh để scan các băng, điều chỉnh, chọn lựa và chuyển sang dạng số liệu nhị thức
20.Định nghĩa và công thức tính đa dạng gen (hj; Hi)
Mức đa dạng di truyền Nei là xác suất để 2 allele bất kỳ tại một locus được lấy ngẫu nhiên trong quần thể là khác nhau.
Có 3 cách tính :
- (khi một locus chỉ có 2 allele)
- (khi một locus thứ j có i allele)
- (khi tính trung bình cho tất cả các locus
Trong đó,
hj = mức dị hợp tử (heterozygosity) trên locus
p và q = các tần số allele
H = mức dị hợp tử (heterozygosity) trung bình trên nhiều locus
L = tổng số locus
H là một ước lượng mức độ biến dị di truyền trong quần thể, được tính bằng cách lấy 1 trừ tần số đồng hợp tử tại 1 locus. Quá trình được lặp lại cho tất cả các locus và được lấy trung bình.
H có thể được áp dụng cho cả 2 loại marker (trội và đồng trội).
H có giá trị từ 0 đến 1
H đạt giá trị tối đa khi tất cả các allele có tần số bằng nhau.
Để đảm bảo ý nghĩa thống kê, nên phân tích khoảng 30 locus / 20 cá thể /quần thể.
21. phạm vi áp dụng các hệ số tương đồng
Giả sử so sánh hai cá thể thứ i và j. Gọi
- Số băng giống nhau của 2 cá thể là a
- Số băng chỉ xuất hiện ở cá thể i là b
- Số băng chỉ xuất hiện ở cá thể j là c
- Số băng không xuất hiện ở cả 2 cá thể (nhưng xuất hiện ở các cá thể khác) là d
Hệ số Nei & Li (1979) hay còn gọi là hệ số Dice (1945)
Công thức tính là:
Hệ số Nei & Li tính tất cả các băng có mặt ở 2 cá thể và tính điểm gấp đôi các băng chung (2a). Vì nó cho rằng các băng thiếu không có ý nghĩa sinh học nên có thể xem hệ số này có ý nghĩa tương tự so sánh chuỗi DNA.
Hệ số Nei & Li đươc áp dụng cho các marker đồng trội như RFLP và SSR
Hệ số Jaccard (1908):
Công thức tính là:
Hệ số Jaccard không tính các băng thiếu, chỉ tính các băng có mặt đối với cả 2 cá thể. Các băng thiếu ở cả 2 cá thể được xem là số liệu bị mất.
Hệ số Jaccard có thể được áp dụng với các marker đồng trội.
Hệ số Sokal and Michener (1958) hay còn gọi là hệ số phù hợp đơn giản SMC (simple matching coefficient)
Công thức tính là
Hệ số SMC tính cả băng không có mặt vì cho rằng băng thiếu tương ứng với các allele đồng hợp tử lặn.
Hệ số SMC có thể được sử dụng với các marker trội như RAPD và AFLP
22.Khái niệm GenBank;
Genbank là một cơ sở dữ liệu chứa tất cả các chuỗi nucleotide công cộng trên toàn thế giới. Cho tới 2008, đã có hơn 80 triệu chuỗi gen, đại diện cho hơn 260000 loài sinh vật có tên trên GenBank. Các chuỗi gen của loài mới được gửi lên GenBank với tốc độ khoảng 1700 loài /tháng.
Genbank là được thành lập, duy trì và quản lý tại Trung tâm Thông tin CNSH Quốc gia Mỹ (NCBI, National Center for Biotechnology Information).
Thông tin về các chuỗi DNA/protein, nhiều phần mềm CNSH cũng như nhiều bài báo khoa học có thể truy cập từ website của NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
Website của NCBI là một trong các địa chỉ bắt buộc cho các nhà nghiên cứu đang thực hiện các phân tích chuỗi DNA/RNA/protein.
23.phần mềm dùng để tìm kiếm chuỗi tương đồng trên GenBank; format FASTA;
BLAST là một phần mềm trực tuyến tại NCBI cho phép tìm kiếm các chuỗi DNA/protein từ cơ sở dữ liệu GenBank. Sau khi đã giải trình tự một chuỗi DNA, chúng ta muốn biết chuỗi này giống với chuỗi nào trên cơ sở dữ liệu
24.mục đích sử dụng phần mềm Clustal;
Để so sánh mức độ đa dạng của các chuỗi DNA/protein, đầu tiên, người ta phải thực hiện phép căn trình tự đa chuỗi (multiple sequence alignment). Có nhiều phần mềm tin sinh thực hiện phép căn trình tự đa chuỗi, trong đó phần mềm tốt nhất hiện nay là Clustal. Phiên bản mới nhất của phần mềm này là ClustalW. ClustalW có thể được sử dụng như một phần mềm riêng biệt là ClustalX (sử dụng giao diện window) hoặc được tích hợp trong một số gói phần mềm phân tích trình tự như BioEdit, MEGA…. Các phần mềm trên có thể tải miễn phí từ các địa chỉ sau:
. Clustal: http://www.clustal.org/download/current/
25.khái niệm khoảng cách di truyền phân tử;
Khoảng cách di truyền phân tử giữa 2 chuỗi là số các sự kiện tiến hóa (thường là số lượng thay thế nucleotide/vị trí) xuất hiện kể từ khi 2 chuỗi phân tách từ một tổ tiên chung.
Có thể định nghĩa đơn giản như sau: khoảng cách di truyền giữa 2 chuỗi là số thay thế nucleotide trên vị trí.
Như vậy khoảng cách di truyền phân tử có thể lớn hơn 1
Khoảng cách di truyền là cơ sở cho việc xây dựng cây phả hệ (phylogenetic tree) bằng các phương pháp khoảng cách.
Tính khoảng cách di truyền khi so sánh các chuỗi DNA (và protein) cực kỳ phức tạp và phải căn cứ vào nhiều yếu tố, đặc biệt là mô hình thay thế nucleotide (cho phân tích chuỗi DNA) hoặc ma trận thay thế aa (cho phân tích chuỗi protein).
26.bản chất mô hình thay thế Jukes-Cantor và Kimura 2 tham số;
Có rất nhiều mô hình thay thế nucleotide đã được đề xuất. Dưới đây là 2 mô hình:
Mô hình Jukes-Cantor
Đây là một mô hình thay thế nucleotide đơn giản. Nó có các giả thiết sau:
- Tốc độ thay thế nucleotide là giống nhau cho tất cả 4 loại nucleotide (A, T, G, C) (= a)
- Tần số các nucleotide là giống nhau.
Mô hình Kimura 2 tham số (Kimura – 2 paameter model)
Đây là một mô hình thay thế phức tạp hơn (nhưng hiện thực hơn). Nó có các giả thiết sau:
- Tốc độ thay thế nucleotide là không giống nhau cho tất cả 4 loại nucleotide (A, T, G, C). Tốc độ thay thế đồng hoán vị (transition) giữa các purin (A <=> G) hoặc giữa các pyrimidin (C <=> T) là giống nhau (= a) nhưng khác tốc độ thay thế dị hoán vị (transvergen) giữa 1 purin và 1 pyrimidin (A hoặc G <=> C hoặc T) (=β).
- Tần số các nucleotide là giống nhau..
27.đặc điểm phương pháp Parsimoni, khoảng cách NJ;
Đây là phương pháp dựa trên đánh giá sai khác nucleotide tại từng vị trí trên chuỗi chứ không phải dựa trên khoảng cách di truyền Phương pháp sẽ tìm tất cả các cây có thể và đánh giá các cây này bằng cách cho điểm mỗi cây dựa vào số thay đổi tiến hóa cần có để giải thích số liệu hiện tại. Cây tốt nhất là cây có tổng số thay đổi tiến hóa (số thay thế nucleotide) ít nhất đối với tất cả các chuỗi phân tích hiện tại khi tiến hóa từ một tổ tiên chung.
Triết lý: “cái tốt nhất là cái đơn giản nhất
Đây là phương pháp phổ biến trong xây dựng cây phả hệ. Phương pháp đặc biệt tốt khi so sánh các chuỗi có mức tương đồng cao.
Nhược điểm là: (2) phương pháp thường không cho các cây đúng khi so sánh các chuỗi có mức đa dạng cao; (1) tốc độ phân tích rất chậm
28.phần mềm dùng để xây dựng cây phả hệ
MEGA
29.các khám phá của Craig Mello và Andrew Fire (1998);
Năm 1998, Craig Mello và Andrew Fire (và 4 tác giả khác) đã công bố trên tạp chí Nature một công trình nghiên cứu nhằm tìm hiểu vai trò của RNA đến sự biểu hiện gen. Các tác giả đã sử dụng một số gen của tuyến trùng Caenorhabditis elegans như unc-22 (mã hóa protein myofilament, liên quan đến co cơ, có nhiều nhưng không cần thiết), unc-54 (mã hóa protein myosin liên quan đến co cơ), fem-1(mã hóa protein chứa ankyrin liên quan đến sinh sản), hlh-1 (mã hóa protein họ myoD cần cho di chuyển và biệt hóa hình dạng), và mex (mã hóa cho 1 protein có nhiều ở phôi). Ba phát hiện quan trọng từ công trình này là
- Các đoạn dsRNA tương ứng với vùng intron hoặc promoter không tạo ra hiện tượng câm (silencing) của gen tương ứng. Như vây sự can thiệp (interfering) của RNA là ở mức hậu phiên mã (post-transcriptional level).
- Khi tiêm các RNA ở dạng cùng chiều (sense) hay ngược chiều (antisense) vào tuyến trùng đã không ảnh hưởng tới lượng mRNA của gen tương ứng tức không làm ảnh hưởng tới sự biểu hiện của gen. Tuy nhiên khi tiêm các RNA ở dạng sợi kép dsRNA (hỗn hợp của RNA cùng chiều và ngược chiều) đã làm câm (silence) gen tương ứng. Như vậy hiện tượng câm gen (gene silencing) được thực hiện thông qua trung gian là RNA sợi kép (dsRNA).
- Khi tiêm dsRNA vào một vị trí thì hiện tượng câm gen xuất hiện ở các vị trí khác trong cơ thể tuyến trùng. Như vậy dấu hiệu câm gen có thể di truyển hệ thống.
Hiện tượng câm gen do dsRNA đã được các tác giả đặt tên là RNA interfering (sự can thiệp của RNA). Vì nghiên cứu này, Craig Mello và Andrew Fire đã được trao giải Nobel y học năm 2006.
30.định nghĩa và so sánh siRNA, miRNA;
30.1 siRNAs - định nghĩa
siRNAs là các phân tử RNA sợi kép nhỏ, kích thước khoảng 21-25 nts, được tạo ra bởi Dicer, một RNA endonuclease nhóm III, là thành phần quan trong của phức hợp RISC gọi là siRISC có chức năng phân hủy mRNA đồng dạng của nó.
30.2 miRNAs - định nghĩa
miRNAs là các phân tử RNA sợi đơn nhỏ, kích thước khoảng 22 nts, có chức năng điều hòa biểu hiện gen, và được hình thành từ một phân tử RNA tiền chất (precursor miRNA). Phân tử RNA tiền chất có kích thước lớn khoảng 70 nts, có cấu trúc kẹp tóc và được phiên mã từ vùng không mã hóa của gen.
Giống nhau
- Đều là các phân tử RNA sợi kép (hoac don) nhỏ (miRNA = 21-22 bp; siRNA = 21- 25 bp).
- Đều được tạo ra bởi Dicer (một endonuclease nhóm III). Dicer cắt các sợi dsRNA dài thành siRNA và cắt tiền chất của miRNA (pre-miRNA) với cấu trúc thân-thòng lọng không hoàn chỉnh thành miRNA.
- Các siRNA và miRNA mới hình thành đều ở dạng sợi kép và trước khi lắp ráp thành RISC, chúng phải tách ra thành sợi đơn.
- Hoạt động của siRNA và miRNA sau khi đã lắp ráp thành phức hợp siRISC và miRISC là giống nhau: đều nhằm để cắt các RNA sợi đơn mục tiêu.
Khác nhau
Mặc dù giống nhau về tính chất hóa học, sinh hóa và cơ chế hoạt động thì miRNA và siRNA vẫn có các điểm khác nhau cơ bản về nguồn gốc, đường hướng hình thành, vai trò sinh học và mức độ bảo thủ về mặt tiến hóa:
- miRNAs có nguồn gốc (được mã hóa) tại các vị trí genome khác biệt với gen mục tiêu của nó. Trái lại, siRNAs có nguồn gốc từ mRNAs, transposons, viruses.
- miRNAs được xử lý (cắt) từ các phân tử tiền chất (pre-miRNA) có độ dài và cấu trúc kẹp tóc khá xác định.. Trái lại, siRNAs được xử lý (cắt) từ các phân tử dsRNA dài hoặc các cấu trúc kẹp tóc khá dài.
- Từ một phân tử pre-miRNA sẽ chỉ tạo một loại phân tử miRNA. Trái lại, một phân tử dsRNA hoặc một cấu trúc kẹp tóc dsRNA sẽ tạo nhiều phân tử siRNA khác nhau. siRNA gồm 2 nhóm: (1) nhóm đối xứng với 2 đầu đều có tính ổn định tương đương nên cả 2 sợi đơn sau khi tách ra đều lắp ráp hiệu quả thành siRISC và (2) nhóm không đối xứng do chỉ có một đầu ổn định nên chỉ có 1 sợi lắp ráp hiệu quả thành siRISC. Trái lại, phần lớn miRNA thuộc nhóm không đối xứng => tạo chỉ 1 loại miRISC.
- Trình tự miRNA gần như luôn luôn bảo thủ ở các sinh vật có quan hệ với nhau; trái lại trình tự chuỗi siRNA hiếm khi bảo thủ giữa các sinh vật có quan hệ.
- RNA silencing thông qua miRNA là một cơ chế điều hòa gen, đảm bảo sự sinh trưởng và phát triển của sinh vật. Trái lại RNA silencing thông qua siRNA là (i) một cơ chế phòng thủ chống virus, (ii) ngăn chặn sự biểu hiện quá mức hoặc không cần thiết của các mRNA, và (iii) bảo vệ bộ gen khỏi bị gián đoạn bởi transposon
31.Ưu điểm công nghệ RNAi dùng miRNA
- Ít bị hiệu ứng không đặc hiệu (off-target). Đây là hiệu ứng không mong muốn khi RISC (thông qua liên kết không đặc hiệu của sRNA) cắt các phân tử không phải mRNA mục tiêu. Hiện nay, việc chọn các miRNA với trình tự không tương đồng với bộ gen ký chủ là hoàn toàn khả thi nếu bộ gen ký chủ đã được giải trình tự toàn bộ.
- Mức độ tương thích promoter RNA cao.
- An toàn với môi trường (an toàn sinh học) do giảm thiểu khả năng tái tổ hợp giữa virus tự nhiên và gen virus được chuyển vào trong cây/
32.cấu trúc chuyển gen tạo dsRNA tốt nhất chống virus (so sánh hiệu quả PTGS của PVY)
Đây là bước quan trọng nhất, quyết định thành công của một chương trình tạo giống kháng thông qua RNAi.
Có 3 cách để thiết kế cấu trúc chuyển gen virus
- Tạo cấu trúc chứa gen đồng nghĩa (sene).
- Tạo cấu trúc chứa gen ngược nghĩa (antisense).
- Tạo cấu trúc chứa gen theo cả 2 chiều đồng nghĩa và ngược nghĩa (cấu trúc tự bắt cặp).
Tất cả các loại cấu trúc trên muốn tạo tính kháng thì đều phải hình thành cấu trúc dsRNA trong cây chuyển gen. Có nhiều cách để có thể hình thành cấu trúc dsRNA của gen chuyển. Chẳng hạn, các cấu trúc đồng nghĩa và ngược nghĩa có thể (i) được chuyển đồng thời vào cây, hoặc (ii) được chuyển riêng biệt để tạo các dòng chứa gen đồng nghĩa hoặc ngược nghĩa. Các dòng này sẽ được lai để tạo dòng mang cả gen đồng nghĩa và ngược nghĩa, hoặc (iii) trong trường hợp cây chỉ được chuyển với cấu trúc đồng nghĩa hoặc ngược nghĩa thì RdRp của cây sẽ tạo ra các phân tử dsRNA từ các transcripts của gen được chuyển.
Tuy nhiên, chỉ loại cấu trúc tự bắt cặp đã được chứng tỏ là hiệu quả hơn cả trong việc tạo ra tính kháng. Hiện nay, hầu hết các nghiên cứu tạo tính kháng thông qua RNAi trên cây đều sử dụng các cấu trúc tự bắt cặp (hình).
Đối với cấu trúc tự bắt cặp, nếu 2 chuỗi gen virus bao quanh một chuỗi intron thì hiệu quả PTGS sẽ tăng lên rất nhiều
Hiệu quả PTGS với các cấu trúc chuyển gen potato virus Y (PVY) khác nhau. Hiệu quả được tính là % cây chuyển gen miễn nhiễm với PVY. Gen virus (PVY-pro) là NIa. Chuỗi loop là chuỗi gen unidA (GUS) dài ~800 nts. Intron là chuỗi intron của gen Pdk gene của cây Flaveria. (Smith et al., 2000).
33.Sơ đồ cấu trúc chuyển gen chống TYLCV (hiểu các vùng trên sơ đồ)
- Đoạn gen được lựa chọn là C1 (mã hóa protein Rep) với độ dài 727 bp nằm ở đầu 5’. Nguồn virus là một plasmid chứa toàn bộ bộ gen virus được clone từ trước.
- Đoạn gen ngược nghĩa được phân lập bằng PCR với cặp mồi A và B (bảng). Đoạn PCR ngược nghĩa được cắt kép với 2 RE là XhoI/BamHI và được nối vào vị trí tương ứng của vector pBPW8 để tạo ra cấu trúc pBPC1antisense
- Đoạn gen đồng nghĩa được phân lập bằng PCR với cặp mồi B và C (bảng). Đoạn PCR đồng nghĩa được cắt kép với 2 RE là KpnI/BamHI và được nối vào cấu trúc pBPC1antisense (cũng được cắt kép bằng KpnI/BamHI) để tạo ra cấu trúc pBPC1antisense-C1sene.
- Đoạn intron của Castor bean catalase được phân lập bằng cặp mồi D và E (bảng) từ plasmid pWJKK.IN-2 (của cơ quan CSIRO, Australia).
- Xử lý 2 đầu của đoạn intron được tạo ra bằng PCR với RE ClaI. Tương tự, cấu trúc pBPC1antisense-C1sene cũng được mở bằng RE ClaI.
- Nối đoạn intron (đã được cắt bằng ClaI) vào cấu trúc pBPC1antisense-C1sene (đã được mở bằng ClaI) để tạo cấu trúc pBPC1727antisen – intron – C1727sene. Cấu trúc này chứa cấu trúc kẹp tóc sau:
C1(727nt, antisense) – intron – C1 (727nt, sene)
- Một đọan 3.4 kb của cấu trúc pBPC1727antisen – intron – C1727sene chứa cả promotor CaMV 35S và terminator tNos được giải phóng bằng HindIII và nối vào vị trí tương ứng của một Biến nạp cấu trúc chuyển gen trên vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (chủng LBA4404)
34.Sơ đồ cattsett chuyển gen chống CMV (hiểu các vùng trên sơ đồ)
Cấu trúc chuyển gen chứa chuỗi miRNA nhằm vào gen b2 của CMV.
Cấu trúc được xây dựng dựa trên bộ khung một chuỗi pre-miRNA ký hiệu là miR171a của cây A. thaliana. Chuỗi pre-miRNA này nằm trên nhiễm sắc thể sô 2, 3 và 4 của cây A. thaliana với chuỗi mục tiêu là các mRNA mã hóa các yếu tố phiên mã liên quan đến ra rễ. Chuỗi pre-miRNA này đã được chứng minh từ trước là có tạo chuỗi miRNA trong cây.
Cấu trúc chuyển gen được xây dựng bằng cách thay thế chuỗi miRNA của miR171a bằng một chuỗi tương ứng vị trí 178 tới 198 của gen b2 của CMV. Chuỗi này dài 21 nt và có trình tự (5’-GUAGAUGGUUCGGAACUGAUA-3’).
Các bước để xây dựng cấu trúc chuyển gen tạo miRNA nhằm vào gen b2 của CMV bao gồm :
Thiết kế 2 mồi lớn tương ứng với phần 5’ (đồng nghĩa) và 3’ (ngược nghĩa) của chuỗi pre-miR171a. Mỗi mồi chứa 1 chuỗi 21 nt đặc hiệu gen 2b của CMV (phần in béo và gạch chân) tại vị trí vốn là trình tự chuỗi miRNA của pre-miR171a. Ngoài ra đầu 5’ của mỗi mồi cũng chứa thêm 1 chuỗi chứa vị trí BamHI và SacI để tạo điều kiện cho clone.
5’-CGGGATCCATGAGAGAGTCCCTTTGTAGATGGTACGGAACTTATAGATCTTACCTGACCACACACG-3’
5’-GCGAGCTCACGAGAGAGT-ACTGAGTAGATGGTTCGGAACTGATAGATAATCTAGAGAGAATAAT-3’
Dùng 2 mồi trên để chạy PCR với template là một plasmid chứa chuỗi pre-miR171a. Đoạn PCR hình thành là một cấu trúc lai gồm khung là pre-miR171a còn chuỗi miRNA là của gen b2 của CMV. Cấu trúc lai này chính là một pre-miRNA và được ký hiệu là miR2bprec
Đoạn PCR được xử lý 2 đầu với BamHI/SacI và được nối vào vị trí tương ứng của vector pBI221. Vector này có chứa chuỗi promotor CaMV 35S (35Spro) và terminator của nopaline synthase gene (NOS Ter). Kết quả tạo ra vector pBI-35S-miR2bprec chứa một cassette biểu hiện : 35S Pro - miR2bprec – NOS Ter.
Cassette biểu hiện được chuyển sang một vector song cực pCAMBIA 1300 để tạo ra vector p35S-miR2bprec. Chú ý là pCAMBIA 1300 chứa 1 marker chọn lọc là hygromycin phosphotransferase (hpt) dưới sự điề khiển của CaMV 35S.
Vector p35S-miR2bprec được biến nạp vào vi khuẩn A. tumerfaciens (chủng EH105
35.Các chỉ tiêu đánh giá cây chuyển gen chống CMV
Đánh giá cây chuyển gen được lây nhiễm CMV dựa trên triệu chứng
Triệu chứng biểu hiện được đánh theo thang phân cấp thứ tự gồm 5 cấp:
- Cấp 0: không triệu chứng.
- Cấp 1: khảm nhẹ chỉ trên 1 lá ngọn.
- Cấp 2: khảm nhẹ, biểu hiện trên hơn 2 lá.
- Cấp 3: khảm rõ ràng trên lá già hơn và biến dạng nhẹ trên 2 lá ngọn.
- Cấp 4: triệu chứng tương tự cấp 3 nhưng cây còi cọc.
- Cấp 5: lá biến dạng rõ ràng và cây còi cọc mạnh.
36.Nguyên lý của microarray
Nguyên lý của công nghệ microarray khá đơn giản: dựa vào lai hóa DNA:DNA ở mật độ cao. Microarray DNA (còn gọi là chip gen, chip DNA…) bao gồm một số lượng lớn các phân tử DNA (gọi là dò) được phân bố thành hàng trên một diện tích rất nhỏ của một giá đỡ (thường là lam kính). Các chuỗi cần phát hiện như mRNA, virus (gọi là mục tiêu) được gán nhãn với chất phát huỳnh quang. Sau khi được lai hóa với dò, các chuỗi mục tiêu được phát hiện và lượng hóa nhờ huỳnh quang được phát xạ bởi tia laser
37. Vật liệu phổ biến để tạo chip DNA
38.Nguyên lý tạo chíp DNA bằng kỹ thuật in quang
ü Dò: oligonucleotide ngắn với kích thước khoảng 20 nucleotide
ü Mật độ dò rất cao
ü Kiểm tra hàng chục ngàn gen
ü Bản quyền: Affimetrix
Ví dụ “chip gen” của công ty Affymetrix chứa chung bình 20 đoạn ngẫu nhiên có chiều dài 25 nucleotide của mỗi gen nghiên cứu.
39.Nguyên tắc và các bước nghiên cứu biểu hiện gen cây bị nhiễm bệnh (kỹ thuật gán nhãn kép)
Nghiên cứu biểu hiện gen “gene expression profiling”
Nguyên lý đằng sau “gene expression profiling” là ở chỗ một gen thường chỉ phiên mã (transcribed) đúng nơi (loại tế bào) và đúng lúc mà chức năng của nó yêu cầu. Về mặt kỹ thuật, mức độ biểu hiện của hàng chục ngàn gen tương ứng với một trạng thái sinh lý của một sinh vật có thể được phát hiện và lượng hóa chỉ với một lần thử microarray.
Do vậy “gene expression profiling” trong bệnh cây có thể được sử dụng để:
a) Phân tích sự tương tác giữa tác nhân gây bệnh và ký chủ qua thử microarray cả tác nhân gây bệnh và ký chủ.
b) Phân tích phản ứng phòng thủ cây. Ví dụ, dùng microarray, Schenk et al., (2000) đã phát hiện thấy thay đổi mức độ phiên mã của 2375 ETS của cây Arabidopsis sau khi được lây nhiễm với loại nấm không tương hợp là Alternaria brassicicola hoặc sau khi được xử lý với Salicylic acid (SA), methyl jasmonate (MJ) hay ethylene (các chất cảm ứng tính kháng tập nhiễm hệ thống SAR). Trong số này, 705 gen có mức độ biểu hiện >= 2.5 lần so với đối chứng (106 gen chưa hề được mô tả trước đó).
c) Chẩn đoán. Vì một “gene expression profile” phản ánh một trạng thái bệnh lý của cây bị bệnh do tác nhân sinh vật hoặc môi trường nên ngườ ta có thể dùng hồ sơ biểu hiện gen để chẩn đoán cả bệnh truyền nhiễm và bệnh không truyền nhiễm.
40.Khả năng ứng dụng microarray trong chẩn đoán virus
Do bản chất đa mục tiêu của microarray kết hợp với một số lượng lớn các tác nhân gây bệnh đã được giải trình tự toàn bộ hoặc từng phần nên microarray đang trở thành một công cụ chẩn đoán bệnh tuyệt vời.
Áp dụng ấn tượng nhất trong lĩnh vực chẩn đoán là công trình của Wang et al. (2002) với đối tượng là các virus gây bệnh trên người. Bộ gen của một họ virus hại người được chia thành các đoạn dài 70 nucleotides gối lên nhau khoảng 25 nucleotides. Sau khi so sánh chuỗi, các đoạn đặc hiệu cho họ và chi đã được lựa chọn. Bằng cách này, các tác giả đã thiết kế một microarray chứa 1600 chuỗi oligonucleotides dài 70 nucleotides được lấy từ khoảng 140 bộ gen virus riêng biệt bao gồm cả các virus DNA sợi đơn, sợi kép lẫn các virus RNA cực (+), cực (-). Các virus được phát hiện và xác định entero-, rhino-, adeno-, orthomyxo-, nido-, retro-, hepadna- and papillomaviruses..
Tương tự, microarrays cũng đã được dùng để phát hiện các virus gây bệnh cây. Một số ví dụ là microarrays để phát hiện và xác định các virus khoai tây (Boonham et al., 2003) như potexvirus (PVX) và 3 potyviruses (PVY, PVS, PVA) kể cả 2 chủng PVS (PVS-O, PVS-A) và 3 chủng PVY (PVYO, PVYN, PVYNTN). Các dò này được tạo ra bằng PCR có kích thước 700 - 1200 nucleotides. Kết quả lai hóa với cDNA virus được gán nhãn Cy3 cho thấy microarray này có thể phát hiện và xác định các virus ở mức loài và chủng (nếu mức tương đồng đoạn lai hóa nhỏ hơn 80%.
Ví dụ 2 là microarray cũng để phát hiện đồng thời nhiều virus khoai tây là Potato virus A (PVA), Potato virus S (PVS), Potato virus X (PVX), Potato virus Y (PVY), Potato mop top virus (PMTV) và Potato leaf roll virus (PLRV). Tuy nhiên, một điểm khác là cả chuỗi dò và chuỗi đích của một virus đều được tạo ra bằng cùng bộ mồi. Điều này tạo điều kiện để phát hiện PLRV và PMTV vì chúng không có chuỗi poly A ở đaauf 3’ của bộ gen (Bystricka et al., 2003)
Tương tự, Lee et al., (2003) đã phát triển một microarray để phát hiện và phân biệt 4 tobamoviruses nhiễm trên cây bầu bí là Cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV), Cucumber fruit mottle mosaic virus (CFMMV), Kyuri green mottle mosaic virus (KGMMV) and Zucchini green mottle mosaic virus (ZGMMV).
41.Đặc điểm mồi chung
Mồi chung là một mồi được thiết kế trên vùng bảo thủ. Nếu vùng bảo thủ là đồng nhất thì mồi chung sẽ chỉ là một chuỗi mồi duy nhất. Nếu vùng bảo thủ chứa các vị trí sai khác thì mồi chung thực chất là một hỗn hợp các mồi, mỗi mồi tương ứng với một sai khác nucleotide.
Trong thiết kế mồi chung, người ta sử dụng các mã suy biến tại các vị trí sai khác, ví dụ R là A hoặc G (số suy biến = 2); Y là C hoặc T (số suy biến bằng 2); N là A hoặc T hoặc G hoặc C (số suy biến bằng 4). Số sai khác nucleotide tại mỗi vị trí của mồi được gọi là các số suy biến. Tổng số mồi trong hỗn hợp sẽ bằng tích của tất cả các số suy biến tại mỗi vị trí. Để làm giảm số lượng mồi trong hỗn hợp, người ta thường sử dụng một nucleotide đặc biệt là inosine. Inosine có thể ghép cặp với bất kỳ nucleotide nào trong số 4 nucleotide A, T, G, C.
42.so sánh mồi chung mồi đặc hiệu
Mồi chung (universal/degenerate primers): được thiết kế trên các vùng bảo thủ cao, có khả năng phát hiện các đối tượng khác hẳn nhau (thường các đối tượng của một chi, một họ).
Mồi đặc hiệu (specific primers): được thiết kế trên các vùng có thể phân biệt được loài, thậm chí dưới loài như chủng/nòi/type sinh học…
43.Đặc điểm một mồi tốt
Độ dài mồi. Nên nằm trong khoảng 18-22 nts. Độ dài này đủ dài để đảm bảo tính đặc hiệu và đủ ngắn để mồi gắn đễ dàng vào khuôn
Hàm lượng GC. Số các gốc G và C nên nămg trong khoảng 40-60%.
Các chuỗi lặp. Mồi không nên chứa nhiều chuỗi lặp kép (ví dụ TATATATA) hoặc chuỗi lặp đơn (ví dụ TTTT) vì có thể gây ra hiện tượng bắt cặp nhầm (misprime). Trong một mồi, chỉ nên có tối đa 4 chuỗi lặp. Các chuỗi lặp cũng không nên xuất hiện nhiều lần trong 1 mồi
Độ ổn định đầu 3 ‘. Tận cùng đầu 3’ (khoảng 5 nts) không nên chứa toàn gốc G hoặc C vì có giá trị ΔG cao dễ dẫn tới bắt cặp không đặc hiệu vào khuôn. Trái lại nếu đầu 3’ chứa quá nhiều gốc T hoặc A sẽ khó bắt cặp.
Vùng thiết kế mồi của khuôn. vùng thiết kế mồi của khuôn không nên chứa quá nhiều cấu trúc thứ cấp. Nếu các cấu trúc thứ cấp này ổn định ở nhiệt độ gắn mồi thì mồi sẽ không thể bắt cặp được.
44.Đặc điểm kháng nguyên, kháng thể, epitope
Kháng nguyên thường là các đại phân tử chứa protein hoặc polysaccharide. Kháng nguyên phải có hai đặc tính quan trọng: (1) hoạt tính sinh miễn dịch tức khả năng kích thích động vật máu nóng hình thành kháng thể đặc hiệu và (2) tính đặc hiệu tức khả năng liên kết với kháng thể đặc hiệu tương ứng. Một số chất có trọng lượng phân tử thấp như các amino acid, một số loại polysaccharide... không có hoạt tính sinh miễn dich nhưng lại có khả năng liên kết với kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên có chứa các chất này. Các chất đó được gọi là bán kháng nguyên (hapten).
Trên bề mặt kháng nguyên có các vùng đặc biệt có chức năng cảm ứng hình thành kháng thể và là vị trí liên kết kháng thể. Các vùng này được gọi là các nhóm quyết định kháng nguyên (epitope).
Một nhóm quyết định kháng nguyên chỉ kích thích hệ miễn dịch của động vật máu nóng hình thành một dòng phân tử kháng thể. Kháng nguyên chứa một nhóm quyết định kháng nguyên gọi là kháng nguyên đơn giá, chứa nhiều nhóm quyết định kháng nguyên gọi là kháng nguyên đa giá.
Các epitope có thể được chia thành:
- epitope trình tự: chỉ phụ thuộc trình tự amino acid
- epitope hình thái: phụ thuộc vào cả cấu trúc không gian
- epitope liên tục: là một chuỗi amino acid liên tục
- epitope không liên tục: là các amino acid không liền nhau (trên chuỗi cấp 1) nhưng do sự gấp của protein nên xắp xếp gần nhau dẫn tới cùng nhau tạo thành 1 epitope
kháng thể là bất kỳ phân tử nào có khả năng liên kết đặc hiệu với kháng nguyên. Tuy nhiên, kháng thể sử dụng trong chẩn đoán bằng kỹ thuật huyết thanh học chính là các kháng thể dịch thể
Kháng thể dịch thể là các globulin miễn dịch (Immunoglobulin-Ig). Có 5 lớp Ig là IgG, IgM, IgA, IgD và IgE nhưng trong chẩn đoán huyết thanh học, thường chỉ sử dụng IgG.
45.Phân biệt kháng thể đơn dòng, đa dòng
Kháng thể đơn dòng (Monoclonal antibody (MAb)
- Là kháng thể được hình thành chỉ từ một dòng lympho bào B
- Nhận biết và liên kết với chỉ 1 epitope
- Sản xuất phức tạp
Kháng thể đa dòng (Polyclonal antibody (PAb)
- Là một hỗn hợp của các kháng thể đơn dòng
- Sản xuất đơn giản. Việc sản xuất chỉ bao gồm tiêm kháng nguyên (phân tử virus, protein virus, protein vi khuẩn, nấm…) vào động vật máu nóng (như thỏ, dê, chuột…) và thu kháng huyết thanh. Kháng huyết thanh sẽ chứa một hỗn hợp nhiều loại kháng thể, mỗi loại đặc hiệu cho 1 epitope.
46.Qui trình chung tạo kháng thể đơn dòng
1.1.3 Gây miễn dịch trên thỏ
- Sử dụng chuột cái, 8-10 tuần tuổi
- Gây miễn dịch trên thỏ 3 lần (ngày 0, 14, 21): tiêm 100 uL dịch protein (1-100 ug kháng nguyên) + 100 uL adjuvant hoàn toàn (complete adjuvant). Lượng kháng nguyên tiêm lần đầu gấp đôi lượng kháng nguyên tiêm ở các lần sau.
- Lấy máu và thu kháng huyết thanh (~100 uL) trước mỗi lần tiêm.
- Kiểm tra sự có mặt của kháng thể trong kháng huyết thanh = ELISA sau ngày 21. Giá trị ELISA nên tăng trong khoảng 100-1000 sau 21 ngày.
- Khi chuột đã hình thành đủ kháng thể (thường sau 3 lần tiêm, đôi khi sau 4 lần), tiêm tiếp kháng nguyên 3 lần (ngày 28, 29,30) nhưng không hòa với adjuvant.
- Thực hiện dung hợp vào ngày 31
1.1.4 Dung hợp (lai)
- Làm ấm các môi trường và Polyethylen glycol (PEG) 1500 (hãng Roche) tới 37 OC. Các môi trường gồm:
o Môi trường HAT (Hypoxanthine Aminopterin Thymidine), hãng Sigma
o Môi trường Hyb-SFM (Hybridsoma Serum-Free Medium). Đây là môi trường chứa insulin, transferrin và chất kháng sinh đỏ phenol) (hãng Invitrogen)
o Môi trường Hyb-SFM +10 % FBS (foetal bovine serum = huyết thanh bào thai bò). Môi trường này là môi trường nuôi cấy tế bào (hãng Invitrogen)
- Chuẩn bị tế bào myeloma. Tế bào myeloma dòng X63-Ag8.653 được nuôi cấy trong môi trường Hyb+10% FCS (foetal calf serum) khoảng 1 tuần trước khi dung hợp. Tế bào được nuôi cấy trong đĩa petri (loại 15 cm) chứa 60 mL môi trường nuôi cấy Hyb+10% FCS trong tủ ấm.
- Thu thập – tinh chiết tế bào lá lách chuột đã gây miễn dịch. Giết chuột và đặt trong cốc thủy tinh chứa ~200 mL Betadine 80% chứa 20% ethanol 70%. Giải phẫu trong điều kiện vô trùng để lấy lá lách chuột. Lá lách được chuyển sang đĩa Petri chứa 1 mL môi trường Hyb SFM + 10%FCS. Cắt lá lách thành các mảnh nhỏ và dùng panh vô trùng ép để giải phóng tế bào lá lách. Rửa tế bào + tàn dư với 2- 3 mL môi trường (~ 4 lần) và chuyển toàn bộ sang tube 50 mL. Để tube khoảng 1 phút để lắng tàn dư và hút dịch tế bào sang tube mới. Ly tâm tube 900-1000 rpm trong 5 phút. Loại bỏ dịch trên tủa và hòa cặn tế bào lá lách trong 20 mL đệm HYB-SFM + 10% FBS.
- Đếm tế bào lá lách (cả hòa loãng 1:10 và không hòa loãng).
- Đếm số tế bào myeloma X63 (số lượng yêu cầu = 1/2 số lượng tế bào lá lách).
- Trộn trực tiếp tế bào lá lách với tế bào X63
Dung hợp
- Ly tâm hỗn hợp tế bào 900-1000 rpm /5 phút.
- Rửa tế bào với 25 ml môi trường Hyb-SFM medium. Ly tâm, giữ lại cặn tế bào.
- Búng nhẹ ống ly tâm để tách rời tế bào. Cho từ từ1.5ml PEG (cho khoảng 3x108 tế bào hỗn hợp) vào thành ống, tốc độ khoảng 1 mL/phút (cho từ từ để tế bào khỏi bị phồng). Sau khi cho PEG xong, trộn đều ống bằng lắc nhẹ.
- Ủ ống ở 37 OC / 1 phút.
- Dùng pipets cho rất từ từ 20 mL môi trường Hyb-SFM (1mL / phút đầu tiên, 3 mL / phút thứ 2 và 16 mL/phút thứ 3).
- Ly tâm.
- Hoà cặn tế bào lai trong môi trường HAT và cho vào các đĩa nuôi cấy tế bào loại 24 giếng. Lượng cho là 2 mL /giếng với nồng độ 106 tế bào / giếng.
- Bọc các đĩa với màng Saran và ủ trong tủ định ôn với điều kiện 37°C, 5% CO2.
Dòng hóa
- Sau khi ủ khảng 10-14 ngày, các dòng tế bào có thể quan sát thấy bằng mắt và môi trường ở một số giếng bắt đầu chuyển màu vàng nhạt.
- Kiểm tra sự hình thành kháng thể bằng ELISA
- Ở các giêngs có phản ứng ELISA (+), chuyển từng dòng tế bào sang giếng của đĩa nuôi cấy loại 96 giếng chứa 150 uL môi trường
- Sau khoảng 3 ngày, thử tiếp ELISA cho từng clone
- Các clone + sẽ được nuôi cấy lần lượt trên môi trường HAT => HT => Hyb + 10%FCS.
1.1.5 Sản xuất
- Kháng thể có thể được sản xuất bằng 2 cách:
- Nuôi cấy các dòng tế bào lai trên môi trường nuôi cấy như Hyb-SFM => tạo số lượng ít
- Nuôi cấy trong cơ thể chuột bằng cách tiêm tế bào lai vào xoang bụng => tạ số lượng nhiều
47.Đặc điểm bản ELISA
- bằng nhựa (polystyrene), 96 giếng, liên kết không đặc hiệu các loại protein
48.Enzyme sử dụng trong ELISA
- nhiều loại, cần cơ chất tương ứng, phổ biến nhất là alkaline phosphatase (cơ chất tương ứng là NPP)
49.Phân biệt ELISA trực tiếp và gián tiếp
- Nhóm trực tiếp (direct ELISA): Kháng thể liên kết enzyme là kháng thể phát hiện kháng nguyên (ví dụ các kỹ thuật I, VIII và IX trong sơ đồ).
- Nhóm gián tiếp (indirect ELISA): Kháng thể liên kết enzyme không phải là kháng thể phát hiện kháng nguyên (ví dụ các kỹ thuật II, III, IV, V, VI, VI trong sơ đồ).
50.Trình tự DAS-ELISA và PTA-ELLSA
Kỹ thuật ELISA trực tiếp kiểu kẹp kép kháng thể (DAS-ELISA)
Cố định IgG đặc hiệu virus vào bản ELISA
Cố định dịch cây vào bản ELISA
Cố định IgG liên kết enzim:
Cố định chất nền và đánh giá kết quả
Phản ứng ELISA gián tiếp kiểu bẫy kháng nguyên trước (PTA-ELISA)
Cố định dịch cây vào bản ELISA
Cố định IgG thỏ đặc hiệu virus vào bản ELISA
Cố định IgG đặc hiệu IgG thỏ liên kết AP vào bản ELISA
Cố định chất nền vào bản ELISA
Bạn đang đọc truyện trên: Truyen2U.Pro